人bcl-xl转基因小鼠外源基因的复制及其传代稳定性

背景:近年的研究表明,在脑缺血再灌注损伤机制中,bcl-xl基因可能起着抗神经细胞凋亡的脑保护作用。目的:观察转bcl-xl基因小鼠外源基因的复制及传代稳定性问题。设计:以基因为观察对象。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科和湖北省农科院畜牧兽医研究所。材料:实验于1999-10/2001-04在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。选取昆明种小鼠4只。方法:通过显微注射法建立转人bcl-xl基因小鼠,将PCR及Southern-blot检测整合阳性的小鼠与正常鼠交配并传代,然后检测子代小鼠外源基因的表达情况。作Southern-blot检测,结果证实第10,13,5,6号小鼠为整合阳性小鼠。以4只整合阳性小鼠作为首建者,分别与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代,所生子代记为F1代,各系列的F1～F4代均采用阳性转基因小鼠与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代方法,保持其杂合子形式。主要观察指标:检测外源基因的复制和传代的稳定性。结果:10号小鼠传代过程中外源基因PCR检测阳性率保持稳定,符合孟德尔遗传规律,表明外源基因能够稳定遗传。6号小鼠PCR阳性率呈轻微下降趋势,但仍能够保持相对稳定遗传。13号和5号小鼠PCR阳性率均呈明显的下降趋势,表明这2只小鼠存在外源基因遗传丢失现象。结论:应用基因组DNA做目的基因,可获得能够稳定遗传的转基因鼠系。     

人bcl-xl转基因小鼠外源基因的复制及其传代稳定性

背景：近年的研究表明。在脑缺血再灌注损伤机制中，bcl-xl基因可能起着抗神经细胞凋亡的脑保护作用。 目的：观察转bcl-xl基因小鼠外源基因的复制及传代稳定性问题。 设计：以基因为观察对象。 单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科和湖北省农科院畜牧兽医研究所。 材料：实验于1999-10／2001-04在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。选取昆明种小鼠4只。 方法：通过显微注射法建立转人bcl-xl基因小鼠，将PCR及Southem-blot检测整合阳性的小鼠与正常鼠交配并传代，然后检测子代小鼠外源基因的表达情况。作Southern-blot检测，结果证实第10，13，5，6号小鼠为整合阳性小鼠。以4只整合阳性小鼠作为首建者，分别与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代，所生子代记为F1代，各系列的Fl～F4代均采用阳性转基因小鼠与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代方法，保持其杂合子形式。主要观察指标：检测外源基因的复制和传代的稳定性。 结果：10号小鼠传代过程中外源基因PCR检测阳性率保持稳定，符合盂德尔遗传规律，表明外源基因能够稳定遗传。6号小鼠PCR阳性率呈轻微下降趋势，但仍能够保持相对稳定遗传。13号和5号小鼠PCR阳性率均呈明显的下降趋势，表明这2只小鼠存在外源基因遗传丢失现象。 结论：应用基因组DNA做目的基因，可获得能够稳定遗传的转基因鼠系。     

精子载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达

利用精子载体技术通过人工授精观察人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达，将含有人FⅧBD（B-domain deleted)cDNA的质粒pRC/RSV-hFⅧBDl转染至小鼠精子，通过人工授精使母鼠受孕，新生小鼠出生后第4周，应用PCR筛查hFⅧBDcDNA阳性转基因幼鼠，取转有人FⅧBDcDNA幼鼠的血液检测血浆中的人FⅧ抗原和抗体，分别用Northern印迹和Western印迹检测脾，肝，肺和肾组织中人FⅧBDcDNA的转录和表达。结果发现，人工授精后20只受体母鼠7只受孕，共产下11只仔鼠，存活9只，PCR筛检出3只转有人FⅧBDcDNA的阳性鼠，3只阳性鼠血浆中的人FⅧ抗原量分别为8.65ng/ml,7.84ng/ml和8.44ng/ml，人FⅧ的抗体均为阴性。Northern印迹和Western印迹检测显示3只F1代阳性幼鼠的脾，肝，肺和肾组织中均有人FⅧBDcDNA的转录和表达。结论提示，利用精子载体法可以制备转有人凝血因子Ⅷ基因的转基因小鼠，并表达人FⅧ蛋白，这为用精子载体技术生产转基因动物并将之作为生物反应器生产人凝血因子Ⅷ提供了实验依据。     

