涎腺疾病

水通道蛋白-1，5在干燥综合征小鼠下颌下腺中的表达;：17β-雌二醇对涎腺黏液表皮样癌高转移细胞Mc3黏附、侵袭和移动力的影响;治疗角结膜干燥症自体颌下腺移植的血管处理;雌二醇对人涎腺腺样囊性癌细胞增殖和转移作用的研究;异丙肾上腺素对SD大鼠原代颌下腺细胞增殖的影响     

牵张力与雌激素对兔鼻软骨细胞增殖效应调节的初步研究

目的：探讨牵张力与雌激素对兔鼻软骨细胞增殖效应的影响。方法：1）采用MTT四唑盐比色法,检测不同剂量的17~β雌二醇（E2）（10^-12-10^-6mol/L）对第4代新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞增殖活性的影响。2）将第4代新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞在细胞膜式牵张力施加装置上培养,检测不同浓度17-β雌二醇（10^-10-10^-8mol/L）及5 kPa牵张力联合应用0、12 h后,对兔鼻软骨细胞增殖活性（PI值）的影响。结果：（1）10^-10-10^-8mol/L17-β雌二醇体外培养新西兰白兔兔鼻软骨细胞生长具有刺激作用,且呈剂量依赖性,最大效应浓度为10^-8mol/L,进一步增加E2浓度则刺激作用减弱。10^-6mol/L具有明显抑制性。（2）5 kPa牵张力联合17-β雌二醇培养较17-β雌二醇的单独作用具有更强的促兔鼻软骨细胞增殖作用。结论：牵张力与雌激素可以调节兔鼻软骨细胞增殖活性。     

17β-雌二醇对涎腺黏液表皮样癌高转移细胞M3SP4的作用

目的:研究17β雌二醇(E2)对涎腺黏液表皮样癌高转移细胞系M3SP4细胞的作用。方法:采用细胞记数法、MTT、软琼脂克隆形成法及相关癌基因免疫组织化学的方法研究17β雌二醇对M3SP4细胞的增殖和对VEGF、cerbB2、Ki67、P16的影响。结果:雌激素在10-10～10-5mol/L时对M3SP4有促进作用,其中在10-7mmol/L时对M3SP4的促增殖作用最显著,体外实验表明细胞群体倍增时间减少了10.8%,克隆形成率增加了225%,免疫组化显示VEGF、cerbB2、Ki67的表达增强,而P16的表达明显降低。体内实验,实验组裸鼠在每天给予0.0052mg/d的E2时,肿瘤细胞M3SP4的生长增加65%,转移增加了609%。VEGF、Ki67和cerbB2有较强表达,明显强于对照组;相反抑癌基因P16的表达较弱。结论:雌激素可刺激涎腺黏液表皮样癌M3SP4细胞的增殖和转移能力。     

高三尖杉酯碱、甲氧沙林对粘液表皮样癌Mc3的抑制作用

目的：研究高三尖杉酯碱(HHT)、甲氧沙林(8-MOP)以及二者联合作用于人涎腺粘液表皮样癌高转移细胞株Mc3，观察其生长抑制作用。方法：应用MTT检测法、细胞计数法、软琼脂克隆形成试验等方法观察Mc3细胞生长曲线、克隆形成率、细胞数与A值关系以及HHT及8-MOP单独或联合应用作用于：Mc3细胞的生长抑制作用。结果：Mc3、：MEC-1生长稳定，群体倍增时间分别为26．4h和30h。克隆形成率分别为14．6％和1．2％。HHT与8-MOP2种药物分别单独作用于Mc3细胞，在小剂量情况下对细胞杀伤作用较轻，随着药物浓度的增加，细胞生长明显抑制，其作用特点表现为明显的浓度依赖性。两种药物对Mc3细胞作用的IC50值分别为79．43和75980ng／ml，RAA值分别为20．14和1．7。浓度为1～320ng／ml的HHT分别与800、4000、20000ng／ml的8-MOP联合应用时HHT的CI50值分别为0．76、0．33和0．15，RAA则分别为25．36、31.92和160，显示了二者具有明显的协同抑制效应作用。结论：HHT及8-MOP联合应用方案，可有效抑制涎腺粘液表皮样癌高转移细胞的增殖。     

