新生大鼠脑缺氧缺血后细胞色素C释放与凋亡的关系

目的　探讨未成熟脑在缺氧缺血 (HI)后细胞色素C释放的时相变化及细胞色素C释放与半胱天冬酶的激活和DNA损伤的关系。方法　 7日龄Wistar新生大鼠在缺氧缺血后不同时间点处死取脑 ,部分脑组织进行手工匀浆分离胞浆和线粒体成分进行Western蛋白印迹检查 ,部分进行组织切片用于细胞色素C免疫组化染色和免疫荧光双染色。结果　Western蛋白印迹显示线粒体中细胞色素C在HI后 1h未见明显变化 ,HI后 14hHI侧较对侧 (H)减少 4 6 % ;而HI侧脑组织胞浆中细胞色素C的含量在HI后 1h已明显增加 ,在HI后 14h增加更明显。免疫组化结果显示大脑皮层细胞色素C阳性细胞数在HI后 1h为 8 4± 1 8个 /高倍视野 ,明显高于正常对照的 1 5± 0 8个 /高倍视野(P <0 0 1) ,并随HI后恢复时间的延长阳性细胞逐渐增加 ,在HI后 14h达到峰值 (2 9 0± 5 2个 /高倍视野 ) ;而TUNEL阳性细胞数在HI后 1h为 14± 3个 /高倍视野 ,明显高于正常对照的 1 5± 0 8个 /高倍视野 (P <0 0 1) ,在HI后 2 4h达到峰值 (2 86± 86个 /高倍视野 )。荧光染色发现细胞色素C释放与活性半胱天冬酶 3仅在HI后早期同时染色 ,并且阳性细胞表现为核浓缩 ,随HI后恢复时间的延长 ,细胞色素C的阳性细胞明显少于活性半胱天冬酶 3的阳性细胞 ;细胞色素C与TUNEL     

新生大鼠缺氧缺血晚期Caspase-3表达及bFGF对其的影响

目的：观察凋亡相关基因Caspase-3在新生大鼠HIBD晚期的蛋 白表达情况以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其影响。方法：采用新 生大鼠HIBD模型,新生7 d龄Wistar大鼠,随机分成4组：HIBD组、假手术组、对照组(生理 盐水治疗)及bFGF治疗组。分别于缺氧缺血(HI)后2周、3周或4周处死大鼠,用免疫组织化学 染色方法观察脑组织Caspase-3的表达情况,用TUNEL法观察神经细胞DNA断裂情况。 结果：①HI后2周和3周时左脑凋亡细胞数高于假手术组(P<0.05);②HI后 2周和3周时脑组织Caspase-3平均光密度值(0.39±0.04, 0.38±0.04)明 显高于相应假手术组(0.36±0.01, 0.36±0.02),差异有显著性(P< 0.05);③bFGF组于治疗3周后Caspase-3平均光密度值(0.36±0.09)低于对照 组(0.37±0.04)和HIBD组(0.38±0.04),差异有显著性(P<0.05) ;④bFGF治疗3周后TUNEL阳性细胞数(4.20±1.30)亦明显少于对照组(9.80± 1.92)和HIBD组(8.00±1.00),差异有显著性(P<0.05)。结论：Caspase-3参与了新生大鼠HIBD过程,并持续活化;bFGF可能通过下调HIBD模型 鼠脑组织中Caspase-3的表达及阻止其随后的DNA断裂,从而发挥其神经保护作用。     

神经节苷脂GM1对新生大鼠缺氧缺血后海马CA1区神经细胞凋亡的影响

为研究神经节苷脂GM1对新生大鼠缺氧缺血后神经细胞凋亡的影响,将63只7日龄SD大鼠分为4组:假手术组,对照组、保护组、治疗组,制成缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,分别于缺氧缺血(HI)前及HI后腹腔注射GM1和生理盐水,通过HE染色、原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的生物素化的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)和电镜观察,比较各组神经细胞凋亡。结果显示对照组阳性细胞数明显高于保护组、治疗组(t=7.16,5.08,p<0.01),且治疗组与保护组相比,阳性细胞数无明显差异(t=1.85,p>0.05)。本实验显示GM1确实能减少新生大鼠脑组织缺氧缺血后海马CA1区细胞凋亡,且GM1在HI前或后应用同样有效。     

