重组人sCR1多克隆抗体制备及纯化鉴定

目的制备原核表达人sCR1多克隆抗体并对其进行鉴定。方法提取人总RNA进行RT-PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a-sCR1。在大肠杆菌中表达人sCR1融合蛋白作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,免疫亲和层析法纯化后,进行SDS-PAGE鉴定分析。结果sCR1表达融合蛋白免疫家兔制备的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1融合蛋白。结论纯化复性后的sCR1融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,并有较高的效价及特异性。为进一步大量表达纯化及临床免疫学检测方法的键立奠定了基础。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达，纯化hIL-24重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS—PAGE分析，同时提取hIL-24真核重组质粒，用以免疫新西兰兔，并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。结果：人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30％，纯化后的蛋白纯度高；原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了抗血清效价达1：640的多克隆抗体。结论：原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体．其多克隆抗体的效价较高。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

肝癌相关基因HTA的重组表达及多克隆抗体的制备

目的将肝癌相关基因HTA进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其作为肝癌导向治疗靶点的可行性及临床意义奠定基础。方法应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到HTA3＋cDNA,再将其克隆到原核表达载体pET21a（＋）-MBP内,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白MBP-HTA,通过Westernblot和ELISA方法检测重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠制备多克隆抗体,并采用ELISA、Westernblot和免疫组化的方法检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了表达MBP-HTA融合蛋白的原核表达质粒pET21a（＋）-MBP-HTA。重组MBP-HTA融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化和Westernblot分析,得到了分子量约为52kDa的目的蛋白。获得了高效价的特异性多克隆抗体,经ELISA检测抗体的效价为1：3200。用Westernblot检测的效价为1：400。免疫组织化学检测表明：肝癌组织中HTA蛋白的阳性表达率明显高于正常肝组织俨〈0．01）。结论成功地制备出抗MBP-HTA多克隆抗体,该抗体有较高的效价和特异性;能用于免疫组织化学的检测,且HTA在肝癌组织中的阳性表达率明显高于正常肝组织。HTA蛋白有望成为肝癌导向治疗的潜在靶点。     

pET28a-Streptag I-SbpA-Ag85B重组质粒的表达与鉴定

目的 应用分子克隆技术获得纳米级Ag85B蛋白并对其进行鉴定和免疫学特性检测.方法 利用S-layer/Streptag I这一具有自我组装能力的纳米模式嵌合结核杆菌分泌的Ag85B蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,并在大肠杆菌中表达Ag85B蛋白,表达后的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定.结果 原核表达重组质粒pET28a-Streptag I-SbpA-Ag85B成功构建,并可在大肠杆菌中诱导表达,得到的Streptag I-Sbpa-Ag85B蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确,重组蛋白能被结核患者血清识别.结论 重组后的Ag85B蛋白具有较强的免疫反应性.所建立的原核表达体系为新型结核疫苗研制提供了一个新的思路.     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备

目的：构建丙型肝炎病毒核心抗原结合蛋白12（HCVCore binding protein,HCBP12）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化HCBP12融合蛋白并制备兔抗HCBP12多克隆抗体。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HCBP12基因片段,插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达载体pET-32a（＋）-HCBP12,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,获得HCBP12融合蛋白的可诱导性表达,并通过SDS-PAGE电泳、Western Blot免疫印迹分析和证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：HCBP12融合蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价〉1512000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论：成功表达、纯化HCBP12融合蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗HCBP12多克隆抗体,为研究HCBP12蛋白的生物学功能及丙肝的临床治疗提供了重要的实验工具。     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase，SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB (DE3)进行诱导表达，SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达；对影响可溶性表达的4个因素，即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A₆₀₀)和诱导时间进行了优化。结果发现在宿主菌A₆₀₀达到1.0时加入0.4 mmol·L^-1 IPTG，在20 ℃诱导培养8 h表达的可溶性蛋白量最高，约占细胞总蛋白的35.6%。用Ni²⁺亲和色谱法纯化表达产物，纯化蛋白产率达到12.3 mg·L^-1。将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清，ELISA测定效价为1∶24 300，且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原，获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体，为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础。     

