体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的:间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织,而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚.实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法,观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性.方法:实验于2006-03/2007-06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成.①实验材料:4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:于生长早期锯取梅花鹿鹿茸,在解剖显微镜下定位和切取间质层(突起部),即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层.Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞,锥虫蓝染色显示细胞活性达90%以上,将活性确定后的细胞液氮冻存.取第3代细胞,用含10%胎牛血清以及10 μg/L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养.③实验评估:培养12 d 后于倒置显微镜下观察细胞形态,采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞.结果:①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养:Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞,贴壁的间充质干细胞形态均匀,呈长梭形,克隆样生长,增殖迅速.②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞:转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速,诱导后细胞形态明显改变,呈典型的软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原表达阳性.结论:采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞,在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力.     

转化生长因子β2诱导鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨的促分化作用已被广泛证实.目的:假设转化生长因子β2可在体外诱导鼠脂肪间充质干细胞向成软骨细胞分化,实验拟验证其可行性.设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2007-03/11在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,用于分离培养脂肪间允质干细胞.方法:取第2代脂肪间充质于细胞,通过10μg/L外源性转化生长因子β2以离心管内微团培养、单层培养两种方式向软骨细胞进行诱导分化,培养3周.对照组单纯加入基础培养液.主要观察指标:两种湾导方式下细胞(团)形态结构的变化、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果、软骨细胞特异性基因Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达.结果:微团培养诱导的脂肪间充质干细胞组织块经苏木精.伊红染色显示在组织内部形成类似软骨陷窝样结构,阿尔新蓝染色呈强阳性,Ⅱ型胶原免疫组化结果显示有棕褐色强阳性颗粒,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA的表达.单层培养诱导的脂肪间充质干细胞无细胞外软骨基质分泌,未发现Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan mRNA的表达.结论:在离心管内微团培养方式下,转化生长因子β2可以启动或促进脂肪间充质干细胞的软骨分化,且分泌软骨细胞特异性基质.简单的单层培养方式诱导失败.     

体外诱导的人脂肪间充质干细胞源性软骨细胞体内成骨活性

目的:目前对间充质干细胞向软骨细胞诱导分化主要包括体内诱导和体外诱导两种方式,前者依靠体内微环境,随机性大且难以进行监控和调整.本实验探讨体外诱导人脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,以及诱导后细胞在裸鼠体内的成软骨能力.方法:实验于2006-08/2007-05在中南大学湘雅医院中心实验室完成.①对象与材料:皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例,年龄25～64岁,对实验及治疗均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级裸鼠5只,体内成软骨实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.离心管容量20 mL,由GeneRay公司生产.②实验方法:将皮下脂肪组织剪碎,I型胶原酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞,待细胞铺满瓶底80%时胰酶消化传代.传至第6代时收集 5×106个细胞,用含1%新生牛血清、高糖DMEM、10 μg/L转化生长因子β1、37.5 mg/L维生素C、6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、10-7 mol/L地塞米松的软骨细胞诱导剂重悬于无支架离心管内.③实验评估:诱导过程中观察细胞聚集状态.诱导2周后采用苏木精-伊红染色、RT-PCR、Western blot对细胞形态及功能变化进行检测.将诱导后细胞与纤维蛋白原凝胶混合,植入裸鼠皮下,3周后切取植入组织块,苏木精-伊红染色及II型胶原免疫组化染色观察体内成软骨情况.结果:①诱导后细胞聚集状态:诱导2 d后脂肪间充质干细胞自行聚集为一条状细胞团,1周后细胞团聚集呈球状.②苏木精-伊红染色结果:未见有软骨陷窝形成.③RT-PCR检测结果:细胞团内Ⅱ型胶原蛋白和Sox9 mRNA均呈阳性表达.④Western blot检测结果:细胞团内有较强的Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan表达.⑤体内成软骨情况:植入裸鼠皮下的组织块内有大量软骨陷窝及II型胶原蛋白形成.结论:①在无支架离心管内,脂肪间充质干细胞经软骨诱导剂作用后具有典型的软骨细胞表型,但未形成成熟软骨组织所具备的软骨陷窝.②诱导后细胞与凝胶复合种植于裸鼠体内,可形成具有典型软骨特征的组织.     

