罕见非嗜肺军团菌的鉴定

目的对非嗜肺军团菌进行分离培养和分子分型鉴定。方法依据《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(2006),对广州市海珠区公共场所集中空调冷却塔水进行军团菌检测。用常规分离培养法检测军团菌,进一步运用生化和血清学凝集试验、实时荧光PCR技术及16S rRNA基因、mip基因测序对菌株进行种属鉴定。结果在BCYE平板上生长,在L-半胱氨酸缺失的BCYE平板及血平板中均不生长的菌株,通过实时荧光PCR技术及16S rRNA基因、mip基因测序鉴定为菲氏军团菌4株和釜山军团菌1株,这是本区首次从集中空调冷却塔水中检出的非嗜肺军团菌。结论运用常规分离培养方法和分子生物技术相结合检测出菲氏军团菌和釜山军团菌(国内罕见)等多种军团菌种,同时提示海珠区公共场所集中空调冷却塔水存在非嗜肺军团菌污染;16S rRNA基因、mip基因核酸测序鉴定有助于发现军团菌新种。     

三种分子分型技术在嗜肺军团菌分型中的应用与评价

目的对脉冲场凝胶电泳方法 （PFGE）、基因序列分型（SBT）和mip基因分型方法在嗜肺军团菌分型研究中的分辨力和潜在价值进行比较和论述。方法采用PFGE、SBT和mip基因分型方法对29株嗜肺军团菌和1株标准菌株ATCC33153进行分型比较。结果 PFGE可将30株嗜肺军团菌分为5大类群,19个PFGE型,分辨力为0.9586;SBT可分为22个ST型,分辨力为0.9609;mip基因分型可分为9个型别,分辨力为0.8344。血清型LP1和LP14菌株具有相同的PFGE和mip基因型别,相同或相近的SBT型别。结论 SBT较PFGE具有稍高的分辨力,适用于全球数据库比对和进化亲缘关系的研究,结合PFGE和SBT分型方法有利于流行病学溯源分析。     

福建省40株军团菌毒力基因lvh及rtxA携带情况分析

目的了解福建省中央冷却塔水分离的40株军团菌毒力基因lvh及rtx A携带情况。方法 40株军团菌菌株均经过常规培养分离鉴定、乳胶凝聚实验及血清凝聚实验,并用军团菌属特异性基因16S rRNA以及嗜肺军团菌特异性诊断基因mip进行PCR复核鉴定,然后进行lvh及rtx A基因扩增。结果 lvh的总阳性率为60.0%,rtx A的总阳性率为65.0%,lvh+rtx A+占52.5%,lvh+rtx A-占7.5%,lvh-rtx A+占12.5%,lvh-rtx A-占27.5%。不同亚型的菌株存在不同的毒力基因携带模式。结论本省环境分离菌株具有比较高的潜在感染性,应加强外环境中军团菌的监测,防控军团菌病的发生。     

军团菌KatB毒力基因聚合酶链反应检测技术的建立及应用

为建立军团菌KatB毒力基因聚合酶链反应(PCR)检测方法 ,根据GenBanK公布的嗜肺军团菌核苷酸序列合成军团菌毒力基因KatB的特异引物,采用PCR方法 对2005-2007年天津市中央空调冷却塔分离的嗜肺军团菌、杜氏军团菌、博氏军团菌、长滩军团菌等菌株进行了军团菌毒力基因KaLB的检测.结果 显示,本室分离的16株致病军团菌中有9株嗜肺军团菌和1株杜氏军团菌扩增出了2.7 kb的KatB基因片段,其余菌株未扩增出该基因片段.本研究成功建立了军团菌毒力基因KatB的PCR检测方法 ,为军团菌的毒力研究奠定了基础.     

杭州市某区星级酒店集中空调冷却水及冷凝水中军团菌表型及基因分型特征研究

目的了解杭州市某区星级酒店集中空调系统军团菌优势菌群和优势基因特征。初步建立军团菌PFGE分型数据库,为该地区军团菌分子流行病学调查提供重要依据。方法采用传统的血清分型结合PFGE聚类分析的方法,应用BioNumerics 6.0软件进行聚类分析。结果 75株军团菌,血清分型结果嗜肺军团菌6种、非嗜肺军团菌3种,其中88%为嗜肺军团菌(66/75),以LPl型为主。来源为冷却水占85.33%(64/75),冷凝水仅占14.67%(11/75)。经聚类分析分为39种PFGE型,菌株间相似系数在29.9%～100.0%。每种带型包含1株～10株菌,存在13组带型一样的菌株,结论 2008年-2017年从杭州市某区星级酒店集中空调系统分离的军团菌呈多态性分布,不同年份分离的军团菌存在同源性菌株。     