人胚胎干细胞外源基因的瞬时表达效率

背景:人类胚胎干细胞的修饰和操作技术多种多样,它们在效率、可靠性及安全性方面各有不同。目的:对比观察两种化学转染试剂转染含不同启动子的增强型绿色荧光蛋白表达载体在人胚胎干细胞中的表达效率。方法:采用Fugene HD和lipofectamine2000分别转染无滋养层培养的H9细胞,荧光显微镜下观察阳性克隆,流式细胞术分析不同载体pCAG-EGFP、pEGFP-N3在H9细胞中的表达效率。结果与结论:Fugene HD转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为(42.45±3.32)%、(25.95±1.91)%,差异有显著性意义(P<0.05)。lipofectamine2000转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为(1.94±0.18)%、(1.49±0.33)%。采用Fugene HD转染的表达效率均高于lipofectamine2000转染的表达效率(P<0.05)。结果显示在人胚胎干细胞的H9细胞系中,Fugene HD的转染效率显著高于lipofectamine2000;CAG启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白表达效率显著高于CMV启动子。     

人胚胎干细胞外源基因的瞬时表达效率

背景：人类胚胎干细胞的修饰和操作技术多种多样,它们在效率、可靠性及安全性方面各有不同。目的：对比观察两种化学转染试剂转染含不同启动子的增强型绿色荧光蛋白表达载体在人胚胎干细胞中的表达效率。方法：采用Fugene HD和lipofectamine2000分别转染无滋养层培养的H9细胞,荧光显微镜下观察阳性克隆,流式细胞术分析不同载体pCAG-EGFP、pEGFP-N3在H9细胞中的表达效率。结果与结论：Fugene HD转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为（42.45±3.32）%、（25.95±1.91）%,差异有显著性意义（P〈0.05）。lipofectamine2000转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为（1.94±0.18）%、（1.49±0.33）%。采用Fugene HD转染的表达效率均高于lipofectamine2000转染的表达效率（P〈0.05）。结果显示在人胚胎干细胞的H9细胞系中,Fugene HD的转染效率显著高于lipofectamine2000;CAG启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白表达效率显著高于CMV启动子。     

Dysbindin转基因小鼠心肌肥厚模型中基因变化

目的 探讨Dysbindin转基因小鼠不同心肌肥厚模型心肌肥厚标志基因的表达。方法 构建cTNT-Dysbindin-IRES-EGFP-polyA质粒,受精卵原核显微注射C57BL/6小鼠,建立Dysbindin转基因小鼠。采用异丙肾上腺素（Isoproternol,ISO）和胸主动脉缩窄（Thoracic aorta constriction,TAC）诱导心肌肥厚。造模结束,称取小鼠体重、心脏重量,计算心脏重量指数（HW/BW）;采用qRT-PCR检测心肌肥厚标志基因表达。结果 应用PCR扩增产物和GFP阳性验证Dysbindin转基因小鼠特异性表达在心肌。ISO组和TAC组转基因小鼠和野生型小鼠的HW/BW和心肌肥厚标志基因升高,与野生型小鼠比较,转基因小鼠心房利钠肽（ANP）和-肌球蛋白重链（-MHC）基因表达水平降低。结论 Dysbindin转基因小鼠对于ISO和TAC诱导心肌肥厚有减轻作用,ANP和-MHC降低优于脑钠钛（BNP）。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的了解乙型肝炎病毒DNA序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因,通过原核显微注射法产生转基因小鼠,用C区特异性引物扩增鼠尾DNA检测整合,对其中10只阳性鼠的扩增产物测序。结果128只仔鼠中,14只整合阳性。对10只阳性鼠测序,9只与所转基因序列完全相同,1只在1739、1740位缺失两个碱基。结论外源乙型肝炎病毒基因确定整合至小鼠基因组,多数为正常整合,但也存在缺失整合。     

造血系统常用Cre转基因小鼠及其应用

Cre-lox重组系统包括Cre重组酶和lox位点两个要素.Cre酶能够特异地识别并催化lox位点间的片段进行重组,lox位点的方向和位置则决定Cre酶的功能效应.小鼠造血系统由多系各个发育阶段的造血细胞组成.它们是由骨髓内的造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）分化发育而来,而造血细胞的增殖发育是在骨髓微环境中进行的.目前有利用Cre-lox重组系统建立的多种转基因小鼠运用于造血系统的研究中,本文将讨论常用于造血系统的Cre转基因小鼠以及它们在造血系统研究中的应用.     

