慢性脊髓压迫及减压后骨骼肌细胞凋亡的实验研究

目的:研究大鼠慢性压迫性脊髓损伤及减压后骨骼肌萎缩与细胞凋亡的关系以及凋亡相关基因P53的表达意义。方法:45只SD大鼠分成3组,压迫组15只,作成轻、中和重度慢性脊髓压迫损伤;减压组25只,将重度压迫组的压迫装置取出;正常对照组5只,不做任何处理。应用苏木精-伊红染色、终末脱氧核苷酰转移酶介导的原位末端标记法和原位杂交技术研究慢性脊髓压迫及减压后肌细胞萎缩、凋亡的特点。结果:随着压迫程度的增加肌细胞凋亡数量增加,P53mRNA表达增高;减压后肌细胞凋亡数量明显减少,P53mRNA表达减少。结论:慢性脊髓压迫后肌细胞出现凋亡,骨骼肌细胞的凋亡是肌肉失神经萎缩的机制之一,减压可通过抑制细胞凋亡阻止肌肉萎缩。     

兔慢性颈脊髓压迫减压术后凋亡基因bcf-2和bax的表达

目的：通过观察兔慢性颈脊髓压迫症动物模型脊髓减压术后bcl-2和bax的表达，以期了解脊髓减压术治疗慢性颈脊髓压迫症的作用机制。方法：21只患有慢性颈脊髓压迫症的中国大白兔，改良Tarlov运动功能评分均为3分，随机分为两组：①减压组15只：退出螺钉进行减压。其中1只兔发生急性脊髓损伤，改良Tarlov运动功能评分降至1分，排除实验。②压迫组6只：不施行减压术。另取6只无神经功能障碍的健康大白兔作为正常对照组。分别在减压后第1，7，15，30，60天，观察减压术后脊髓的细胞凋亡和凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果：脊髓减压术后凋亡细胞逐渐减少。脊髓减压术后第1天,bcl-2和bax阳性细胞均较减压前增多。减压后第7天，bcl-2阳性细胞明显增多，bax阳性细胞减少。减压后第15，30天和第60天，bcl-2和bax阳性细胞均逐渐减少。至减压后第60天，bcl-2和bax阳性细胞表达与正常对照组相似。结论：脊髓减压术能有效抑制神经细胞凋亡。     

慢性压迫性脊髓损伤后骨骼肌形态学及相关蛋白Myogenin和myoD表达的实验研究

目的观察慢性压迫性脊髓损伤后骨骼肌形态学改变及相关蛋白Myogenin和myoD的表达变化。方法50只Wistar雌性大鼠,随机分为正常组、假手术组和慢性压迫组。慢性压迫组置人平头塑料螺钉对大鼠脊髓进行后路渐进性压迫,于2个月后分别压迫到20％、40％、60％左右程度。处死大鼠后取腓肠肌作为标本,分别做成电镜标本及进行Myogenin和myoD的免疫组化染色。结果各压迫组的大鼠腓肠肌细胞肌丝、肌节结构发生退变,并且成肌细胞在数量增多的同时出现凋亡现象;压迫组与正常组、假手术组比较相关蛋白Myogenin和myoD的表达增高（P〈0．05）。结论脊髓压迫性损伤可引起靶器官肌肉的退变,其退变的程度和脊髓受压程度呈正相关,虽然同时存在骨骼肌的增殖反应,但完整的细胞分裂过程少见,这可能是慢性压迫性脊髓损伤后影响功能恢复的原因之一。     

大鼠慢性压迫性脊髓损伤后凋亡调控相关基因p53的表达变化及意义

目的：探讨慢性压迫性脊髓损伤(chronic compressive spinal cord iniury，CCSCI)后脊髓组织中凋亡相关基因p53的表达变化规律及意义。方法：通过制作Wistar大鼠慢性压迫脊髓损伤模型，应用免疫组织化学方法和原位杂交方法，研究压迫组、假手术对照组脊髓组织中p53mRNA和p53蛋白表达的灰度值差异。结果：p53mRNA在脊髓受压后4h脊髓组织即有表达，1d后增高，7d后仍有表达，14d后无表达，而p53蛋白受压1d后呈弱阳性，之后无明显表达。结论：p53的表达规律提示它参与了CCSCI内源性机制的调控过程。     