辽宁省空调冷却水中非嗜肺军团菌基因分型与毒力初探

目的了解辽宁省集中空调冷却水中检出的非嗜肺军团菌基因分型,并对其携带的毒力基因情况进行调查。方法采用16SrDNA和mip基因作为引物对2013～2017年辽宁省各大公共场所空调冷却水中分离到的9株非嗜肺军团菌基因分型鉴定,同时对它们分泌的系统毒力岛基因组进行了检测。结果检出4株茴芹军团菌(L.anisa),2株吉斯特军团菌(L.geestiana),1株沃斯利军团菌(L.worsleiensis),2株红光军团菌(L.rubrilucens);9株非嗜肺军团菌中有8株携PAI毒力基因。结论辽宁省公共环境集中空调冷却系统中存在非嗜肺军团菌,以茴芹军团菌居多,且多数分离菌株携带毒力基因,是可致病性病源菌。     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的 建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因.方法 嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给.利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等.结果 该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现.检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会.结论 TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测.     

云南省首例人感染猪链球菌病的病原学分析

目的 对猪链球菌菌株进行鉴定,了解其病原学特征.方法 对菌株进行了菌落形态、生化鉴定、血清凝集、PCR 检测、16S rRNA 细菌种属鉴定、PFGE 检测和MLST 分型.结果 菌落形态、生化鉴定、血清凝集、16S rRNA 细菌种属鉴定,证明此菌株为猪链球菌2 型;经PCR 检测16SrRNA 和毒力基因均为阳性;PFGE 检测结果表明此株菌同3 株参考菌株相似性很低;MLST 分型属于高致病性ST1 型.结论 此次分离到菌株的为云南省首例人感染的猪链球菌2 型,是强毒力株.     

工业循环冷却塔水嗜肺军团菌分离株分子生学特性研究

目的 了解钢铁企业工业循环冷却塔水中的嗜肺军团菌污染状况及菌株分子生物学特性.方法 于2011年3月-2012年9月对邯郸某钢铁厂相对固定的车间冷却塔水进行连续监测,进行嗜肺军团菌的定量分离培养,对分离到的菌株进行血清分型、脉冲场凝胶电泳分型、基因序列分型、毒力基因(lvh、rtxA)检测.结果 共检测117份水样,其中20份水样检出嗜肺军团菌,检出率为17.1％;菌落总数为100～50000 CFU/L,中位数为12000 CFU/L;共分离到嗜肺军团菌23株,血清型包括Lp1、Lp3、Lp5、Lp6、Lp8,并以Lp1为主(占36.1％,9/23).23株嗜肺军团菌PFGE分型得到19种不同带型,其中15种带型为国内首次发现.23株嗜肺军团菌分成20个SBT型别,有12个型别为本研究新发现.23株菌中,lvh、rtxA基因阳性的分别有20、22株,两种毒力基因全部阳性的有19株.结论 钢铁企业的冷却塔水存在嗜肺军团菌污染,菌型呈现基因多态性,同时具有独特的基因组成,并普遍具有毒力.     

工业循环冷却塔水嗜肺军团菌分离株分子生物学特性研究

目的了解钢铁企业工业循环冷却塔水中的嗜肺军团菌污染状况及菌株分子生物学特性。方法于2011年3月—2012年9月对邯郸某钢铁厂相对固定的车间冷却塔水进行连续监测,进行嗜肺军团菌的定量分离培养,对分离到的菌株进行血清分型、脉冲场凝胶电泳分型、基因序列分型、毒力基因(lvh、rtx A)检测。结果共检测117份水样,其中20份水样检出嗜肺军团菌,检出率为17.1%;菌落总数为100~50 000 CFU/L,中位数为12 000 CFU/L;共分离到嗜肺军团菌23株,血清型包括Lp1、Lp3、Lp5、Lp6、Lp8,并以Lp1为主(占36.1%,9/23)。23株嗜肺军团菌PFGE分型得到19种不同带型,其中15种带型为国内首次发现。23株嗜肺军团菌分成20个SBT型别,有12个型别为本研究新发现。23株菌中,lvh、rtx A基因阳性的分别有20、22株,两种毒力基因全部阳性的有19株。结论钢铁企业的冷却塔水存在嗜肺军团菌污染,菌型呈现基因多态性,同时具有独特的基因组成,并普遍具有毒力。     

Molecular evidence for the ubiquitous presence of Legionella species in Dutch tap water installations

Our aim was to investigate the occurrence and identity of Legionella spp. in Dutch tap water installations using culture, real-time PCR and sequence analysis. The PCR assays used were a 16S rRNA gene based PCR with both a Legionella species specific probe and a L. pneumophila specific probe and a L. pneumophila-specific PCR based on the sequence of the mip gene. A total of 357 water samples from 250 locations in The Netherlands was investigated. The detection rates of Legionella spp. were 2,2% (8 of 357) by culture, and 87,1% (311 of 357) by PCR. The majority of samples was found to contain Legionella species other than L. pneumophila. These comprised of Legionella Like Amoebal Pathogens (LLAPs), L. busanensis, L. worsliensis and others. Fourteen (3,9%) samples were positive for L. pneumophila by either culture, 16S rRNA based PCR and/or mip based PCR. It is apparent from this study that Legionella spp. DNA is ubiquitous in Dutch potable water samples. Our findings further suggest that LLAPs and viable but nonculturable (VBNC) Legionella represent a large proportion of the population in man-made environments.     