载脂蛋白转基因小鼠的研究进展

转基因小鼠是当代生命科学尖端技术之一，也是研究基因结构与功能之间的关系等问题最有效的实验体系之一。本文综述了载脂蛋白转基因小鼠的制备方法，载脂蛋白转基因小鼠在脂质代谢异常和动脉粥样硬化病因和发病机理研究中的应用。     

载脂蛋白转基因小鼠的研究进展

转基因小鼠是当代生命科学尖端技术之一，也是研究基因结构与功能之间的关系等问题最有产的实验体系之一。本文综述了转脂蛋白转基因小鼠的制备方法，载脂蛋白转基因小鼠在脂质代谢异常和动脉粥样硬化病因和发病机理研究中的应用。     

人GM-CSF基因转染小鼠肝癌细胞及其致瘤性研究

为建立以腺病毒为载体的GM－CSF基因转染瘤苗，并研究其体内抗肿瘤作用，应用携带有人GM－CSF基因的重组腺病毒（R－Ad5）载体转染BALB／c小鼠肝癌细胞株（H22），体外应用酶联免疫吸附试验（ELISA法）．检测GM－CSF表达水平，以GM—CSF基因转染的H22细胞进行致癌性研究。结果：（1）重组腺病毒载体能成功地介导GM－CSF基因转染H22细胞并能持续有效表达26～31天，瘤苗的辐照处理并不明显影响GM－CSF表达水平。（2）GM－CSF基因转染瘤苗体内致癌性显著降低。该结果揭示了应用GM－CSF基因转来瘤苗进行肿瘤基因治疗的可行性，为进一步研究肿瘤的GM－CSF基因治疗提供了依据．     

复制缺陷性慢病毒介导的双自杀基因在小鼠异基因骨髓移植中的应用

目的　探讨复制缺陷性慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase,CD)和胸苷激酶(thymidinekinase ,TK)双自杀基因在异基因骨髓移植 (allo BMT)时控制移植物抗宿主病 (GVHD)的可行性及其有效性。方法　将携带双自杀基因的复制缺陷性慢病毒通过脂质体转染入T细胞中。将经6 0　Coγ射线照射后的荷瘤小鼠分组进行骨髓移植 ,观察骨髓移植后荷瘤鼠CFU S、CFU GM、Y染色体整合、T细胞中CD TK基因整合、生存率和生存期、体重及病理组织学等指标。结果　复制缺陷性慢病毒载体可将双自杀基因高效稳定转染入T细胞。在allo BMT中 ,除空白对照组外 ,各组小鼠的CFU S的数目和CFU GM产率差异无显著性 ,且均有Y染色体整合。使用前体药物治疗的小鼠未发生明显的GVHD ,其生存率和生存期明显高于其它各组 ;双自杀基因的效果优于单自杀基因。结论　复制缺陷性慢病毒介导的双自杀基因系统可在不影响移植物存活的情况下有效控制GVHD的发生 ,显著提高allo BMT的成功率。     

淋巴细胞转基因的基因载体

在转基因技术常用受体细胞中，淋巴细胞因具有来源丰富，取材及回输方便，易体主增，可特异性结合体内特异性抗原位点等优点，而备受关注。其基因转移系统常采用重组的逆转录病毒，腺病毒ＥＢ病毒等。本文仅对此作一综述。     

来自转基因小鼠的人类抗体

在由靶基因对内源性H和kL链基因座抑制的背景下,作者研制出了“人类免疫球蛋白”,该球蛋白是由小鼠携带人H链(IgM)和K型(Igk)、λ型(Igλ)L链转基因座。转基因座的引进补充了小鼠脾脏中循环B细胞池存在的衰竭。这些小鼠的B淋巴细胞膜上表达了人IgM和Igk或Igλ蛋白质,携带的人Igλ基因座的显性性状大于k基因座。小鼠血清中分泌人IgM。在角疫作用之后,能产生特异性抗体反应。IgH重排时多样性和结合片段的作用和人B细胞非常相似。提示人细胸中通常直接重排的信使序列在小鼠B细胞中功能是完全的。另外,重排期间,片段之间加入了非模板‘N’核苷酸以增加多样性,在人B细胞中,同时存在H和L链,而转基因座小鼠只有H链。人Ig小鼠仅在H链上重排‘N’核苷酸,提示Ig转基因座重排在同发育阶段。在不同片段的启动基因序列中,由于可产生差异的V区基因的限制作用,H链似乎受到限制,这将影响重排期间“人免疫球蛋白”的活性。转基因小鼠重排的H链序列几乎没有由于种系不     