微球培养人脂肪间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化

目的:观察微球培养的人脂肪间充质干细胞在特定诱导条件下向软骨细胞的分化情况,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2006-03/08在湘雅医院中心实验室完成。①实验材料:皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例,对本实验均知情同意。②实验方法:取皮下脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞,胰酶消化,取传至第6代的细胞,密度调整为1×1010L-1进行接种培养,细胞贴附后加入软骨细胞诱导剂(含10μg/L转化生长因子β1、37.5mg/L维生素C、6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10-7mol/L地塞米松、1%新生牛血清的高糖DMEM),倒置显微镜下观察细胞团的变化。③实验评估:诱导14d后,将细胞吹散,细胞爬片,免疫组化染色检测Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺兰染色观察细胞内异染情况,RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖aggrecan mRNA的表达。结果:①脂肪间充质干细胞向软骨细胞诱导后的形态:诱导3d后,细胞团向内呈放射状聚集。②诱导后Ⅱ型胶原的表达及细胞内异染情况:诱导14d后,Ⅱ型胶原在胞浆、胞膜及细胞外基质中均有表达,呈棕黄色;甲苯胺兰染色显示胞浆内呈蓝色异染。③诱导前后Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan mRNA的表达:诱导前脂肪间充质干细胞无Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan mRNA表达,而诱导14d后二者均有较高表达。结论:在微球状态下可成功诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。     

三种细胞因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化

背景:已证实血管内皮细胞种植于组织工程材料上在体内可增殖分化形成血管,但获取内皮细胞时创伤较大,且来源极其有限.目的:观察在血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1体外联合诱导下,兔骨髓间充质干细胞能否向血管内皮细胞分化.设计、时间及地点:2006-11/2007-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成的细胞对照观察.材料:清洁级8周龄日本大耳白兔1只用于骨髓间充质干细胞的分离培养.血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1均为Peprotech公司产品.方法:兔麻醉后抽取骨髓液,贴壁法 胰酶消化分离培养获得足够数量的骨髓间充质干细胞,分为两组,诱导组向含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入10μg/L血管内皮细胞生长因子、1μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L胰岛素样生长因子1,诱导2周.对照组单纯加入含10%胎牛血清的DMEM培养液.主要观察指标:对诱导后细胞进行形态观察、NO含量测定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色以及电镜观察Weibel-Palade小体形成情况.结果:诱导5d后细胞呈集落样分布,形态趋于圆形;未诱导细胞均匀散在分布,呈长梭形和三角形.诱导14d后,诱导组细胞培养上清液中NO含量明显高于对照组(t=3.75, P<0.05).诱导组表达血管内皮细胞特有表面标志Ⅷ因子,超微结构可见Weibel-Palade小体;对照组Ⅷ因子相关抗原呈阴性表达.结论:兔骨髓间充质干细胞经上述3种细胞因子体外联合诱导后,可向血管内皮细胞方向分化.     

间充质干细胞向软骨细胞表型分化的研究进展

软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,负责维持细胞外基质的稳态与平衡,软骨细胞数量的丢失和功能的失衡在骨关节炎的发病中起关键作用。但是由于关节软骨几乎没有再生能力,目前临床上用来治疗关节软骨缺损的方法和药物难以获得满意的疗效。软骨组织工程致力于通过人工手段在体内外生成透明软骨,为关节软骨缺损的修复提供了一条新的方法。间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞可在特定诱导条件下分化为软骨细胞。因此,阐明该过程中软骨形成的相关转录因子和具体机制对于未来软骨再生医学的成功至关重要。     