神经节苷脂GM1对新生大鼠缺氧缺血后海马CA1区神经细胞凋亡的影响

为研究神经节苷脂GM1对新生大鼠缺氧缺血后神经细胞凋亡的影响,将63只7日龄SD大鼠分为4组假手术组,对照组、保护组、治疗组,制成缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,分别于缺氧缺血(HI)前及HI后腹腔注射GM1和生理盐水,通过HE染色、原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的生物素化的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)和电镜观察,比较各组神经细胞凋亡.结果显示对照组阳性细胞数明显高于保护组、治疗组(t=7.16,5.08,p＜0.01),且治疗组与保护组相比,阳性细胞数无明显差异(t=1.85,p＞0.05).本实验显示GM1确实能减少新生大鼠脑组织缺氧缺血后海马CA1区细胞凋亡,且GM1在HI前或后应用同样有效.     

低温对小鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

目的：低温对脑损伤的保护作用与抑制细胞凋亡有关并取决于低温开始的时间与脑的发育成熟程度,该研究探讨不同年龄阶段的小鼠在缺氧缺血性脑损伤过程中温度的改变对脑损伤的影响。方法：结扎7日龄(P7)和21日龄(P21)C57/BL6小鼠左侧颈总动脉后分别在34℃和36℃恒温箱吸入10%氧气50min制成脑缺氧缺血(HI)模型,在HI后24h及7d取脑进行免疫组化染色和Western蛋白印迹测定。结果：常温组(36℃)在HI后7dHI侧大脑多个部位可见明显损伤,其中P7小鼠大脑皮层可见液化空洞,而P21小鼠大脑皮层成层状梗塞。低温组(34℃)在HI后7d,P7小鼠未见明显的皮层梗塞,海马仍可见明显萎缩,但神经病理学积分在低温组均明显低于常温组(P<0.01);P21小鼠除皮层损伤较常温组明显减轻外(P<0.01),其他部位损伤如海马、纹状体和丘脑与常温组无明显差别。免疫组化染色显示P7小鼠HI后24h大脑皮层活性半胱天冬酶3,凋亡诱导因子(AIF)的阳性细胞数每高倍视野在低温组分别是:7.0±5.6和3.7±6.2,明显低于常温组的51.5±23.2和31.8±22.4(P<0.01),而在海马CA1区活性半胱天冬酶3和AIF的阳性细胞数在低温组与常温组之间无明显差别。Western蛋白印迹显示HI后激活的Akt表达明显减少,低温干预能减少激活的Akt下降(P<0.05)。结论：低温对缺氧缺血性脑损伤的保护作用与脑发育的成熟程度有关,对未成熟脑损伤的保护作用优于对成熟脑损伤的脑保护作用。     

bFGF对新生大鼠缺氧缺血后海马CA 1 区神经细胞凋亡的影响

为研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对新生大鼠缺氧缺血(HI)后海马CA 1区神经细胞凋亡的影响,应用新生Wistar大鼠制备缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,用HE染色、电镜及原位缺口末端标记(TUNEL)法检测bFGF对HI后海马CA 1区神经细胞凋亡的影响.结果显示HE染色、电镜及TUNEL法均证实HI后海马存在选择性神经细胞凋亡,尤以CA 1区为重,CA 2和CA 3区病变较轻.TUNEL检测结果,bFGF治疗组阳性细胞数(15.23±14.2)低于未治疗组(25.12±20.25),差异显著(P＜0.05).因此,bFGF对HI后海马CA 1区神经细胞确有保护作用.     