大鼠坐骨神经慢性压迫损伤后脊髓感觉神经元发生非凋亡性细胞程序性死亡

目的:观察大鼠坐骨神经慢性压迫损伤后脊髓背角感觉神经元是否发生非凋亡性细胞程序性死亡(paraptosis).方法:成年雄性SD大鼠20只,随机分为正常组,手术组.手术组建立慢性压迫性损伤(CCI)模型,又分为术后3d、7d、14d组.实验动物以4%多聚甲醛PBS液灌注内固定,取与坐骨神经相应的腰4～腰6节段脊髓,于2.5%戊二醛中固定,透射电镜观察左侧脊髓背角浅层神经元超微结构并摄片.结果:电镜下,术后3d组腰4～腰6节段脊髓左侧背角浅层神经元形态学典型变化为:细胞肿胀,胞膜完整,胞浆内大量空泡,核结构基本正常,符合paraptosis形式程序性细胞死亡表现;7d和14d组神经元形态变化:细胞皱缩、密度增大,核带增多及染色质浓聚贴附于核膜,符合凋亡表现.结论:坐骨神经损伤3d腰4～腰6节段脊髓背角浅层神经元发生了paraptosis形式程序性细胞死亡.     

脊髓慢性压迫损伤动物模型实验研究

目的：建立一种理想、实用的慢性脊髓压迫模型,为进一步研究慢性压迫性脊髓损伤的病理生理机制奠定基础。方法利用自行设计一种脊髓压迫装置制作大鼠慢性压迫模型,通过术后大鼠后肢运动功能BBB评分、X线片、脊髓HE染色评价该模型的可靠性。结果 X线片示1周脊髓受压程度约21%,3周后脊髓受压程度58%。脊髓功能受损存在一定的隐匿性,3周压迫组 BBB评分与对照组无明显差异（P＝0.193）,6、9周压迫组BBB评分持续降低,3个压迫组间存在显著差异（P＜0.05）。HE染色示受压脊髓灰质神经元丢失,白质脱髓鞘改变,病变随受压时间的延长逐渐加重,3组间脊髓前角神经元密度存在显著性差异（P＜0.05）。结论此装置较好地模拟了慢性脊髓压迫症的临床特征,具有取材方便,方法简单、科学、重复性强的优点。     

细胞凋亡在脊髓损伤中作用的实验研究

目的 探讨细胞凋亡在脊髓损伤发病机理中的作用。方法 采用原位末端标记法,对大鼠脊髓损伤不同时间脊髓组织中凋亡细胞的数目和部位进行观察和分析,并作正常对照。结果 损伤后灰质和白质均检测到凋亡细胞,神经元凋亡少见,胶质细胞凋亡多见。细胞凋亡发生在损伤后 12 h～ 4周,以 4d时达到高峰,至 4周时渐趋于正常。结论 大鼠脊髓损伤后神经元和胶质细胞均发生细胞凋亡,而以胶质细胞凋亡常见。     

