人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋酶—2基因的克隆与鉴定

目的：获得人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2（MASP-2）编码区基因。方法：采用RT-巢式PCR技术从人胎肝组织总RNA扩增目的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体,酶切图谱分析和测序鉴定。结果：获得了编码含信号顺序的MASP-2肽链全长cDNA,将其与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌TG1,建立了MASP-2的重组克隆。酶切图谱与微机分析结果无异序列分析表明,与报道的人MASP-2cDNA序列一致。结论：成功克隆了人MASP-2基因,为深入研究补体凝集素途径的激活机制和甘露聚糖结合凝集素基因突变引起免疫缺损的发病机制奠定了基础。     

人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2C端基因的克隆与鉴定

目的:获得人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2(MASP-2)C端编码基因,并表达人MASP-2 C端片段,为制备单克隆抗体及应用于临床相关疾病的检测奠定分子学基础.方法:采用RT-PCR技术从人胎肝组织总RNA中扩增人MASP-2 C端的cDNA,克隆入pGEX-6p-2表达载体,酶切图谱分析和序列分析鉴定.结果...     

甘露聚糖结合凝集素基因多态性与毛细支气管炎的相关性研究

目的 探讨甘露聚糖结合凝集素(MBL)与毛细支气管炎是否具有相关性.方法 用ELISA法定量检测50例病例组与50例对照组MBL的血浆水平(ng/ml),并用聚合酶链反应、DNA序列测定法分析其MBL基因第1外显子第52、54、57位密码子的碱基序列.结果 (1)甘露聚糖结合凝集素GTC等位基因频率约为0.135,未见52和57位密码子的点突变;(2)比较病例组、对照组的GTC等位基因频率、血浆水平差异均无统计学意义.结论 未发现MBL的基因多态性与毛细支气管炎的易感性有相关性.     

甘露聚糖结合凝集素的生物学功能及其临床意义

甘露聚糖结合凝集素 (MBL)是一种肝源性的血清蛋白 ,属Ca2 依赖型凝集素家族成员 ,在天然免疫中起重要作用。MBL具有调理功能 ,可选择性结合表面富含甘露寡糖的病原体 ,既可通过MBL途径活化补体 ,也可特异性结合细胞表面受体活化巨噬细胞。已发现MBL基因突变可致血清MBL水平低下和功能缺损。MBL缺损使个体易患某些感染性疾病和自身免疫病。     

人血浆中MBL-MASP复合物的纯化与分离

目的从人血浆中分离纯化甘露聚糖结合凝集素(MBL)和MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASP)。方法用非活化Sepharose 4B两步亲和层析纯化MBL-MASP复合物．再以Sephacryl S-300柱凝胶过滤将MBL和MASP分离。在纯化MBL—MASP复合物的整个过程中，除凝胶过滤缓冲液外，均加入丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟(PMSF)和金属蛋白酶抑制剂1．10-邻二氮杂菲(1，10-phenanthroline)．并控制温度在4℃。结果获得高度纯化的MBL和酶原形式的MASP。SDS—PAGE和Western blotting表明所纯化的MBL相对分子质量为28000和32000肽链构成的功能性多聚体；配体结合测定和酵母菌凝集试验证实所纯化的MBL具有生物学活性：结论建立了一种比较简便的同时分离纯化MBL和MASP酶原的方法。     

Bal b/c小鼠甘露聚糖结合凝集素-C基因的克隆与鉴定

目的获得小鼠甘露聚糖结合凝集素-C(MBL-C)基因的全长编码区cDNA。方法利用RT-PCR方法,从Balb/c小鼠的肝细胞中分离出MBL-C基因cDNA片段,将其克隆入pUC-T载体并测序,对基因结构及其与人MBL基因的同源性进行比较分析。结果扩增得到的Balb/c小鼠MBL-C基因cDNA全长735 bp,编码245个氨基酸残基,包含了完整的编码区基因序列。经核苷酸序列比较分析发现,扩增得到的Balb/c小鼠MBL-C基因与Genbank中发表的序列具有100%的同源性,与人的MBL基因的同源性为71.4%。结论成功地克隆到完整的Balb/c小鼠MBL-C编码区基因,为进一步在整体水平研究MBL分子的天然免疫功能提供了必要的条件。     

甘露聚糖结合凝集素阻遏人巨细胞病毒感染MD-DC细胞的研究

目的 探讨不同来源、不同浓度的甘露聚糖结合凝集素( MBL)阻遏人巨细胞病毒(HCMV)感染人外周血单个核细胞衍生出的DC细胞(MD-DC)的作用.方法 通过载体构建得到重组MBL(rMBL),通过血浆分离得到天然MBL(hMBL),先以不同浓度的hMBL/rMBL预处理MD-DC 0.5h,再以HCMV感染MD-DC...     

