鼠疫菌纤溶酶原激活因子的分离纯化

目的 建立从人工培养的鼠疫菌中分离和纯化纤溶酶原激活因子(Plasminogen activator,Pla)的方法.方法 分别用超声破碎、尿素提取与硫酸铵盐析相结合的方法(简称超声法、尿素法)提取Pla,并分别用离子交换、凝胶过滤两步层析相结合的高效液相色谱和制备电泳纯化Pla,对提取、纯化的Pla进行纤溶酶原激活剂活性检测.结果 鼠疫菌超声破碎上清50%～60%饱和硫酸铵沉淀和尿素浸渍菌粉上清0～10%饱和硫酸铵沉淀,均获得了3条蛋白带[相对分子质量(Mr)约31×103、35×103、37×103].纤溶酶原激活剂活性检测两种方法获得蛋白的溶圈直径分别为6.5、7.2 mm.用高效液相色谱纯化的Pla主要由Mr约31×103、35×1033、37×103的3条蛋白带组成,纤溶酶原激活剂活性检测溶圈直径为5.0 mm.制备电泳纯化的Pla主要由Mr约31×103、35×103、37×103的3条蛋白带组成.条带所在位置还有其他一些低浓度蛋白存在,纤溶酶原激活剂活性检测无溶圈出现.结论 超声法和尿素法可以提取到Pla,后者经高效液相色谱和制备电泳可以达到基本纯化.     

应用羟基磷灰石层析分离纯化鼠疫菌Pla蛋白的研究

目的应用CHT陶瓷羟基磷灰石层析柱分离纯化鼠疫耶尔森氏菌纤溶酶原激活因子（Pla）。方法优化层析条件,对采用超声破碎结合硫酸铵盐析得到的Pla粗提样品进行纯化,收集纯化中各洗脱峰样品,进行SDS-PAGE。结果上样缓冲液中添加钙离子,可促进Pla与层析柱的结合,经纯化后的Pla,去除了大部分杂蛋白,得到主要由相对分子质量约为31×103、35×103、37×103 Da和3条蛋白带为主的Pla,经软件分析计算,占蛋白总量约80%。结论 CHT陶瓷羟基磷灰石层析能实现对Pla的基本纯化。     

鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白的分离纯化与质谱分析

目的建立一种从鼠疫耶尔森氏菌疫苗株EV76中分离纯化纤维蛋白酶原激活因子（Pla）的方法。方法采用超声破碎与硫酸铵盐析结合的方法初步提取Pla,经CHT陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化,所获取的Pla进行质谱分析及Western blot实验。结果菌悬液超声破碎后上清以0~10%饱和硫酸铵沉淀,获得含有相对分子质量（Mr）约为31 000、35 000、37 000的3条Pla蛋白带,约占蛋白总量33%;CHT柱层析后,3条带约占蛋白总量80%。经质谱分析,在Mr约为31 000、35 000的条带中含有Pla,Pla单克隆抗体能特异性地识别该蛋白。结论采用超声破碎结合硫酸铵盐析的方法可从鼠疫菌中提取Pla,CHT柱层析可达到基本纯化,获得的样品经质谱分析和Western blot实验证实为Pla蛋白。     

家蝇幼虫分泌物抗菌组分的抗菌效果观察及筛选

目的筛选家蝇幼虫分泌物中的抗菌组分并测定其抗菌活性。方法用盐析、凝胶过滤层析、反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化分泌物中抗菌蛋白肽,以大肠埃希菌为指示菌种,采用平板滤纸片法检测抗菌活性,并观察其对金黄色葡萄球菌等多种细菌的抗菌活性。结果经50%~80%硫酸铵盐析沉淀、Sephadex G-100、G-50凝胶过滤柱层析分离得到一活性峰,该活性峰对大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌等细菌显示较强的抗菌作用,进一步用反相高效液相色谱纯化,该活性峰由3个活性组分构成。结论家蝇幼虫分泌物中含有3个抗菌组分,对多种革兰氏阳性及阴性菌具有较强的抗菌活性。     