人脐带血间充质干细胞分离培养及向软骨细胞的分化

目的:关节软骨创伤难以自行修复,传统疗法因修复的组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性.种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件,为此拟建立一套较为简便、有效和实用的脐血间充质干细胞体外分离培养体系,探讨其向软骨细胞分化的可行性.方法:实验于2005-07/2006-09在右江民族医学院组织学与胚胎学教研室完成.①细胞来源:无妊娠并发症足月分娩后的胎盘脐静脉血,均征得供者同意,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:穿刺抽取15 mL脐带血,密度梯度法分离吸取分层界面的白色环形絮状物,其中富含单个核细胞,离心后沉积细胞用含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基悬浮,调整细胞密度为1×109 L-1接种于25 T培养瓶内,放置在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,72 h后更换培养基,去除红细胞及其他未贴壁细胞,至70%～80%融合时传代.③实验评估:取传至第2代的脐带血间充质干细胞进行增殖能力检测;加入含终浓度为100 μg/L胰岛素样生长因子1,15%胎牛血清的DMEM软骨细胞诱导培养基,倒置显微镜下连续观察细胞生长情况,并行苏木精-伊红染色,应用扫描电子显微镜对诱导后细胞进行鉴定.结果:①细胞形态学观察:来源于脐血的单个核细胞接种24 h少量贴壁,近似圆形或短梭形;体外培养3 d后可见分散的间充质干细胞小集落,集落细胞为长梭形,呈放射状生长;2周后细胞集落彼此融合,呈旋涡状或菊花状生长.传代后3周细胞基本融合成层.②细胞增殖能力检测:脐带血间充质干细胞传代后8～12 h贴壁,7～13 d细胞处于对数生长期,16～19 d进入平台期,扩增速度快于原代培养,倍增时间为8.5 d.③脐带血间充质干细胞向软骨细胞诱导分化结果:胰岛素样生长因子1诱导12 d,脐带血间充质干细胞苏木精-伊红染色可见分泌少量细胞外基质.扫描电子显微镜下呈现软骨细胞特点,多边形,外围被分泌细胞外基质所围绕,呈蜘蛛网样.结论:从人脐带血中成功分离获取间充质干细胞,在体外经胰岛素样生长因子1条件培养液诱导短期内可获得软骨细胞.     

特定培养基条件下大鼠脂肪间充质干细胞体外定向软骨细胞的分化

目的:体外诱导大鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,并对分化细胞进行相应鉴定,观察脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:实验于2005-05/2006-05在湘雅医院中心实验室完成。①取大鼠腹股沟脂肪,消化分离脂肪间充质干细胞进行原代培养。②流式细胞仪检测第3代脂肪间充质干细胞表面CD29,CD34,CD44表达。③传3代细胞进行微团培养1d,换用含体积分数为0.01的新生牛血清、10μg/L的转化生长因子β1、6.25mg/L的胰岛素、6.25mg/L的转铁蛋白、1×10-7mol/L的地塞米松、50mg/L的维生素C的高糖DMEM诱导液,为特定培养条件。④在诱导后4,7,14d应用阿尔新兰染色、蕃红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学评价软骨形成情况。⑤反转录-聚合酶链反应在诱导后0和14d检测脂肪间充质干细胞前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA的表达。结果:①脂肪间充质干细胞的形态特征:原代脂肪间充质干细胞呈短梭形、梭形及多角形,3代后呈均一长梭形。②脂肪间充质干细胞的表面标志鉴定:脂肪间充质干细胞表达CD29,CD44,基本不表达CD34。③脂肪间充质干细胞诱导后的形态特征:脂肪间充质干细胞经诱导后,由长梭形转变为三角形、多角形或短梭形,逐渐聚集成结节。④脂肪间充质干细胞诱导后的细胞化学染色结果:诱导后脂肪间充质干细胞胞外基质阿尔新兰染色、蕃红O/固绿染色、和Ⅱ型胶原免疫细胞化学着色阳性。⑤反转录-聚合酶链反应检测结果:反转录-聚合酶链反应检测未诱导脂肪间充质干细胞不表达前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因,而诱导后的脂肪间充质干细胞表达前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因。结论:脂肪间充质干细胞在由转化生长因子1、胰岛素、转铁蛋白等组成的特定培养基条件诱导下可以定向软骨细胞分化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的：间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织，而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚。实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法，观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性。 方法：实验于2006—03／2007—06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成。①实验材料：4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：于生长早期锯取梅花鹿鹿茸，在解剖显微镜下定位和切取间质层（突起部），即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层。Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞，锥虫蓝染色显示细胞活性达90％以上，将活性确定后的细胞液氮冻存。取第3代细胞，用含10％胎牛血清以及10μg／L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养。③实验评估：培养12d后于倒置显微镜下观察细胞形态，采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞。 结果：①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养：Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞，贴壁的间充质干细胞形态均匀，呈长梭形，克隆样生长，增殖迅速。②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞：转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速，诱导后细胞形态明显改变，呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞，在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力。     