bFGF对新生大鼠缺氧缺血后海马CA1区神经细胞凋亡的影响

为研究碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对新生大鼠缺氧缺血 (HI)后海马CA 1区神经细胞凋亡的影响 ,应用新生Wistar大鼠制备缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)模型 ,用HE染色、电镜及原位缺口末端标记 (TUNEL)法检测bFGF对HI后海马CA 1区神经细胞凋亡的影响。结果显示HE染色、电镜及TUNEL法均证实HI后海马存在选择性神经细胞凋亡 ,尤以CA 1区为重 ,CA 2和CA 3区病变较轻。TUNEL检测结果 ,bFGF治疗组阳性细胞数 ( 1 5 2 3± 1 4 2 )低于未治疗组 ( 2 5 1 2± 2 0 2 5) ,差异显著 (P <0 0 5)。因此 ,bFGF对HI后海马CA 1区神经细胞确有保护作用。     

肌苷对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡和细胞色素C基因表达的影响(英文)

目的：目前认为神经细胞凋亡在新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxicischemicencephalopathy,HIE)的病理过程中起重要作用,细胞色素C(CytC)是重要的促凋亡蛋白因子之一。近年研究发现,肌苷对成年大鼠脑缺血损伤有保护作用,肌苷可降低CytCmRNA的表达从而抑制神经细胞凋亡。本实验通过观察肌苷对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后神经细胞凋亡和细胞色素C基因表达的影响,以初步探讨肌苷对HIBD新生大鼠脑保护作用和可能的机制。方法：健康7日龄SD大鼠140只被随机分为3组:正常对照组(n=40),肌苷治疗组(n=50)和HIBD组(n=50),其中肌苷治疗组和HIBD组分别再随机分为缺氧缺血(HI)后6h,12h,1d,3d,7d5个亚组(各亚组n=10)。通过分离、结扎左颈总动脉和8%低氧暴露制备HIBD动物模型。正常对照组不进行缺氧缺血处理,按肌苷治疗组和HIBD组各相同时间点随机分为5个亚组(各亚组n=8)。肌苷治疗组于模型制备后即刻开始腹腔注射肌苷注射液100mg/kg,每天2次,连续7d。以TUNEL法检测神经元凋亡情况,原位杂交技术测定CytCmRNA表达情况。结果：正常对照组皮质区和海马区可见少许凋亡细胞和CytC阳性细胞,HI后6hHIBD组皮质区和CA1区凋亡细胞和CytC阳性细胞即见增多,于HI后1d达高峰,之后逐渐下降,HI后7d凋亡细胞和CytC阳性细胞数仍明显高于正常对照组,各时间点与正常对照组相比较,差异有显著性意义(P0.05)。经肌苷治疗后凋亡细胞数和神经细胞CytCmRNA表达均减少,各时间点与HIBD组相应时间点比较,差异有显著性意义(P0.05)。直线相关分析显示HIBD后,凋亡细胞数与CytCmRNA表达呈显著正相关(r=0.88,P0.01)。结论：HI损伤后给予肌苷干预能减少HI导致的神经细胞凋亡,下调CytCmRNA表达。肌苷治疗后,新生HIBD大鼠的凋亡细胞数减少与CytCmRNA表达下调呈显著正相关,提示肌苷可能通过抑制CytCmRNA表达从而起到减少细胞凋亡、保护神经元的作用。     

神经节苷脂治疗新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的研究

目的：观察神经节苷脂(GM1)对缺氧缺血(HI)新生大鼠的治疗作用及对凋亡相关基因Bax/Bcl-2表达的影响。方法：应用生后第7天的SD大鼠,制备缺血缺氧性脑病(HIE)模型。用TUNEL法检测细胞凋亡,用免疫组织化学SABC法检测Bax/Bcl-2的表达。结果：新生大鼠HI后脑细胞存在凋亡。GM1治疗能减少细胞凋亡。治疗组皮质凋亡细胞数为55.75±6.71,较HI组75.25±4.94下降(P<0.01);治疗组海马凋亡细胞数较对照组也有下降(47.25±6.6 vs 32.14±4.88),P<0.01。各组Bax和Bcl-2表达皆为阳性,但在HI对照组,Bax表达更强,而Bcl-2表达较弱。结论：应用GM1治疗HI脑损伤可减少脑细胞凋亡,GM1治疗对凋亡相关基因Bax/Bcl-2表达有一定的影响,HI脑损伤后细胞凋亡可能与这两种基因相关。     