Genetic speciation of environmental Legionella isolates in Thailand

Legionella-like organisms were isolated during 2003-2007 from various water resources by culturing on selective media of Wadowsky-Yee-Okuda agar. The 256 isolates were identified as belonging to the Legionella genus based on detection of 108bp PCR product of the 5S rRNA gene, while the inclusion as Legionella pneumophila were confirmed by PCR detection of a specific mip gene region of 168bp. The 50 isolates, identified as non-pneumophila, were then subjected to DNA tree analysis, based on mip gene of ～650bp and rnpB genes product ranged from 304 to 354bp. Phylogenetic tree was constructed to predict their species in relative to the available database. The isolates of which their speciation, based on those two genes were inconclusive, were then investigated for the almost full-length of 16S rRNA sequences. The isolates were assigned as 16 known Legionella species, and proposed seven novel species based on their unique 16S rRNA sequence.     

Molecular evidence for the ubiquitous presence of Legionella species in Dutch tap water installations

Our aim was to investigate the occurrence and identity of Legionella spp. in Dutch tap water installations using culture, real-time PCR and sequence analysis. The PCR assays used were a 16S rRNA gene based PCR with both a Legionella species specific probe and a L. pneumophila specific probe and a L. pneumophila-specific PCR based on the sequence of the mip gene. A total of 357 water samples from 250 locations in The Netherlands was investigated. The detection rates of Legionella spp. were 2,2% (8 of 357) by culture, and 87,1% (311 of 357) by PCR. The majority of samples was found to contain Legionella species other than L. pneumophila. These comprised of Legionella Like Amoebal Pathogens (LLAPs), L. busanensis, L. worsliensis and others. Fourteen (3,9%) samples were positive for L. pneumophila by either culture, 16S rRNA based PCR and/or mip based PCR. It is apparent from this study that Legionella spp. DNA is ubiquitous in Dutch potable water samples. Our findings further suggest that LLAPs and viable but nonculturable (VBNC) Legionella represent a large proportion of the population in man-made environments.     

环境军团菌的分离培养及鉴定方法探讨

目的 建立地表环境水军团菌的分离培养及种属鉴定方法.方法 在广州市内8个公园中采取了44份地表湖泊水样,进行军团菌的分离培养.同一湖泊来源的分离株以扩增片段长度多态性(amplifled fragment length polymorphism,AFLP)进行同源性分析;进一步的种属鉴定采用生化血清学鉴定、细胞脂肪酸成分分析、16 S rRNA基因测序、巨噬细胞感染增强蛋白(mip)基因测序等多种手段相结合的方法进行分析和比较.结果 8个公园内的27份水样分离出军团菌,阳性率为61.36%.初步分离的108个菌株,经AFLP同源性鉴定,得到不同菌株31株,包括嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)20株,橡树岭军团菌(Legionella oakridgensis)1株,圣海伦军团菌(Legionella sainthelensi)1株,长滩军团菌(Legionella longbeachae)4株,菲氏军团菌(Legionella feeleii)5株.其中,嗜肺军团菌可直接通过常规的生化实验、血清学鉴定得到种属鉴定结果.但包括细胞脂肪酸成分分析在内的表型鉴定方法,均存在不同程度的不稳定性因素.结论 生化实验、血清学鉴定、细胞脂肪酸成分分析等能够为军团菌的分类学鉴定提供有价值的资料,但最终的种属鉴定仍必需依赖于16 SrRNA基因或mip基因的序列分析.     