日本血吸虫SIEA28kDa分子抗原的二维凝胶电泳分析

目的分析鉴定日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原(SIEA)28kDa抗原组分.方法用高效液相离子交换法对电泳纯SIEA28kDa抗原组分进一步分离纯化,对获得的色谱纯SIEA28kDa抗原组分进行二维凝胶电泳分析.结果SIEA经双向凝胶电泳分离、银染后获得的SIEA-2D图谱蛋白斑点以pI 3～7和Mw14～66 kDa范围最多.进一步经图象采集、PDQuest 2D软件分析SIEA双向电泳图谱,计算在相同的设定值条件下获取的蛋白质斑点数,测得SIEA-2D电泳图谱平均为(948±89)个蛋白质斑点数.电泳纯SIEA28kDa抗原组分用高效液相离子交换法纯化后,280、220 nm波长色谱图均为一个两侧对称、光滑的高峰曲线,色谱洗脱液对其活性光密度图也为一个两侧对称、光滑的高峰曲线.二维凝胶电泳银染色可见一个显色饱和度高的蛋白质圆斑,免疫印迹分析为一个显色饱和度高的单一圆斑.结论色谱纯SIEA28kDa抗原组分为单一分子,其等电点为5.7.     

约氏疟原虫保护性抗原快速蛋白液相色谱法纯化及鉴定

目的：建立制备级纯化约氏疟原虫（Ｐ．ｙ．）保护性抗原的新方法。方法：应用快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ），将重度感染Ｐ．ｙ．的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠血液中提取的粗抗原，首先用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶色谱柱进行分离，收集活性组分，再用ＤＥＡＥ－４０ＨＲ阴离子交换色谱柱进一步纯化。结果：一次上样量约２００ｍｇ，可得到纯化抗原１４ｍｇ。经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）测定抗原纯度＞９０％，抗原分子量为５３ｋＤａ。结论：动物实验证明，该抗原具有很好的保护作用。该法操作比亲和色谱法简单，制备量大于亲和色谱法和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ），纯化效率和纯度与ＨＰＬＣ法相似，一次纯化周期仅需３ｈ，是Ｐ．ｙ．抗原纯化的高效方法。     

鼠疫耶尔森菌纤维蛋白溶解酶原激活因子蛋白及其特异性片段的原核表达

目的 重组表达鼠疫耶尔森菌纤维蛋白溶解酶原激活因子(Plasminogen activator,Pla)蛋白及其特异性片段并检测其免疫反应性.方法 以鼠疫EV76株为模板,PCR扩增pla、pla-c基因,并与质粒原核表达载体(prokaryotic expression vector,pET)32a(+)连接,将pET32a(+)-pla、pET32a(+)-pla-c分别转化E.coli BL21(DE3)诱导表达;产物经镍离子金属螯合亲和层析纯化,免疫印迹(Western blot)法鉴定其免疫反应性.结果 所表达的Pla蛋白相对分子质量(Mr)为52.8×103,以包涵体形式存在;Pla-c蛋白Mr为24.0×103,以可溶形式存在;这两个蛋白质均可与鼠疫免疫血清产生特异结合反应.结论 所表达的鼠疫菌Pla及其特异性片段具有免疫反应性,为辅助诊断鼠疫提供了选择.     

铜绿假单胞菌注射液对肺癌A549细胞自噬及PI3 K/Akt通路的影响

目的探究铜绿假单胞菌注射液(PA-MSHA)对肺癌A549细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的影响。方法体外培养人肺癌A549细胞,随机分为空白对照组、LY294002组(加入20μmol/L LY294002),PA-MSHA干预组(加入0.5×10^9/mL、1.0×10^9/mL、2.0×10^9/mL PA-MSHA)。干预培养48 h后,MTT法检测各组细胞活性,平板克隆形成实验检测各组细胞增殖能力,透射电子显微镜观察各组细胞自噬情况,Western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ及PI3K/Akt通路相关蛋白PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表达。结果与空白对照组相比,LY294002组、0.5×10^9/mL、1.0×10^9/mL、2.0×10^9/mL PA-MSHA组细胞增殖抑制率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显著升高(P<0.05),自噬体个数增加,细胞克隆形成率、p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低(P<0.05);与LY294002组相比,0.5×10^9/mL、1.0×10^9/mL PA-MSHA组细胞增殖抑制率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显著降低(P<0.05),自噬体个数减少,细胞克隆形成率、p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著升高(P<0.05);与0.5×10^9/mL、1.0×10^9/mL PA-MSHA组相比,2.0×10^9/mL PA-MSHA组细胞增殖抑制率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显著升高(P<0.05),自噬体个数增加,细胞克隆形成率、p62、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论PA-MSHA可能通过调控PI3K/Akt信号通路,促进肺癌A549细胞自噬,抑制细胞增殖。     