新生大鼠缺氧缺血脑损伤时脑组织STAT3信号通路的作用

目的 研究信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路在新生大鼠缺氧缺血脑损伤中的作用和机制。方法 80 只7 日龄Sprague-Dawley 大鼠随机分为缺氧缺血(HI) 组(n=40)和假手术组(n=40)。HI 组大鼠行右侧颈总动脉结扎随后缺氧(8% O₂)处理2.5 h,假手术组仅分离右侧颈总动脉但不予结扎和缺氧处理。两组分别在HI 后4、6、8、12 和24 h 处死大鼠并收集脑组织。采用免疫组化和Westernblot 法检测STAT3、磷酸化STAT3 和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达,TUNEL 染色法检测细胞凋亡。结果 HI 组和假手术组间STAT3 蛋白表达在各时间点差异均无统计学意义(P>0.05);除24 h 外,其余时间点HI 组的磷酸化STAT3 蛋白表达均明显高于假手术组,6 h 达高峰(P<0.01)。各时间点HI 组VEGF 蛋白表达均明显高于假手术组,8 h 达高峰(P<0.05)。HI 组各时间点凋亡细胞数均高于假手术组,且随时间延长凋亡细胞数逐渐增加(P<0.01)。结论 新生大鼠HI 后STAT3 可能被磷酸化激活从而诱导VEGF 表达;STAT3通路激活可能参与了神经细胞的凋亡调节,推测该通路活化与神经细胞的凋亡抑制相关。     

NOC/oFQ and NMDA contribute to piglet hypoxic ischemic hypotensive cerebrovasodilation impairment

Previous studies have observed that hypotensive pial artery dilation was blunted after hypoxia-ischemia. In unrelated studies, the opioid nociceptin/orphanin FQ (NOC/oFQ) was observed to contribute to hypoxic ischemic impairment of N-methyl-D-aspartate (NMDA)-induced pial dilation. This study determined the contribution of NOC/oFQ and NMDA to hypoxic ischemic hypotensive cerebrovasodilation impairment in newborn pigs equipped with a closed cranial window. Global cerebral ischemia was produced via elevated intracranial pressure. Hypoxia decreased PO(2) to 33 +/- 3 mm Hg. Topical NOC/oFQ (10(-10) M), the cerebrospinal fluid concentration after hypoxia-ischemia, had no effect on pial artery diameter by itself but attenuated hypotension (mean arterial blood pressure decrease of 44 +/- 2%) -induced pial artery dilation (35 +/- 2% versus 22 +/- 3%). Hypotensive pial artery dilation was blunted by hypoxia-ischemia, but such dilation was partially protected by pretreatment with the putative NOC/oFQ receptor antagonist, [F/G] NOC/oFQ (1-13) NH(2) (10(-6) M; 29 +/- 2%, sham control; 7 +/- 2%, hypoxia-ischemia; and 13 +/- 2%, hypoxia-ischemia and [F/G] NOC/oFQ (1-13) NH(2)). Coadministration of the NMDA antagonist MK801 (10(-5) M) with NOC/oFQ(10(-10) M) partially prevented hypotensive pial dilation impairment. Similarly, pretreatment with MK801 partially protected hypoxic ischemia impairment of hypotensive pial dilation (35 +/- 2%, sham control; 7 +/- 1%, hypoxia-ischemia; 22 +/- 2%, hypoxia-ischemia + MK801). These data show that NOC/oFQ and NMDA contribute to hypoxic ischemic hypotensive cerebrovasodilation impairment. These data suggest that NOC/oFQ modulation of NMDA vascular activity also contributes to such hypotensive impairment.     