裸鼠体内原位移植法筛选粘液表皮样癌高转移细胞

目的：筛选高转移人涎腺粘液表皮样癌细胞。方法：用人涎腺粘液表皮样癌细胞Mc3经裸鼠涎腺移植、鼠间原位移植、细胞培养技术获取所需细胞,用相差显微镜、电子显微镜、细胞计数法、染色体显示法、流式细胞术、软琼脂克隆形成法以及癌细胞裸鼠尾静脉注射法研究其生物学特性。结果：经4次鼠间原位移植,肺转移率为3／10。取转移灶行细胞培养,获得形态均一、生长旺盛的上皮样细胞,命名为M3SP4。M3SP4细胞所致肺肿瘤显示粘液表皮样癌组织学特征,细胞染色体为亚二倍体,仍保持人类染色体形态。M3SP4与Mc3形态相似,群体倍增时间（h）分别为23.9和25.9,S期细胞（％）分别占细胞周期26.8和15.3,克隆形成率（％）分别为54.6和30.2,经尾静脉注射后M3SP4细胞引起的肺转移结节比Mc3多35％。结论：M3SP4是转移力强于Mc3的人涎腺粘液表皮样癌细胞系,Mc3细胞经裸鼠涎腺移植、鼠间原位移植后转移力有所提高。     

17-β雌二醇对人粘液表皮样癌Mc3细胞增殖的影响

目的 :研究 17-β雌二醇 (E2 )对体外培养的人粘液表皮样癌Mc3细胞增殖的调节作用。方法 :不同浓度、时间的E2 处理Mc3细胞 ,采用细胞计数、克隆形成测定、流式细胞术、免疫组织化学染色等方法 ,检测E2 对人粘液表皮样癌Mc3细胞系细胞群体倍增时间、克隆形成率、细胞周期分布以及对PCNA、Bcl -2阳性表达的影响。结果 :对照组E2 浓度为 10 -9、10 -8、10 -7mol/L时 ,其细胞群体倍增时间分别为 :3 6.0h、2 7.9h、2 8.8h、2 5 .7h ;细胞克隆形成率分别为 :13 .7%、18.1%、17.6%、2 0 .8% ;PCNA的阳性表达率分别为 :62 %、78%、74%、98% ;Bcl-2的阳性表达率分别为 :48%、82 %、77%、93 %。流式细胞术检查结果显示 10 -7mol/L的E2 处理 12、18、2 4h后 ,细胞周期中S期细胞所占比例分别为 :11.3 %、7.0 %、46.7%。结论 :一定浓度的雌激素具有促进细胞G1/S期转换 ,增加S期细胞数量 ,加速DNA合成 ,从而促进细胞增殖。     

裸鼠脊髓转移灶粘液表皮样癌细胞系Ms的建立及生物学特性

目的：建立Mc3细胞的脏器转移细胞系。方法：采用瘤细胞尾静脉注射法、组织块细胞培养法．从裸鼠体内获得Mc3细胞系脊髓转移细胞亚系。用染色体最示、细胞形态及细胞致瘤性观察证明其性质；用细胞生长曲线、流式细胞仪测定增值速度。结果：从50只受试课鼠中获得一只截瘫的裸鼠．取其脊髓组织行原代及传代培养获得细胞并建立细胞系．传代50次以上．生长稳定．倍增时间为13 h．s期细胞占22．7％．染色体众数为61，保持人类染色体形态、细胞形态与其母细胞相似．相差显微镜观察活细胞晕”铺路石”样外观。裸鼠肺内转移肿瘤组织切片显示为粘液表皮样癌．将该细胞命名为Ms。结论：Ms细胞系是Mc3细胞系在裸鼠体内的脊髓转移细胞亚系．其生物学性质与Me3细胞小不同     

雌二醇对人涎腺腺样囊性癌细胞增殖和转移作用的研究

目的根据雌二醇(E2)临床用药在体内的药物浓度,探讨E2对人涎腺腺样囊性癌细胞(SAcc83)增殖和转移的影响。方法通过MTT法、细胞分裂指数、流式细胞仪等方法研究E2对SAcc83细胞增殖的影响;通过鸡胚心侵袭实验研究E2对SAcc83细胞的转移影响情况;通过对去势的雌裸鼠尾静脉注射方法建立动物转移模型和皮下致瘤实验,研究E2在动物体内对SAcc83的增殖和转移能力的影响。结果1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L的E2对SAcc83均有促增殖作用,其中10-7mol/L的E2作用最显著,作用1、2、3d时细胞分裂指数分别增加了33.3%,40.9%,17.8%,作用12、18、24h时S期细胞分别增加了12.3%,3.3%和9.7%。裸鼠皮下致瘤性实验中每只鼠每天皮下注射0.2ml9.55×10-5mol/LE2,注射10d,试验组肿瘤比对照组增加了24.8%。裸鼠肺转移实验中试验组裸鼠用药42d后,肺转移结节形成率增加了41.2%。结论10-7mol/L的E2对SAcc83细胞有明显的促增殖和转移作用,提示这类雌激素应在严密监控下使用。     