类鼻疽伯克霍尔德菌TssE-6蛋白的原核表达和生物信息学分析北大核心CSCD

目的对类鼻疽伯克霍尔德菌TssE-6蛋白进行原核表达和蛋白纯化并进行生物信息学分析。方法采用BamHI和HindⅢ双酶切PCR纯化产物和pET30a(+)载体后连接,构建pET30a(+)-tssE-6重组质粒,转化到BL21大肠埃希菌中,利用1 mmol/L ITPG诱导,获得目的蛋白,进行10%SDS-PAGE、Western blot验证及Ni;柱纯化,利用生物学信息学软件对TssE-6蛋白进行预测和分析。结果成功对TssE-6蛋白进行了原核表达,经10%SDS-PAGE和Western blot验证,包含组氨酸标签的蛋白相对分子质量为24.2×10^(3)。TssE-6为不可溶包涵体蛋白,Ni;柱纯化蛋白的浓度为3.0 mg/ml,目的条带单一。TssE-6蛋白为含有170个氨基酸的不稳定亲水蛋白,带负电荷,分子式C_(851)H_(1349)N_(235)O_(255)S_(7),理论相对分子质量为19.176 91×10^(3),二级结构中α螺旋和无规卷曲分别占46.47%和40.00%。结论获得高纯度的重组TssE-6蛋白,预测该蛋白具有亲水性,为进一步研究TssE-6在T6SS中的功能以及新的检测标志物奠定了理论基础。     

日本血吸虫SIEA 26-28 ku抗原组分的紫外吸收光谱分析

目的了解SIEA 26-28 ku抗原分子的结构和功能以及生物学特性. 方法采用梯度聚丙烯酰胺凝胶制备电泳和高效液相色谱方法,分离纯化SIEA26-28 ku分子,并对其进行紫外吸收光谱分析鉴定. 结果通过紫外吸收光谱分析表明,SIEA26-28 ku抗原组分的紫外吸收光谱共有6个特征性蛋白吸收峰,分别在258、260、264.5、268、269.5和272 nm,部分吸收峰符合苯丙氨酸的吸收光谱. 结论高效液相色谱技术结合紫外吸收光谱分析,可为日本血吸虫SIEA 26-28 ku抗原组分结构和功能的进一步研究以及生物学特性分析提供重要信息.     

出血性大肠杆菌O157主要毒力因子单克隆抗体的制备

目的利用两种抗原制备针对出血性大肠杆菌EHECO157主要毒力因子的特异性单克隆抗体。方法分别用纯化融合蛋白Eae-Stx1/2B和EHECO157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)全菌免疫BALB/C小鼠,通过细胞融合和EHECO157标准株EDL933间接ELISA筛选稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果纯化融合蛋白免疫获得了2株单抗2H9和3B4,EHECO157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)免疫获得了1株单抗4H7。2H9、3B4和4H7亚类鉴定分别为lgG2b、lgM和lgM;纯化腹水ELISA效价分别为1∶1.28×105、1∶3.2×104、1∶6.4×104,亲和力常数分别为2.9×106、1.4×106、2.6×105。结论3株单克隆抗体均具有较高特异性,2H9效价和亲和力最高,可作为产志贺毒素EHECO157的检测抗体。     

抗人神经肽Y单克隆抗体的制备及鉴定

目的：建立抗人神经肽Y（NPY）的单克隆抗体细胞株。方法：用合成的hNPY多肽偶联KLH免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合,用ELISA法筛选出阳性克隆,经克隆化后建立抗人NPY杂交瘤细胞株,并对得到的单抗进行亚类、效价、纯度、亲和常数以及结合位点的测定和分析。结果：获得了3株稳定分泌抗hNPY单抗杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定分别为IgG3、IgG2b、IgG1,腹水效价为1：20万～1：200万,纯化抗体效价为0．05μg／ml-0．0005μg／ml,4A8抗体纯度达到95％以上,抗体亲和常数分别为5．27×10^6L／mol、3．39×10^6L／mol、1．05×10^7L／mol,不同单抗配对经时间分辨免疫荧光法检测结果提示3株单抗是针对不同抗原决定簇。结论：成功制备了3株抗hNPY单抗,为研究NPY及其抗体在脂肪移植及肥胖治疗中的机制和应用奠定基础。     