甘露聚糖结合凝集素(MBL)的临床研究进展

1968年Miller等首次发现1例反复感染的病例：患儿表现为持续腹泻，反复皮肤感染，最终因严重败血症而死亡。实验室检查发现，患儿的血浆不能调理热灭活的酵母菌。此后，人们注意到某些儿童或成人不明原因反复感染，如慢性腹泻、中耳炎、皮肤脓肿以及带状疱疹等的感染的发生与机体缺乏某些不依赖抗体的调理因素有关。经进一步研究，先后从鼠和兔的肝、血浆以及人血清中分离出特异性结合酵母甘露聚糖的蛋白质（MBP），也称甘露聚糖结合凝集素（MBL）。     

Bal b／c小鼠甘露聚糖结合凝集素—C基因的克隆与鉴定

目的：获得小鼠甘露聚糖结合凝集素－C（MBL－C）基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT－PCR方法，从Balb/c小鼠的肝细胞中分离出MBL－C基因cDNA片段，将其克隆入PUC－T载体并测序，对基因结构及其与人MBL基因的同源性进行比较分析。结果：扩增得到的Bal b/c小鼠MBL－C基因cDNA全长735bp，编码245个氨基酸残基，包含了完整的编码区基因序列，经核苷酸序列比较分析发现，扩增得到的Bal b/c小鼠BL－C基因与Genbank中发表的序列具有100％的同源性，与人的MBL基因的同源性为71．4％。结论：成功地克隆到完整的Bal b/c小鼠MBL－C编码区基因，为进一步在整体水平研究MBL分子的天然免疫功能提供了必要的条件。     

甘露聚糖结合凝集素诱导人白血病细胞系U937细胞凋亡

目的研究甘露聚糖结合凝集素(MBL)对白血病细胞系U937凋亡的影响。方法不同浓度MBL处理U937细胞后,应用CCK-8法分析细胞增殖情况,Hoechst33258染色观察细胞核及染色质,AnnexinV/PI双染流式细胞术分析细胞凋亡率,real-timePCR和免疫印迹分析凋亡相关基因及蛋白表达。结果 30～50μg/mlMBL培养72h,U937细胞增殖明显受抑,出现不同程度核固缩、核碎裂;随MBL浓度升高或作用时间延长,凋亡细胞数逐渐增多;Fas、Caspase-3mRNA、Fas和FasL蛋白表达量升高,Caspase-3和多腺苷二磷酸多聚酶(PARP)蛋白被剪切激活或失活。结论 MBL可诱导白血病细胞U937细胞凋亡,其机制与上调Fas表达、剪切Caspase-3和PAPR有关。     

MASP2在小儿上呼吸道感染中的意义

目的探讨血浆甘露聚糖结合凝集素（MBL）相关丝氨酸蛋白酶2（MASP2）水平在儿童上呼吸道感染（上感）中的意义。方
法取103 例上感患儿和35 例健康体检儿童作为研究对象,测定其血浆MASP2 和C反应蛋白（CRP）浓度并进行白细胞计数
（WBC）。根据CRP和WBC值、感染不同时期及有无治疗,上感儿童分为CRP升高组（n=48）与正常组（n=54）、WBC升高组（n=
61）与正常组（n=40）、感染早期未用药组（n=68）与感染中后期已用药组（n=35）,对各组资料进行统计学分析。结果上感组
MASP2浓度显著高于对照组（P<0.001）,CRP升高组血浆MASP2浓度与CRP值正相关（r=0.310,P<0.05）,WBC升高组MASP2
水平与WBC值显著正相关（r=0.392,P<0.01）,感染早期未用药组MASP2 浓度显著高于感染中后期已用药组（P<0.01）,
MASP2、CRP、MBL2基因具有共同的转录因子HNF-4α结合位点。结论MASP2蛋白可能为急性期蛋白,血浆MASP2水平可作
为辅助诊断小儿上感的一个参考指标。
     