肿瘤干细胞在腺样囊性癌细胞系增殖和分化中的作用

目的探讨腺样囊性癌细胞（adenoid cystic carcinoma cell，ACC）系中肿瘤干细胞的存在依据。方法采用单细胞体外培养法、免疫组化染色、免疫磁珠分离技术和动物实验等方法，分析常规培养的和经分离分群的不同细胞表型的ACC-2的体外增殖、分化特点和裸鼠体内成瘤能力的差异。结果体外培养至第8天，ACC-2单细胞仅有4．5％分裂、增殖，并非全部分裂。CD44^＋-CD24^-亚群占所有ACC-2细胞的8．1％，其中仅有25．71％的细胞长期存活和持续分裂。CD44^-和CD44^＋-CD24^＋细胞在体外培养条件下均无长期存活能力。不同表型的ACC-2体外单细胞培养实验发现，CD44^＋发生分裂的比例为8．4％，CD44^＋-CD24^-肿瘤细胞发生分裂的比例为14．7％，CD44^-和CD44^＋-CD24^＋细胞未发生分裂。裸鼠成瘤实验显示，CD44^＋-CD24^-的成瘤最低接种细胞数为1×10^3个／L，常规ACC-2最低成瘤细胞数为1×10^5个／L，CD44^-和CD44^＋-CD24^＋细胞则均无成瘤能力。免疫组化染色证实，CD44^＋-CD24^-肿瘤细胞具有分化成其他表型肿瘤细胞的能力。结论细胞表面抗原为CD44^＋-CD24^-的肿瘤细胞仅占ACC-2肿瘤细胞的极少部分，这些细胞具有极强的增殖能力和分化为其他表型肿瘤细胞的能力。ACC-2肿瘤细胞的增殖和成瘤能力源于CD44^＋-CD24^-ACC-2细胞亚群。ACC-2中存在肿瘤干细胞，而CD44^＋-CD24^-是ACC-2肿瘤干细胞必须兼备的表面标志。     

染料木黄酮对大鼠颅盖骨骨吸收活性的作用

目的 :体外观察染料木黄酮 (genistein)对颅盖骨骨吸收活性的作用。方法 :分离乳鼠颅盖骨 ,分别加入 0、10 -8和 10 -6mol/L的染料木黄酮 ,并以 10 -9mol/L的 17β -雌二醇 (17βE2 )为对照 ,检测培养液上清中Ca2 + 含量和酸性磷酸酶活性 ,以评价染料木黄酮对颅盖骨骨吸收活性的作用。结果 :10 -8和 10 -6mol/L染料木黄酮使培养液上清中Ca2 + 含量下降 ,吸收指数 <1.0。 10 -9mol/L 17βE2 的吸收指数介于 10 -8与 10 -6mol/L染料木黄酮之间。酸性磷酸酶活性在各组之间无差异。结论 :染料木黄酮抑制大鼠器官培养中颅盖骨的骨吸收活性     

六亚甲基二乙酰胺对MEC-1细胞体外粘附、移动和侵袭的影响

目的 研究分化诱导剂六亚基二乙酰胺（ＨＭＢＡ）对人粘液表皮样癌细胞系ＭＥＣ－１体外粘附、移动和侵袭的影响。方法 用２ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＭＢＡ体外诱导培养ＭＥＣ－１细胞,用ＭＴＴ（ｔｈｉａｚａｌｙｌ ｂｌｕｅ,噻唑蓝）比色法测定细胞在重构基底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌ上的粘附,用Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＰＣＦ培养系统测定细胞的移动性和侵袭性。结果 ＨＭＢＡ诱导的ＭＥＣ－１细胞在３０ｍｉｎ和９０ｍｉｎ粘附实验中的粘     