人脂肪干细胞体外培养特性及成脂成软骨分化

目的:观察人脂肪组织间充质干细胞体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:实验于2006-08/2007-03在吉林大学中日联谊医院前列腺疾病防治研究中心完成主要工作。实验方法:①人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸脂术,酶消化法分离出脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为0.10胎牛血清的高糖DMEM培养基进行原代培养。②取第3代脂肪间充质干细胞,采用细胞计数法测定细胞生长曲线,流式细胞仪测定CD13、CD34抗原的表达,免疫荧光法测定CD34抗原的表达。③取第3代脂肪间充质干细胞,用含体积分数为0.10胎牛血清、0.5mmol/LIBMX、1μmol/L地塞米松、10μmol/L胰岛素的成脂诱导培养基和含体积分数为0.01胎牛血清、10μg/L转化生长因子β1、50nmol/L抗坏血酸、6.25mg/L胰岛素的成软骨诱导培养基分别诱导分化。④每天用倒置显微镜观察细胞形态及增殖变化,油红"O"、AB-PSA染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测成脂、成软骨分化情况。结果:①体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平的长梭形,细胞形态均一,传代稳定。间质细胞相关标志CD13和干细胞相关标志CD34表达阳性。②定向诱导后表现出脂肪细胞和软骨细胞特性。经成脂诱导,细胞内出现空泡,油红"O"染色呈红色;经成软骨染色,AB-PSA染色呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色。结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为软骨组织工程种子细胞。     

人骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

目的:探讨应用壳聚糖支架三维立体培养人骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),体外诱导其分化成为软骨细胞的可行性。方法:实验于2004-02/11在中山大学附属第三医院中心实验室完成。相分离法制备三维多孔壳聚糖支架,检测支架的孔隙率、孔径。抽取人骨髓,密度梯度离心法分离纯化,体外培养扩增。将第3代MSCs复合于支架中培养,应用无血清诱导液诱导细胞向软骨细胞分化,通过组织学染色及扫描电镜观察细胞的形态、增殖及功能的改变。结果:通过相分离法可制备出高孔隙率的三维壳聚糖支架,孔隙率达86.5%,孔隙分布均匀且相互连通,平均孔径182μm。诱导分化的MSCs在支架中贴附良好,呈现典型的软骨细胞形态,并有细胞外基质分泌。结论:人MSCs在三维立体培养环境下可诱导分化为软骨细胞,作为种子细胞在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用价值。     

Differentiation of adipose-derived stromal vascular fraction culture cells into chondrocytes using the method of cell sorting with a mesenchymal stem cell marker