2007年上海市部分嗜肺军团菌血清1型菌株PFGE分型研究

[目的]研究2007年上海市公共场所部分空调冷却塔水中分离出来的嗜肺军团菌1型（L01）的基因特征。[方法]从空调冷却塔水中检测到26株Lp1嗜肺军团菌后,使用脉冲场凝胶电泳（pulsed－field gel electrophorefiifl,PFGE）技术对酶切后的L01军团菌全染色体DNA进行电泳获得指纹图谱,并用BioNumerics软件对其进行聚类分析。[结果]26株LO1军团菌可分为15个PFGE型。菌株间相似性系数在30．00％～100．00％之间不等,大部分菌株的PFGE型别差异明显,无优势型别。大部分PFGE型别的菌株来源场所单一;而大部分同一场所来源的军团菌菌株为相同的PFGE型。[结论]2007年上海市公共场所部分空调冷却塔水中分离出来的Lp1军团菌呈现基因多样性。     

脉冲场凝胶电泳分型方法追溯霍乱传染源

目的　了解四川省 2 0 0 4年霍乱疫情分离菌株与常规监测的外环境和水产品中霍乱弧菌分离株之间的遗传相关性 ,追溯传染源 ,为预测疫情和制定防治措施提供依据。方法　O139群霍乱弧菌编码脂多糖 (LPS)特异性基因引物聚合酶链反应 (PCR)复核菌株 ,霍乱毒素 (CT)基因引物PCR检测霍乱毒力基因 ,脉冲场凝胶电泳 (PFGE)进行菌株的分子分型。结果　 2 5株受试菌株LPS基因 2对引物PCR结果均为阳性。所有 6株河水中分离的菌株均为CT基因阴性 ,其余均具有CT基因。 2 4株菌PFGE可分为 13个型。结论　LPS基因PCR检测结果从分子水平证实受试菌株均为O139群霍乱弧菌。河水中分离的 6株菌是非产毒株 ,其余菌株均具有致病性。环境水分离的O139群非产毒株之间以及产毒株与非产毒株之间遗传相关性较远。产毒株之间具有较高的同源性。四川省从甲鱼分离的O139群霍乱弧菌与同期流行的O139群霍乱弧菌分型的带型一致 ,在国内首次以分子流行病学分析提示甲鱼可能是四川省近年霍乱疫情主要传染来源之一。     

多重PCR快速检测空调冷却塔水中军团菌

目的 传统的方法分离培养军团菌，时间长，价格贵，培养较困难，本文建立多重PCR方法，快速检测空调冷却塔水中军团菌属和嗜肺军团菌种。方法 利用军团菌属保守基因片段16SrRNA和嗜肺军团型菌巨噬细胞感染增强因子（mip）基因序列的特异性引物，对空调冷却塔水样中分离的疑似军团菌株进行特异性扩增，并且为了增强敏感性，运用递减温度PCR扩增。结果：PCR扩增的阳性结果与生化培养和血清学鉴定为军团菌的菌株结果—致。结论：与传统的分离培养方法相比，多重PCR方法检测军团菌，快速敏感，成本低，具有较好的特异性。     

湖南省2005年-2010年霍乱疫情分离株的毒力基因PCR及PFGE分型分析

目的:了解2005年-2010年湖南省霍乱疫情分离到的O139群霍乱弧菌菌株的病原学特征,研究疫情分离株之间的克隆相关性。方法:采用K-B法进行药敏试验;聚合酶链反应(PCR)检测ctxAB毒力基因;脉冲场凝胶电泳对疫情分离代表株进行PFGE分型分析。结果:33株霍乱弧菌对强力霉素、复方新诺明的耐药率较高,分别为39.39%和75.76%,对环丙沙星、诺氟沙星以及丁胺卡那100%敏感;毒力基因的PCR结果显示为所有疫情分离的O139霍乱弧菌均为产毒株,即霍乱肠毒素基因ctxAB阳性;24株分离自2005年和2010年的7起疫情里的O139霍乱弧菌进行PFGE分型及聚类分析后,共分为3个PFGE带型,所有菌株的带型相似率在83%～100%之间。结论:湖南省2005年-2010年霍乱疫情以O139群为主,引起疫情的全部为产毒株,不同年份不同地区之间霍乱疫情的分离菌株之间存在着紧密相关的流行克隆群,对分离菌株进行耐药性监测和进一步的分子分型分析,有助于霍乱的主动监测和传染来源的追踪。     

一起食物中毒事件的金黄色葡萄球菌分子分型研究

目的 运用分子分型方法分析一起在广州发生的由金黄色葡萄球菌所致的重大食物中毒事件,并进行溯源.方法 在常规分离的基础上,采用荧光定量PCR检测所获得的金黄色葡萄球菌特异耐热核酸酶基因(nuc)、耐甲氧西林决定基因(mecA)和其他5种肠毒素基因(sea,seb,sec,sed,see),并对16 S rRNA核苷酸进行序列扩增和使用DNAStar MegAlign 5.0软件分析,同时应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和BioNumerics Version 4.0软件进行聚类分析.结果 10株金黄色葡萄球菌特异性nuc基因均为阳性,其中7株分离菌的肠毒素sea,seb基因为阳性,分离菌可以分为4个16 SrRNA型别和5个PFGE型别.结论 本次食物中毒事件至少由3株以上亲缘关系相近的产毒金黄色葡萄球菌污染食物所致,分子分型方法可以为疫情溯源提供分子流行病学证据和支持.