EGFR/HER2联合多肽表位疫苗的构建及体液免疫学分析

构建以乙肝病毒核心抗原(HBcAg)为载体的带有1个EGFR和2个HER2的模拟B细胞表位多肽的融合表达质粒pET28a/HBcAg-△n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫BALB/c小鼠获得抗目的蛋白的抗体。采用PCR法将3个模拟表位插入HBc序列的第78～79位,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21(DE3)作宿主菌表达出融合蛋白HBHE,纯化后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。测序结果表明,重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白表达正确,ELISA检测到高滴度抗体。以HBcAg为载体的B表位被成功表达和纯化,获得高滴度的与3个B表位结合的抗体,为进一步研究HER家族成员联合多肽表位疫苗的广谱抗肿瘤作用奠定了基础。     

霍乱毒素B亚单位与p277融合基因在大肠杆菌中表达及免疫分析

为了增强多肽表位的免疫原性,构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)和p277的融合基因CTB-p277,将该融合基因克隆到pET28a( )中,获得原核表达载体pET28a-CTB-p277;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经2%的乳糖诱导5 h后的表达产物用12%的SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,融合蛋白占全菌蛋白约40%,且主要以包含体的形式存在。包含体经洗涤、裂解,用DEAE纤维素离子交换纯化,可以获得99.1%的重组蛋白。重组蛋白的包含体经复性后,在体外可以自组装成五聚体。重组蛋白免疫KK-Ay小鼠后,ELISA的分析表明可以产生抗p277的抗体。血糖和体重的测定结果显示,给药组小鼠的血糖有明显的降低,体重也有相应的减轻。同时GM1-ELISA的检测表明,CTB-p277在体外可以和神经节苷脂GM1(Monosialoganglioside)特异结合,具有生物活性。     

一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测

通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造，构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a—T1-GFP，重组质粒在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白His-T1-GFP，经组氨酸亲和层析纯化后，用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His—T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a—T1-GFP，融合蛋白His—T1-GFP在大肠杆菌EcoliB L21（DE3）中表达率为20％。经组氨酸亲和纯化，得到纯度达85％的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP，动物实验表明融合蛋白His—T1-GFP能够有效跨过血脑屏障，主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了-种新的穿膜肽-T1，为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

以乙肝病毒核心抗原HBcAg为载体的utrophin抗体的制备

目的构建以乙肝病毒HBc为载体的带有utrophin的两个B细胞表位多肽的融合表达质粒pHBc-2UB,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫新西兰大白兔获得抗utrophin的抗体。方法通过DNAstarⅡ模拟出utrophin的两个显著优势的B表位。用PCR法合成片段插入HBcAg序列的78位,将该合成片段克隆至pET28a载体中,构建重组表达质粒,表达出融合蛋白HBc-2UB,纯化后免疫新西兰白兔。再将该合成片段克隆至pGEX4T-2载体中,构建重组表达质粒,表达出融合蛋白GST-2UB,用于检测两个表位的抗体。结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白表达正确,ELISA检测到高滴度抗体。结论以HBc呈现utrophin的B表位被成功表达和纯化,获得高滴度的与两个B表位结合的抗体,为utrophin检测和DMD治疗药物研究打下了基础。     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3V_H-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF,并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因,克隆至表达载体pET22 b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性,凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性,并能活化FⅩ、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,hu3D3VH/tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性,为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

诱生型一氧化氮合酶抗体的制备与初步应用

目的制备诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)特异性抗体并应用于iNOS检测。方法将iNOSN端片段装入原核表达载体pET 2 8a(+) ,在大肠杆菌BL2 1中表达 ,两步法纯化目的蛋白 ,使用纯化蛋白制备iNOS多克隆抗体。获得的抗血清用于小鼠巨噬细胞及小鼠脑缺血模型中iNOS的检测。结果得到具有较高表达量的融合蛋白 ,经两步纯化获得iNOSN端融合蛋白纯品 ,将此蛋白免疫家兔 ,得到iNOS多克隆抗体 ,Westernblot分析表明该抗体不与nNOS、eNOS交叉反应 ,而能检测组织、细胞中的iNOS。结论原核表达iNOSN端片段制备的iNOS抗体具有很好的反应性及特异性