The incidence of arthritic diseases is rapidly increasing in most advanced countries. Articular cartilage, which is the most important tissue in the joint, consists of chondrocytes and abundant extracellular matrix, including aggrecan, and shows poor self-repair. We studied the potential of stem cells in mouse subcutaneous adipose tissue as a source of cells to regenerate cartilage tissue. Analysis of adipose-derived stromal vascular fraction culture cells (ADSVFs) using mesenchymal stem cell markers showed that CD90-positive cells accounted for 93.8%, CD105-positive cells for 68.5%, and p75 neurotrophin receptor (p75NTR, CD271)-positive cells for 36.1%. These results indicate that cells positive for mesenchymal stem cell markers are present in ADSVFs. The CD105-positive or -negative cells were isolated from ADSVFs by magnetic cell separation (MACS), and the efficiency of differentiation into chondrocytes was compared with using three methods of pellet method, gel-coating method, and gel-embedding sheet method. Using the CD105-positive cells and the gel-embedding sheet method, aggrecan mRNA was detected about three times higher than pellet and gel-coating methods. The above data suggest that ADSVFs could be differentiated into chondrocyte-like cells in the gel-embedding sheet method and could be useful in regenerative medicine to treat cartilage defects or cartilage degenerative disease. The use of cells sorted by mesenchymal stem cell markers from adipose tissue would gain position in the repair of cartilage tissue.     

转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化

背景:转化生长因子β1是关节软骨组织工程研究的首选生长因子,适当浓度能刺激关节软骨细胞增殖、分裂和分化.目的:建立含有转化生长因子β1的特殊诱导体系培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的能力,观察诱导后的细胞形态及表型变化.方法:于兔胫骨结节内侧抽取骨髓,采用贴壁培养法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞行流式细胞仪检测鉴定其表面抗原,以含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下对第3代骨髓间充质干细胞诱导培养21 d,诱导后与人鼻中隔软骨细胞进行比较.采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测.结果与结论:贴壁培养法可分离并纯化兔骨髓间充质干细胞,所得第3代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44 阳性,CD34、CD45 阴性.经诱导培养21 d后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示可见阳性细胞.提示含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下,骨髓间充质干细胞可以转化为软骨细胞,且与正常软骨细胞无明显差异.     

骨髓间充质干细胞在含转化生长因子β1诱导培养基及二维培养条件下向软骨细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞可定向诱导为软骨细胞.目的:建立二维培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导体系,分析转化生长因子β 1作为诱导条件的最佳浓度,以及诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的相关影响因素,观察细胞诱导后的细胞形态及表型变化.设计:随机对照动物实验.单位:贵阳医学院动物实验中心.材料:实验于2005-09/2006-11在贵阳医学院动物实验中心完成.4周龄雄性SD大鼠24只由贵阳医学院动物中心提供,体质量(98.23±7.97)g,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:取SD大鼠的股骨及胫骨,采用贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞行流式细胞术检测鉴定其表面抗原,分别以含1,5,10,15,20 μ g/L 的转化生长因子β 1的诱导培养基在二维培养条件下对第4代骨髓间充质干细胞诱导培养,对照组加入阴性诱导培养基.2周后采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测,采用二甲基亚甲蓝比色法定量检测诱导后细胞外基质糖胺多糖的表达.主要观察指标:各组细胞表面抗原检测、Ⅱ型胶原定性检测及细胞外基质糖胺多糖表达检测.结果:贴壁培养法可分离并纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞,所得第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44阳性,CD34、CD45阴性.经诱导培养2周后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示,15,10,15,20 μg/L 转化生长因子β1组可见阳性细胞,二甲基亚甲蓝比色法检测显示各实验组细胞外基质糖胺多糖含量均明显高于对照组(P<0.01).10 μg/L 转化生长因子β 1组细胞分泌的细胞外基质糖胺多糖明显多于其它剂量组(P<0.01),并且细胞分泌细胞外基质糖胺多糖的能力与细胞密度呈正相关(r=0.822,P<0.01).结论:10 μg/L转化生长因子β 1存在的二维培养条件下,较高的细胞密度有利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化.