突变Myc基因骨髓特异性转基因小鼠肿瘤模型的建立及鉴定

目的 研究通过外源Myc基因转染造血细胞,实现骨髓特异性转基因并形成淋巴瘤的潜能.方法 造血细胞转染野生型与突变型Myc基因.移植入经~(60)Coγ射线照射的C57BL/6小鼠,观察小鼠形成肿瘤时间以及小鼠自然死亡时间,免疫组织化学染色法检测肿瘤类型;流式细胞术检测外源Myc基因在小鼠骨髓MNC中的表达;骨髓造血细胞、肝、脾、肿瘤组织行Myc免疫印迹法检测Myc在体内的表达情况.结果 Mye基因转基因后形成B细胞淋巴瘤,流式细胞术检测发现外源Myc基因可在造血细胞表达,突变型Myc基因阳性率高于野生型Myc基因,Myc基因转染骨髓造血细胞后,骨髓、肿瘤组织有较高表达,肝、肾组织则无表达.结论 外源Myc基因特异转染造血细胞可形成组织特异性转基因;突变型Myc基冈致瘤性高于野生型Myc基因.     

HBV转基因小鼠HBsAg的表达

本文研究了两种不同繁育方法培育的乙型肝炎病毒（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ Ｖｉｒｕｓ,ＨＢＶ）转砂眼习ＨＢｓＡｇ的表达情况。结果显示ＨＢＶ转基因纯合子小鼠ＨＢｓＡｇ表达率明显高于ＨＢＶ转基因杂合子小鼠。用ＨＢｓＡｇ疫苗免疫后发现表达ＨＢｓＡｇ的小鼠对ＨＢｓＡｇ形成免疫耐受,而虽有ＨＢＶ基因整合但不表达ＨＢｓＡｇ的小鼠对ＨＢｓＡｇ的不能形成免疫耐受。     

人GM—CSF基因转染小鼠肝癌细胞及其致瘤性研究

为建立以腺病毒为载体的ＧＭ－ＣＳＦ基因转染瘤苗，并研究其体内抗肿瘤作用，应用携带有人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组腺病毒（Ｒ－Ａｄ５）载体转染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠肝癌细胞株（Ｈ２２），体外应用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ法），检测ＧＭ－ＣＳＦ表达水平，以ＧＭ－ＣＳＦ基因转染的Ｈ２２细胞进行致瘤性研究。结果：（１）重组腺病毒载体能成功地介导ＧＭ－ＣＳＦ基因转染Ｈ２２细胞并能持续有效表达２６￣３１天，瘤苗的辐照处     

携带人Ⅸ因子基因逆转录病毒载体的构建及其在小鼠骨髓细胞中的表达

构建携带人Ⅸ因子。cDNA的逆转录病毒载体MFGⅨ,并观察其在造血细胞中的表达。应用DNA重组技术将人Ⅸ因子cDNA构建入MFG载体,转导入包装细胞系PA317细胞,应用病毒上清转染造血细胞,并用PCR,ELISA及免疫组化方法检测其表达。研究结果表明,酶切鉴定成功构建MFGⅣ逆转录病毒载体,转入HT1080细胞系及小鼠骨髓细胞后,用PCR,ELISA及免疫荧光染色和免疫细胞化学染色证实Ⅸ因子的表达,且ELISA结果显示应用MFGⅨ转染Ⅸ因子蛋白及活性均高于LNCⅨ。结论提示MFGⅨ载体能较好转染造血细胞。     

镰状细胞病的转基因小鼠模型

虽然对镰状细胞贫血的分子基础已知晓30年,但至今仍没有肯定的治疗方法.镰状细胞贫血的动物模型将不仅能对始动体内红细胞镰状化的因素和该病的病理生理做详尽分析而且也可藉此探索该病的新的治疗方法.通过使用人的β-珠蛋白位点优势控制区序列和人的α、β~6珠蛋白基因,作者得到了3只转基因小鼠,其HbS水平占红细胞总血红蛋白的10-80%,如在纯合子和杂合子HbS病人中所见,这种小鼠的红细胞在去氧状态下很易镰状化.纯合子β~6的镰状细胞病人具有的特征性的不可逆转