脊髓损伤后细胞凋亡及iNOS的表达

目的研究大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的特点与诱生型一氧化氮合酶 (induciblenitricoxidesynthase,iNOS)的表达规律以及两者之间的关系。方法成年SD大鼠随机分为 3组 ,分别造成轻、中、重度脊髓急性损伤模型 ,于损伤后不同时间点 (4h、8h、1d、3d、7d、1 4d、2 1d)处死。用HE染色观察损伤脊髓组织病理变化 ,用免疫组化染色检测iNOS、Bax阳性细胞 ,TUNEL法标记凋亡细胞。结果HE染色镜检发现脊髓组织病理学改变随着损伤程度的增加而加重。免疫组化结果显示正常对照组及单纯椎板切除组神经元、神经胶质细胞、室管膜细胞、血管内皮细胞极少量表达iNOS ;损伤后 8小时上述细胞iNOS表达增加 ,7天达高峰 ,1 4天仍较明显 ,2 1天降低。Bax表达及TUNEL标记阳性细胞的时间分布特点与iNOS相似 ,7天达高峰 ,阳性细胞以白质中胶质细胞为主。iNOS表达与脊髓损伤程度及神经细胞凋亡指数间存在正相关 (r=0 41 4 ,P <0 0 1 ;r=0 854 ,P <0 0 1 )。结论大鼠脊髓损伤后iNOS和Bax表达增强 ,凋亡神经细胞大量出现。iNOS表达与脊髓原发损伤程度及损伤后神经细胞凋亡指数间存在正相关     

大鼠慢性压迫性脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白的表达及意义

目的：探讨大鼠慢性压迫性脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化，并研究GFAP与压迫程度的关系．以及对脊髓功能恢复的影响。方法：通过制作Wistar大鼠CCSCI模型，分成A组（假手术对照组）、B组（椎管侵占率25％压迫组）和C组（椎管侵占率50％压迫组），结合大鼠的生物行为评分，应用免疫组织化学SABC法，分别于术后1、2、3、5、8、12周检测各组脊髓组织中GFAP蛋白表达的灰度值差异。结果：GFAP表达在3周时达高峰，同时间点A组表达最低，C组最高。BBB评分显示术后3周内压迫组脊髓功能恢复较快。结论：GFAP在CCSCI中的表达水平与压迫程度有关，适度的GFAP表达增高和胶质化反应有助于大鼠脊髓功能的恢复。     

兔慢性颈脊髓压迫减压术后凋亡基因bcl-2和bax的表达

目的:通过观察兔慢性颈脊髓压迫症动物模型脊髓减压术后bcl-2和bax的表达,以期了解脊髓减压术治疗慢性颈脊髓压迫症的作用机制。方法:21只患有慢性颈脊髓压迫症的中国大白兔,改良Tarlov运动功能评分均为3分,随机分为两组:①减压组15只:退出螺钉进行减压。其中1只兔发生急性脊髓损伤,改良Tarlov运动功能评分降至1分,排除实验。②压迫组6只:不施行减压术。另取6只无神经功能障碍的健康大白兔作为正常对照组。分别在减压后第1,7,15,30,60天,观察减压术后脊髓的细胞凋亡和凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果:脊髓减压术后凋亡细胞逐渐减少。脊髓减压术后第1天,bcl-2和bax阳性细胞均较减压前增多。减压后第7天,bcl-2阳性细胞明显增多,bax阳性细胞减少。减压后第15,30天和第60天,bcl-2和bax阳性细胞均逐渐减少。至减压后第60天,bcl-2和bax阳性细胞表达与正常对照组相似。结论:脊髓减压术能有效抑制神经细胞凋亡。     

脊髓缺血再灌注损伤中即早基因表达及细胞凋亡的研究

目的 细胞凋亡是受一些基因控制的。很多因素可激活这些基因而导致细胞凋亡。研究脊髓缺血再灌注损伤(SCⅡ)后即早基因(c-fos、c-jun)表达的变化和细胞凋亡。方法 制作SCⅡ动物模塑，采用光镜、荧光显微镜、激光多普勒超声、免疫组化等技术，研究SCⅡ后即早基因(c-fos、c-jun)表达的变化和细胞凋亡。结果 缺血30min，血灌流量平均下降85．37％，再灌流即刻血灌流量迅速升高，再灌流10min左右达到最高点。再灌流30min，血灌流量基本恢复到缺血前的基线水平。以后逐渐降低。缺血的部分再灌注后出现“二次瘫痪”现象。荧光染色发现缺血再灌注后脊髓神经细胞有凋亡的形态学改变：如核固缩、边聚等。实验组动物脊髓神经细胞核中出现棕色c-fos和c-jun的阳性表达产物，对照组仅有轻微c-fos和c-jun表达。结论 脊髓缺血一定时间后恢复血液供应，可以发生再灌注损伤。脊髓缺血再灌注后c-fos和c-jun的表达均增加，而且在SCⅡ后细胞死亡以凋亡为主，c-fos和c-jun可能参与了I／R损伤诱导的神经细胞凋亡。     