PTEN基因联合多西环素对黏液表皮样癌细胞侵袭的抑制作用

目的：探讨PTEN抑癌基因联合多西环素对高转移性涎腺黏液表皮样癌细胞系体外粘附、迁移和侵袭的影响。方法：用脂质体将野生型PTEN基因导入人黏液表皮样癌细胞系,再用10mg/L多西环素处理细胞3d,采用MTT比色法测定细胞粘附,划伤愈合实验测定细胞迁移,趋化Transwell法测定细胞侵袭。结果：PTEN基因转染和Dox分别处理黏液表皮样癌细胞导致癌细胞粘附、迁移和侵袭受到不同程度的抑制。PTEN基因转染联合多西环素对癌细胞的抑制作用更强,癌细胞在Metrigel和Fn基质上的粘附抑制率分别为37.4%和70.6%;癌细胞迁移抑制率为60.9%;癌细胞侵袭抑制率为65.1%。结论：PTEN抑癌基因联合多西环素对黏液表皮样癌细胞系体外粘附、迁移和侵袭具有显著的协同抑制效应。     

趋化因子受体CXCR4 shRNA真核表达载体的构建

目的：构建趋化因子受体（CXCR4）特异的RNA干扰质粒载体。方法：根据GenBank数据库提供的CXCR4基因核苷酸序列,选择设计能转录短发夹状RNA（short hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列,并与pWH1质粒载体连接,用酶切的方法进行鉴定;将构建成功的特异性表达载体（pWH1-CXCR4）稳定转染至人涎腺黏液表皮样癌Mc3细胞系,并应用RT-PCR和流式细胞术对细胞CXCR4的表达进行检测。结果：与Mc3细胞和转染空白质粒pWH1 Mc3细胞相比,转染pWH1-CXCR4表达载体的Mc3细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达明显降低。结论：构建的CXCR4特异性shRNA表达载体可有效的沉默CXCR4基因,为进一步研究CX-CR4表达对涎腺黏液表皮样癌增殖和转移的意义及治疗涎腺黏液表皮样癌奠定了基础。     

TGF‐β1 regulates the invasive and metastatic potential of mucoepidermoid carcinoma cells

J Oral Pathol Med (2011) 40 : 762–768 Background: Patients with mucoepidermoid carcinoma exhibit poor long‐term prognosis because of the lack of therapeutic strategies that effectively block tumor progression. We have previously characterized the Ms cells as a highly metastatic mucoepidermoid carcinoma cell line that expresses high levels of transforming growth factor β1 (TGF‐β1). Here, we studied the effect of suppressing TGF‐β1 by RNA silencing on the invasive and metastatic potential of mucoepidermoid carcinoma. Methods: Cell motility, substratum adhesion, and transmembrane invasion were estimated by migration, matrigel adhesion, and matrigel invasion assay. Matrix metalloproteinase (MMP)‐2 and MMP‐9 activity were determined using gelatin gel zymography. Balb/c nu/nu nude mice lung metastatic model was used to test the metastatic ability of the Ms cells. Lung metastatic tumors were experimentally induced by mice tail vein inoculation of cancer cells. Results: TGF‐β1 silencing inhibits cell motility, substratum adhesion, and transmembrane invasion. In vivo, a significant decrease in lung metastasis was observed when mice received tail vein injections of TGF‐β1‐silenced mucoepidermoid carcinoma cells, as compared to controls. Conclusion: These results unveil a critical role for TGF‐β1 in the progression of mucoepidermoid carcinomas and suggest that patients with this malignancy may benefit from therapeutic inhibition of the effectors of the TGF‐β1 pathway.     

Dnmt1和Dnmt3b在唾液腺黏液表皮样癌中的表达及意义

目的： 探讨DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase, Dnmt）在唾液腺黏液表皮样癌（mucoepidermoid carcinoma,MEC）中的表达及意义。方法： 选取2010 年1 月—2013 年9 月间中国医科大学附属盛京医院口腔颌面外科手术切除的唾液腺术后的标本43例,正常唾液腺组织17例,应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测正常组织及MEC组织中Dnmt1和Dnmt3b 的表达。采用SPSS22.0软件包对数据进行统计学分析。结果： Dnmt1在MEC组织中的阳性表达率为37.21%,与正常唾液腺组织的17.65%相比,差异无显著性（P>0.05）;Dnmt3b在MEC组织中的阳性表达率为83.72%,显著高于正常唾液腺组织的11.76%（P<0.01）;但两者的高表达与临床病理参数之间无显著相关性（P>0.05）。结论： Dnmt3b在唾液腺MEC 的发生中可能发挥一定作用。     

PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响

目的　探讨外源野生型PTEN抑癌基因对人高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭特性的影响。方法　用脂质体介导方法将PTEN抑癌基因导入M3SP2细胞系 (M3SP2 -PTEN细胞 ) ,转染空载体的细胞系作为对照(M3SP2 -pBp细胞 ) ,分别用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法、细胞迁移试验及细胞侵袭试验测定M3SP2 -PTEN细胞和M3SP2 -pBp细胞体外黏附、迁移和侵袭能力。结果　M3SP2 -PTEN细胞在Metrigel和Fn基质上黏附数量减少 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 1) ,黏附抑制率分别为 34 3%和 4 9 4 %。M3SP2 -PTEN细胞在Matrigel基质上迁移距离小 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,迁移抑制率为 2 6 0 %。M3SP2 -PTEN细胞体外侵袭细胞数量减少 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 1) ,侵袭抑制率为 31 4 %。结论　外源性PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭具有抑制作用。     

生存素基因诱导人黏液表皮样癌细胞凋亡的实验研究

目的 研究生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞的生长抑制效应及可能的作用机制,探讨生存素基因作为黏液表皮样癌基因治疗靶点的可行性.方法 设计合成靶向生存素特异性ASODN,转染Mc3细胞.将转染的Mc3细胞分为4组:空白对照组、脂质体转染组、生存素正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide,SODN)转染组、生存素ASODN转染组.转染后24、48及72 h倒置显微镜观察Mc3细胞形态学变化,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察转染前后对细胞增殖的影响,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法分析细胞凋亡指数,半定量反转录聚合酶链反应分别检测生存素mRNA的表达.结果 生存素ASODN转染组的Mc3细胞数量明显少于其他组,脱壁悬浮细胞明显增多,可见典型凋亡改变,并呈时间依赖性.生存素ASODN转染组Mc3细胞G1～G0期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,Mc3细胞的凋亡率在转染后24、48及72 h分别为12.96%、14.43%及22.69%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN对Mc3细胞增殖抑制率分别为22.35%、39.04%、43.46%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN转染组在细胞转染后24、48及72 h Mc3的凋亡指数分别为11.038%、12.172%及18.900%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN转染组Mc3细胞生存素mRNA在24、48及72 h的相对表达量分别为0.739±0.008、0.668±0.007、0.500±0.006,相对抑制率分别为18.21%、26.06%、44.82%,明显低于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.01).结论 生存素ASODN可抑制人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3的生长增殖,诱导其凋亡,同时亦可抑制Mc3细胞生存素mRNA的表达,并呈时间依赖性.生存素可作为黏液表皮样癌基因治疗研究的一个靶点.     

Nerve growth factor and tyrosine kinase A in human salivary adenoid cystic carcinoma: expression patterns and effects on in vitro invasive behavior.

PURPOSE: Perineural invasion is a frequent occurrence in salivary adenoid cystic carcinoma (ACC) and may prevent complete surgical resection. Studies have indicated that nerve growth factor (NGF) and its high-affinity receptor tyrosine kinase A (TrkA) may play a role in perineural invasion in several malignancies in which perineural invasion is observed. The present study was conducted to investigate the expression of NGF and TrkA in salivary ACC and to examine the effects of NGF on adhesion, migration and invasion capacities of a salivary ACC cell line (SACC-83) in vitro. PATIENTS AND METHODS: Expression of NGF and TrkA was explored using immunohistochemistry in paraffin-embedded tissues of 32 cases of salivary ACC. The effects of NGF on in vitro adhesion, migration, and invasion capacities of the SACC-83 cell line were examined using an MTT assay and a modified Boyden chamber assay respectively. RESULTS: In ACC specimens, 31 (96.9%) and 32 (100%) tumors showed immunoreactivity for NGF and TrkA respectively. Significant correlations were found between NGF/TrkA expression levels and perineural invasion (P < .05). In cell adhesion assay, the percent adherences of SACC-83 cells co-cultured with 25 ng/ml NGF at 1.5 hours and 5, 25 ng/ml NGF at 6 hours were significantly higher than that co-cultured with 0 ng/ml NGF (P < .05). However, high concentration of NGF (500 ng/ml) resulted in a significant inhibition of invasion (P < .05). CONCLUSION: Overexpression of NGF and TrkA in human salivary ACC tissues may constitute a reason for perineural invasion in salivary ACC.