妊娠初期外周血白细胞计数与妊娠糖尿病发生的相关性研究

目的探讨妊娠初期外周血白细胞（WBC）计数与随后发生的妊娠糖尿病（GDM）的相关性。方法在妊娠初期检测孕妇的外周血WBC计数,将以后发生GDM的232例作为病例组,糖耐量正常的482名孕妇作为对照组,比较两组的wBC计数;再按WBC计数四分位,从而将研究对象分为四组,进行Logistic回归分析。结果病例组的妊娠初期外周血WBC计数明显高于对照组（8．56×10^9／L vs8．18×10^9／L,P〈0．01）。根据wBC计数四分位的结果,将研究对象分为四组,第一组WBC〈7．46×10^9／L,第二组wBC（7．46～8．33）×10^／L,第三组WBC（8．34～9．16）×10^9／L,第四组wBC≥9．17×10^9／L,相应的GDM的检出率分别为20．13％、34．61％、36．02％、39．61％。调整年龄、孕次、孕前BMI、SBP、DBP及糖尿病家族史等因素,行Logistic回归发现,相对于第一组而言,第二组、第三组及第四组发生GDM的危险分别是第一组的2．17倍（95％CI 1．25～3．77）、2．15倍（95％CI1．23～3．76）及2．59倍（95％CI1．49～4．50）。结论GDM患者妊娠初期WEC计数升高,慢性炎症可能参与了GDM的发生。     

羟基脲联合血小板去除术治疗老年原发性血小板增多症的临床疗效分析

目的观察羟基脲联合血小板去除术治疗老年原发性血小板增多症（ET）的临床疗效。方法根据有无临床症状,将28例老年ET患者分为有临床症状组及无临床症状组。所有患者均采用口服羟基脲（Hu）治疗,剂量为O．5～3g／d。对血小板计数〉1000×10^9／L者,确诊后即采用血小板去除术1～3次,并且于血小板去除术后开始接受羟基脲治疗。结果有临床症状组的患者发病时外周血血小板计数（1469．00±521．40）×10^9／L明显高于无临床症状组（892．00±302．10）×10^9／L（P〈0．01）。所有患者治疗前后血小板计数为（1023．00±606．30）VS（468．00±236．20）×10^9／L（P〈0．01）。所有患者接受治疗后CR16例（57．1％）,PR11例（39．3％）,NR1例（3．6％）。结论羟基脲联合血小板去除术治疗老年ET疗效明确,不良反应较少,耐受性良好。     

不同剂量乌司他丁在兔常温体外循环中对凝血和纤溶系统的影响

目的观察兔常温体外循环（extracorporeal circulation,ECC）前应用不同剂量乌司他丁对凝血和纤溶系统的影响。方法50只大耳白兔随机分成5组：乌司他丁1、2、3、4组（U1、U2、U3、U4组,每组n=10）和对照组（C组,n=10）。在ECC前分别给予U1、U2、U3、U4组乌司他丁1×10^4U·kg^-1、3×10^4U·kg^-1、5×10^4U·kg^-1、10×10^4U·kg^-1;C组给予等量生理盐水。ECC常温转流30min。分别记录ECC前、停机、停机后1h、2h和3h的血流动力学指标,测定活化部分凝血激酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白原（FIB）和D二聚体（D—D）。结果ECC后各组APlT较ECC前显著延长（P〈0．01）,同时间点U4组APTF较C组延长更为明显,其它组APTT与C组无统计学差异。各组胛较ECC前也显著延长（P〈0．01）,U4组胛在停机3h比C组延长（P〈0．05）,其它组PIt与C组无显著差异。ECC后各组血浆FIB含量较ECC前显著降低（P〈0．01）,同时间点U4组血浆FIB含量显著高于C组（P〈0．05）。ECC后各组血浆D—D浓度较ECC前显著升高（P〈0．01）,同时间点U4组D—D浓度明显低于C组（P〈0．01）。结论ECC前应用10×10^4U·kg^-1乌司他丁可减少ECC中凝血因子的消耗,抑制纤溶系统的过度激活。     