电针对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的探讨电针对脊髓损伤后细胞凋亡的影响。方法230～280g雄性SD大鼠42只,随机分为模型组、电针治疗组、甲基强的松龙治疗组各12只及假手术组6只。采用改良的Allen's垂击法致大鼠脊髓(T10)中度损伤,损伤后即刻分别进行督脉电针或甲基强的松龙治疗,模型组不做处理,于术后6、24h处死动物,假手术组仅切除椎板,不损伤脊髓。采用TUNEL染色法观察细胞凋亡,并进行图像定量统计学分析。结果电针和甲基强的松龙均可显著减少TUNEL阳性细胞数。结论电针可抑制脊髓损伤后细胞凋亡,减轻脊髓继发性损伤,有利于神经功能的恢复。     

三七总皂甙对大鼠脊髓损伤后行为学变化及细胞凋亡的影响

目的：观察三七总皂甙对大鼠脊髓损伤细胞凋亡的保护作用并分析其可能的作用途径。 方法：实验于2005—06／11在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。实验共选取64只SD大鼠，随机分为损伤组和三七总皂甙组。每组32只，采用改良Allen’s重物打击法造成大鼠中度脊髓损伤，三七总皂甙组于伤后30min腹腔注射50g／L三七总皂甙（100mg／kg），伤后2，4h用50mg／kg，以后1次／d。剂量200mg/kg，连用12d。损伤组于伤后各时间点腹腔注射等体积生理盐水。观察比较治疗后不同时间大鼠行为评分、斜板试验、组织学检查及脊髓神经细胞凋亡指数变化。 结果：64只SD大鼠全部纳入结果分析。①三七总皂甙组和损伤组大鼠在7d时行为评分分别为2．50&;#177;0．53、1．38&;#177;0．74，14d时分别为3．25&;#177;0．89、1．75&;#177;0．71，两组比较差异有显著性（t=-3．473，-3．742，P〈0．05）。②三七总皂甙组与损伤组1，3，7，14d各时间点斜板最大角度差异均有显著性（t=-4．081，-4．235，-4．245，-4．687，P〈0．05）。③苏木精-伊红染色光镜下发现脊髓组织病理学改变三七总皂甙组明显轻于损伤组。④损伤组大鼠脊髓损伤后1d在灰质及白质中均可见标记阳性细胞，损伤3d后凋亡指数渐增，7d达高峰；三七总皂甙组大鼠脊髓神经细胞凋亡指数较损伤组低，高峰提前，发生在损伤后3d，以后逐渐降低。两组比较差异均有显著性（t=4．196，2.627，7．732，3．547，P〈0．05）。 结论：三七总皂甙能抑制脊髓损伤神经细胞凋亡，对损伤脊髓的神经功能具有保护作用。     

嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后神经元凋亡的影响

目的：了解嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响，探讨嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的机制。方法：成年动物脊髓半切损伤模型，进行嗅鞘细胞和培养液移植，在伤后1～14d，应用苏木精一伊红和TUNEL法观测神经细胞存活和细胞凋亡变化。结果：脊髓半切后，神经元数目随时间下降。伤侧和对侧分别在伤后1d和2d，出现以神经元为主的凋亡高峰。7d出现以胶质细胞为主的凋亡高峰，14d凋亡下降。嗅鞘细胞移植可明显降低脊髓损伤后神经细胞凋亡，促进神经细胞存活。     