人血浆中MBL-MASP复合物的纯化与分离

目的 从人血浆中分离纯化甘露聚糖结合凝集素(MBL)和MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASP)。方法 用非活化Sepharose4B两步亲和层析纯化MBL-MASP复合物,再以SephacrylS-300柱凝胶过滤将MBL和MASP分离。在纯化MBL-MASP复合物的整个过程中,除凝胶过滤缓冲液外,均加入丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟(PMSF)和金属蛋白酶抑制剂1,10-邻二氮杂菲(1,10-phenanthroline),并控制温度在4 ℃。结果 获得高度纯化的MBL和酶原形式的MASP。SDS-PAGE和Westernblotting表明所纯化的MBL相对分子质量为28000和32000肽链构成的功能性多聚体;配体结合测定和酵母菌凝集试验证实所纯化的MBL具有生物学活性。结论 建立了一种比较简便的同时分离纯化MBL和MASP酶原的方法。     

胃癌高表达基因erk的PCR扩增,克隆和鉴定

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克隆．结果：RT－PCR扩增片段与设计相符，且特异性好，无非特异产物出现，表明所设计引物符合要求．酶切及巢式PCR、PCR－RFLP方法证明克隆片段正确插入pUC19的HindIII和BamHI位点，并将重组克隆命名为pGE42．结论；克隆的完成为进一步研究该基因在胃癌的发生中的作用，寻找其胞外配体及进行表达产物的细胞定位等工作打下基础．     

肿瘤坏死因子凋亡相关配体基因的克隆和表达

目的：克隆、表达和鉴定肿瘤坏死因子凋亡相关配体(TRAIL)．方法：从培养的人外周血淋巴细胞中提取总RNA，经RT-PCR获得TRAIL基因．将该基因克隆到pGEM-Teasy载体中，测序鉴定．将TRAIL基因插入pBV220表达载体中，42℃诱导表达4～5h，进行SDS-PAGE分析．免疫印迹法鉴定TRAIL蛋白的表达．结果：DNA测序证明，获得了TRAIL基因，其序列与GenBank中报道序列完全一致．SDSPAGE分析表明，TRAIL蛋白获得高效表达，分子质量为17ku，表达量约占菌体总蛋白的300k，．免疫印迹法鉴定显示，该蛋白可与鼠抗人TRAIL mAb产生阳性反应．结论：成功克隆和表达了TRAIL基因．     

人类TAP2基因克隆及真核表达质粒的构建

目的 克隆抗原处理相关转运体亚基TAP2基因片段并构建真核表达载体。方法 从EB病毒刺激的人B淋巴母细胞系(B-LCL)中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出TAP2 cDNA。将TAP2 cDNA插入表达载体pcDNA3．1／VS-His-TOPO中,构建重组表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO-TAP2,并进行测序分析。结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人TAP2 cDNA。结论 获得了人TAP2 cDNA并构建了重组真核表达载体,对TAP2基因产物在体外表达、进一步研究TAP2分子在肿瘤基因治疗方面的作用具有重要的意义。     

人可溶性血管内皮生长因子受体-2基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-2(sKDR)基因,构建sKDR基因真核表达载体,为进一步研究sKDR抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sKDR基因cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-T-sKDR重组载体,胶回收sKDR基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒做双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sKDR基因真核表达载体pCMV-Script-sKDR分别做双酶切和测序鉴定,证实其中含有sKDR基因,测序结果经BLAST分析,与预期设计的编码区cDNA序列一致。结论成功克隆了人sKDR基因的真核表达载体。     

人可溶性血管内皮生长因子受体-1基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)基因,构建sFlt-1基因真核表达载体,为进一步研究sFlt-1抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sFlt-1基因cDNA,将其克隆到pUCm-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pUCm-T-sFlt-1重组载体,胶回收sFlt-1基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒作双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sFlt-1基因真核表达载体pCMV-Script-sFlt-1分别作双酶切和测序鉴定,证实其中含有sFlt-1基因,测序结果经BLAST分析与预期设计的编码区cDNA序列完全一致。结论成功克隆了人sFlt-1基因的真核表达载体。     

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的：从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2（ CDC2）,并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法：从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2 cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和 XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果：RT-PCR扩增出约894 bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论：从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。     

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的　构建并鉴定携带人p5 8 2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　用PCR技术从pSPORT1-p5 8 2扩增出编码p5 8 2N端 1～ 3 45个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCVneo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果　双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重组逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G418筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3×10 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8 2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论　构建人p5 8 2基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对血液系统疾病进行基因治疗的方法