常用感染指标对失代偿性肝硬化患者预后作用分析

目的：通过临床常用感染指标探讨对失代偿性肝硬化患者预后预测作用。方法回顾性分析广州市南方医院2009年1月至2013年4月住院且病例资料及随访结果完整的失代偿期肝硬化357例,记录其入院及住院期间的WBC计数,中性粒细胞（NE）和淋巴细胞（LYM）比值,C反应蛋白（CRP）水平和血小板（PLT）计数。随访患者入院90 d后的生存情况。比较死亡与生存患者入院及住院期间各指标,Logistic分析确定死亡危险因素,用Kaplan-Meier分别绘制生存曲线,Log-Rank检验生存率差异。结果94例患者入院90 d 后死亡。死亡组 WBC 计数、NE 和LYM比值入院及住院期间各指标分别为：（8．45±0．55）×10^9/L、（72．33±1．16）％和（16．36±0．81）％、（9．17±0．64）×10^9/L 及（71．24±1．31）和（16．39±0．87）％、（13．55±0．83）×10^9/L及（83．38±0．92）和（22．68±0．84）％,（5．88±0．33）×10^9/L及（63．05±1．23）和（8．58±0．48）％,对比生存组相应各指标分别为：（6．84±0．26）×10^9/L 及（65．67±0．89）和（23．01±0．75）％、（6．05±0．21）×10^9/L 及（61．53±0．83）和（25．50±0．68）％、（9．09±0．36）×10^9/L 及（73．03±0．89）和（34．48±0．81）％、（4．20±0．14）×10^9/L 及（50．95±0．87）和（16．89±0．64）％,P 值均＜0．01。入院短期内CRP水平升高和PLT计数降低的幅度死亡组较生存组大。多变量分析结果住院期间临床上诊断感染,终末期肝病模型（MELD）评分和LYM比值基线值为90 d死亡的独立危险因素。住院时并发感染或LYM比值基线值低于17．4％的患者90 d生存率分别低于其他患者（均P＜0．01）。结论 WBC计数和NE、LYM比值,CRP 水平和PLT 计数的短期变化幅度与失代偿性肝硬化患者短期预后相关。     

抗旋毛虫副肌球蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的利用杂交瘤技术制备分泌抗重组旋毛虫副肌球蛋白N端抗原（rTsP3）的单克隆抗体（McAb）并进行鉴定。方法以rTsP3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,筛选分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,制备腹水并进行纯化,采用间接ELISA法测定培养细胞上清液及腹水中的McAb滴度、相对亲和力及抗体亚类,Western blot法鉴定抗体对抗原识别的特异性。结果获得了2株稳定分泌抗旋毛虫rTsP3的McAb杂交瘤细胞株,分泌的McAb分别为IgG2b亚类κ型和IgG1亚类κ型,亲和力常数分别为8.98×108mol/L和9.7×10^8mol/L,Western blot显示2株单抗均能识别旋毛虫成虫匀浆蛋白、rTsP3及重组副肌球蛋白（rTsPmy）。结论成功制备了抗旋毛虫rTsP3单克隆抗体,该单抗能识别旋毛虫副肌球蛋白抗原。     

高糖环境下美罗华对B淋巴细胞株Ramos增殖的抑制作用

目的探讨在高糖状态下美罗华对B淋巴细胞周期、增殖和凋亡的影响。方法体外培养人B淋巴细胞株Ramos,将细胞分别以单纯5．5、10．0、15．0、25．0mmol/L葡萄糖培养或另外分别加入10mg／L美罗华培养,即分为葡萄糖组和美罗华组。以上两组培养3—7d,检测细胞增殖、凋亡及其周期情况。细胞增殖和活性以台盼蓝染色法测定。细胞凋亡和周期采用流式细胞技术检测。两组间数据比较采用配对t检验。结果5．5、10．0、15．0、25．0mmol/L葡萄糖组B淋巴细胞数量分别为（1．96±0．41）×10^6、（3．49±0．51）×10^6、（3．44±0．67）×10^6、（3．04±0．52）×10^6,凋亡率分别为5．0％±0．9％、4．0％±0．8％、6．2％±1．8％、7．6％±1．3％,S期比例分别为32％±6％、41％±8％、40％±7％、36％±6％;美罗华组细胞数量分别为（1．23±0．23）×10^6、（1．52±0．29）×10^6、（1．38±0．23）××10^6、（1．06±0．23）×10^6,细胞凋亡率则分别23．1％±3．2％、21．2％±4．2％、24．4％±4．8％、26．9％±6．0％,S期细胞比例则分别22％±4％、28％±5％、26％±4％、20％±5％。与葡萄糖组比较,美罗华组B细胞增殖在不同糖浓度亚组均显著减少（t=9．19、5．52、9．75、14．22,均P〈0．01）,细胞凋亡率显著增加（t：16．62、12．51、11．53、9．12,均P〈0．01）,S期细胞比率显著减少（t=5．87、5．19、9．91、7．73,均P〈0．01）。两组细胞增殖数量和S期比率均在10．0mmol/L葡萄糖时最高;两组细胞凋亡率均在25．0mmol/L葡萄糖时最多。结论美罗华通过抑制细胞周期以及促进细胞凋亡实现对B淋巴细胞增殖的抑制作用,其抑制作用在高糖状态下更为明显。