大鼠脊髓损伤后细胞凋亡及Caspase-3、Fas的表达和意义

目的：研究脊髓损伤后神经细胞凋亡表达及Caspase-3、Fas的表达变化规律.方法：使用改良Allen法制作大鼠急性SCI模型,实验分对照组（脊髓未受打击）和损伤5个组,致大鼠脊髓（T9、T10）中度撞击损伤,损伤后6h、1d、3d、7d、15d取材,共分6组,采用HE染色、荧光Hoechst33258染色、原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导DUTP标记法（TUNEL）对损伤脊髓组织进行标记;免疫组化方法测Caspase-3及凋亡因子Fas,半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）测定各时间段Caspase-3的表达变化.结果：大鼠急性损伤后TUNEL标记阳性凋亡细胞6h开始出现,多位于脊髓白质;3d达到高峰,在灰质和白质均有表达,7d后开始降低,持续15d;免疫组化检测Fas表达的阳性细胞6h开始增高,2d达到高峰,15d下降;Caspase-3 mRNA 6h开始增高,3d达到高峰,7d后恢复正常.免疫组化检测Caspase-3表达的阳性细胞与TUNEL标记阳性凋亡细胞出现的时限相似.结论：脊髓损伤后存在神经细胞凋亡现象发生,Caspase-3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节.Caspase-3的表达和Fas的变化有一定的相关性.     

大鼠脊髓损伤后细胞凋亡特点及其与一氧化氮合酶表达的相关性

目的探讨脊髓损伤后细胞凋亡特点与诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达规律及二者之间的关系.方法成年大鼠32只,随机分为8组(每组4只)单纯椎板切除对照组和脊髓损伤后7个时间点处死组(4、8 h和1、3、7、14、21 d).用免疫组化染色检测iNOS、p53阳性细胞,原位末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞.另取大鼠32只进行同样分组,用Western blot analsis法检测iNOS表达.结果免疫组化结果显示单纯椎板切除对照组神经元、神经胶质细胞、室管膜细胞、血管内皮细胞极少量表达iNOS;损伤后8 h上述细胞iNOS表达增加,7 d达高峰,14 d仍较明显,21 d降低.p53表达及TUNEL标记阳性细胞的时间分布特点与iNOS相似,7d达高峰,阳性细胞以白质中胶质细胞为主,主要分布于损伤部及相邻区.iNOS的Western blot灰度扫描数值时间变化曲线与免疫组化阳性细胞率时间变化曲线一致.iNOS表达与神经细胞凋亡指数及p53表达存在正相关(r＝0.854,P＜0.01;r＝0.951,P＜0.01).结论大鼠脊髓损伤后iNOS与p53表达增强,凋亡神经细胞大量出现.iNOS表达与脊髓损伤后神经细胞凋亡指数间存在正相关.     

三七总皂甙对大鼠脊髓损伤后行为学变化及细胞凋亡的影响

目的:观察三七总皂甙对大鼠脊髓损伤细胞凋亡的保护作用并分析其可能的作用途径。方法:实验于2005-06/11在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。实验共选取64只SD大鼠,随机分为损伤组和三七总皂甙组,每组32只,采用改良Allen’s重物打击法造成大鼠中度脊髓损伤,三七总皂甙组于伤后30min腹腔注射50g/L三七总皂甙(100mg/kg),伤后2,4h用50mg/kg,以后1次/d,剂量200mg/kg,连用12d。损伤组于伤后各时间点腹腔注射等体积生理盐水。观察比较治疗后不同时间大鼠行为评分、斜板试验、组织学检查及脊髓神经细胞凋亡指数变化。结果:64只SD大鼠全部纳入结果分析。①三七总皂甙组和损伤组大鼠在7d时行为评分分别为2.50±0.53、1.38±0.74,14d时分别为3.25±0.89、1.75±0.71,两组比较差异有显著性(t=-3.473,-3.742,P<0.05)。②三七总皂甙组与损伤组1,3,7,14d各时间点斜板最大角度差异均有显著性(t=-4.081,-4.235,-4.245,-4.687,P<0.05)。③苏木精-伊红染色光镜下发现脊髓组织病理学改变三七总皂甙组明显轻于损伤组。④损伤组大鼠脊髓损伤后1d在灰质及白质中均可见标记阳性细胞,损伤3d后凋亡指数渐增,7d达高峰;三七总皂甙组大鼠脊髓神经细胞凋亡指数较损伤组低,高峰提前,发生在损伤后3d,以后逐渐降低。两组比较差异均有显著性(t=4.196,2.627,7.732,3.547,P<0.05)。结论:三七总皂甙能抑制脊髓损伤神经细胞凋亡,对损伤脊髓的神经功能具有保护作用。     