MK-801对缺氧缺血性大脑皮质神经细胞钙超载影响的研究

目的 探讨ＭＫ－８０１对缺氧缺血性脑损伤的防治作用。方法 将体外培养的大鼠胚胎大脑皮质神经细胞分为正常对照、缺氧缺血性脑损伤、ＭＫ－８０１治疗三组,每组８例。检测各组神经细胞内总钙（ＴＣａ）及游离钙（Ｃａ＾２＋ｉ）的变化。结果 缺氧缺血性脑损伤组ＴＣａ、Ｃａ＾２＋ｉ明显高于正常对照组（Ｐ〈０．０１）,ＭＫ－８０１治疗组ＴＣａ、Ｃａ＾２＋ｉ明显低于缺氧缺血性脑损伤组（Ｐ〈０．０１）。结论 缺氧缺血性     

新生鼠缺氧缺血性脑损伤内源性纤维蛋白溶酶原激活剂变化及其意义

目的新生儿缺氧缺血性脑损伤发病机制尚不十分清楚,目前缺乏有效的治疗手段。近年来,越来越多的研究显示组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tissue type plasminogen activator, tPA)在神经系统中起到很重要的作用。该研究欲探讨纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)在新生鼠缺氧缺血脑损伤中的作用。方法选用Wistar大鼠7日龄的新生鼠,运用Rice Vannucci动物模型造成新生鼠脑缺血缺氧,缺血缺氧后不同时间取新生鼠大脑检测。异硫氰酸荧光素 右旋糖酐左心室灌注分析脑缺血缺氧后新生鼠脑的再灌注障碍。用逆转录酶 聚合酶链反应(RT PCR),酶谱法检测损伤后不同时间tPA的表达与活性;并采用双重免疫荧光,TUNEL和DAPI染色法检测血小板聚集指标(Integrin GPIIb)与纤维蛋白(fibrin)在缺血缺氧后不同时间的表达及神经细胞凋亡。 结果新生鼠脑缺氧缺血后1 h,异硫氰酸荧光素 右旋糖酐心室灌注提示新生鼠大脑有明显的缺血梗塞区,而Integrin GPIIb与fibrin的表达也较对照侧明显增加。但4 h后缺血梗塞区面积明显缩小,伴有Integrin GPIIb与fibrin的表达减少。tPA的表达与活性在缺血缺氧后明显增加。随着缺氧缺血后恢复的时间延长,大脑凋亡细胞增加。结论 tPA表达的增加在脑缺氧缺血的急性期可有助于血栓溶解,但在脑缺氧缺血的亚急性期却会导致神经细胞凋亡而加重脑损伤。     

Neuronal protection with magnesium

Delayed neuronal death following hypoxic ischaemic insult is primarily mediated by the N-methyl Daspartate (NMDA) receptor. The NMDA receptor antagonist MK 801, has been shown to limit neuronal death following hypoxic ischaemic injury but is too toxic to be used in the human neonate. Magnesium blocks the NMDA channel in a voltage dependent manner. Its administration after a simulated hypoxic ischaemic insult limits neurological damage in several animal models. The efficacy of magnesium in providing neuroprotection in the human neonate, however needs to be established in controlled clinical trials.     

新生大鼠脑缺氧缺血模型心肌细胞凋亡的研究

目的　研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)发生后不同时段心肌细胞凋亡情况。方法　结扎新生 7日龄大鼠右颈总动脉后放入 8%低氧舱 2h制成HIBD模型 ,应用AnnexinV/PI双染流式细胞技术检测缺氧缺血 (HI)后 1、4、18、2 4、4 8、72h及 7d心肌细胞凋亡情况。结果　HI后各HI组心肌细胞的凋亡率均明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,72hHI组凋亡率又显著高于其他组 (P <0 .0 5 ) ,表明HI后 7d内各组大鼠心肌均存在超出正常凋亡 ,尤以 72hHI组凋亡率最高。结论　新生大鼠HIBD后 1h～ 7d内心肌细胞均存在明显凋亡 ,以HI后 72h更明显 ,提示对缺氧缺血性脑病新生儿保护心肌减少心肌凋亡的治疗应至少用至生后 7d     

新生大鼠脑缺氧缺血后迟发性细胞死亡的研究

目的　探讨新生动物脑缺氧缺血 (HI)后迟发性细胞死亡是否存在细胞凋亡 ;分析不同检测手段的敏感性与特异性。方法　在建立新生大鼠脑HI损伤标准动物模型基础上,采用脑组织病理学HE染色光镜观察、透射电镜、原位末端标记 (ISEL)及DNA电泳等分别对HI后不同时间点的实验侧脑皮质、海马回中凋亡细胞的形态、特点等进行观察和比较。结果　光镜、电镜下显示实验侧脑皮质及海马神经元皱缩、染色质凝集并出现凋亡小体,ISEL及DNA电泳证实有裂解DNA存在。且发现脑皮质及海马回凋亡性细胞死亡通常自HI后 6～12h开始,2 4h达高峰。结论　缺氧缺血可引起新生动物脑细胞凋亡。在脑HI迟发性损伤中不仅存在坏死,而且存在着复杂的细胞凋亡过程。不同的检测手段均具有一定的局限性 ,只有结合多种方法进行检测 ,才能正确判定凋亡细胞的存在。     

正常新生大鼠及缺血缺氧性损伤后脑组织铁的组织化学改变

目的：应用大鼠HIE模型了解正常情况下及缺血缺氧损伤后脑组织铁的组织化学改变。方法：实验分正常对照组和HIE组。正常对照组分别于 8 d,10 d,14 d,21 d 龄处死(每时间点3只),HIE组分别于 7 d 龄大鼠(HIE)模型制成后观察 12 h,24 h,3 d,7 d,14 d 处死(每时间点3只)。各组脑组织切片,进行铁Perl's染色和光镜观察。结果：正常大鼠脑组织铁染色阳性细胞较少且主要见于扣带及胼胝体、脑室周围、内囊及外囊的尖部。形态学上铁染色阳性细胞主要与少突神经胶质细胞和小神经胶质细胞相似。HIE组缺血缺氧损伤后 12 h 脑组织铁染色情况与正常对照组无明显差异。缺血缺氧损伤后随时间推移铁染色逐渐增强,1周时为甚,以皮质、内囊及海马回处最明显,铁染色阳性神经胶质的增多程度大于铁染色阳性细胞的增多程度,有明显的傍血管现象。结论：铁染色可作为判断脑组织缺血缺氧中晚期损伤程度的指标之一。     

Synergistic protection of a general caspase inhibitor and MK-801 in bilirubin-induced cell death in human NT2-N neurons

Unconjugated bilirubin (UCB) induces both apoptosis and necrosis in neurons. To investigate the role of caspases and excitotoxicity in UCB-induced cell death, we exposed NT2-N neurons to 5 microM UCB (a concentration known to induce apoptosis) or 2 microM staurosporine (positive apoptosis control) and investigated the effects of treatments with the specific caspase-3 inhibitor, zDEVD.FMK (20 and 100 microM), or the general caspase inhibitor, zVAD.FMK (20 and 100 microM), and/or the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist MK-801 (10 microM) during a 24- or 48-h exposure. UCB increased caspase-3 activity 2.3-fold after 6 h. Despite this, treatment with zDEVD.FMK did not prevent cell death. zVAD.FMK enhanced neuronal survival by reducing apoptotic nuclear fragmentation, while MK-801 enhanced survival by reducing apoptotic nuclear condensation; both without affecting the MTT assays. Combined treatment reduced both apoptotic morphologies (without affecting necrosis), and this effect was also reflected in the MTT assays [corrected] We conclude that NMDA receptor-mediated pathways and caspase-mediated pathways are involved in UCB-induced cell death in human NT2-N neurons. Concomitant inhibition of both pathways results in synergistic protection.