胰岛样生长因子1对大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经功能恢复的影响

目的：观察胰岛样生长因子1（IGF－1）对慢性压迫性脊髓损伤后神经功能恢复的影响。方法：50只Wistar雌作大鼠，随机分为正常组，慢性重度（60％），压迫组、减压组、生理盐水、（NS）组及IGF－1组。正常级不做任何处理，其余各组置入平头塑料螺钉对大鼠脊髓进行后路渐进性压迫，于2个月后达到60％左右重度压迫程度，然后减压组、NS组和IGF－1组彻底减压，NS组和IGF－1组分别于减压后1、3、5、7、9d在蛛网膜下腔给予NS和IGF－1（25μl），并于减压后2、4、6、8、10d后肢运动功能评分和检测运动诱发电位（MEP）。结果：压迫组大鼠后肢运动功能障碍，MEP波幅（P1－N1峰峰值）降低，潜伏期延长，IGF－1组大鼠后肢运动功能及MEP波幅及潜伏期有明显的恢复（P＜0．05），且于4－6d后显优于单纯减压组和NS组（P＜0．05）。结论：IGF－1可明显促进慢性压迫性脊髓损伤后大鼠后肢运动功能及MEP波形的恢复。     

电针对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的：探讨电针对脊髓损伤后细胞凋亡的影响，方法：230－280g雄性SD大鼠42只，随机分为模型组，电针治疗组，甲基强的松龙治疗组各12只及假手术组6只，采用改良的Allen's垂击法致大鼠脊髓（T10）中度损伤，损伤后即刻分别进行督脉电针或甲基强的松龙治疗，模型组不做处理，于术后6，24h处死动物，假手术组仅切除椎板，不损伤脊髓，采用TUNEL染色法观察细胞凋亡，并进行图像定量统计学分析。结果：电针和甲基强的松龙均可显减少TUNEL阳性细胞数，结论：电针可抑制 脊髓损伤后细胞凋亡，减轻脊髓继发性损伤，有利于神经功能的恢复。     

复方丹参对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的：观察大鼠脊髓损伤后应用复方丹参对细胞凋亡的影响以进一步探讨其对急性脊髓损伤治疗的可能性。方法：成年大鼠随机分为正常组、脊髓损伤后应用复方丹参组和应用生理盐水对照组，损伤1，2，4周后按改良的联合行为评分(combined behavioral score，CBS)方法评价大鼠双后肢神经功能恢复情况，然后在不同时间点(8h，1，3，7，14，28d)处死。用苏木精-伊红(HE)染色观察损伤脊髓组织病理变化，原位末端标记法(TUNEL法)标记凋亡细胞。结果：HE染色镜检发现脊髓组织病理学改变复方丹参组明显轻于生理盐水组。CBS评分在复方丹参组、生理盐水组7，14，28d时间点间比较差异有显著性意义(t=3．572，4．853，2．495，v=8；P&;lt;0．05或P&;lt;0．01)；复方丹参组、生理盐水组两组均发现凋亡细胞，且神经细胞凋亡指数在生理盐水组、复方丹参组8h，1，3，7，14，28d时间点间比较差异有显著性意义(t=2．533，1．201，3．342，3．027，2．953，2．282，v=18；P&;lt;0．05或P&;lt;0．01)。结论：复方丹参能抑制大鼠脊髓损伤后细胞凋亡，并对其继发性损害有多重的保护作用。