大鼠DDH关节软骨早期退变和X型胶原、基质金属蛋白酶13表达相关性的研究

目的：检测 X 型胶原、基质金属蛋白酶13（MMP-13）在发育性髋关节发育不良（DDH）大鼠模型不同时期关节软骨中表达的改变情况,探讨 X 型胶原、MMP-13与软骨早期退变的相关性。方法选取新生 Wistar 大鼠80只,随机均等分成 DDH 组和对照组。DDH 组新生大鼠后肢襁褓位固定10 d 后解除固定继续饲养,分别于鼠的2、4、6、8周龄处死,离断髋关节,观察髋关节软骨的大体形态。用免疫组化和 qRT-PCR 法检测 X 型胶原、MMP-13的表达。结果 DDH模型鼠的尸体解剖样本显示关节囊增厚,髋臼表面呈不规则、不平整,股骨头扁平且发育较小,头臼包容差,尤其4周后更明显;与对照组相比,在髋关节软骨浅表区域有较高的X 型胶原和 MMP-13表达（P <0.05）,并且这种增长是随着年龄增长而增长的,X 型胶原和 MMP-13的 mRNA 表达显示出相似的结果（P <0.05）。结论 DDH 模型鼠在较早阶段出现软骨退化,随着年龄逐渐加重;X 型胶原和 MMP-13表达与 DDH 软骨早期退变有密切的关系。     

兔膝关节骨性关节炎中基质金属蛋白酶-3及金属蛋白酶组织抑制剂-1表达的研究

目的通过动物模型研究膝关节骨性关节炎软骨中基质金属蛋白酶（MMP）-3及金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-1的表达及其与膝关节骨性关节炎之间关系。方法雌性中国家兔制作软骨损伤模型,术后2周、4周、6周处死动物,分为实验组（E组）、实验对照组（c组）和正常对照组（N组）。对膝关节软骨进行大体形态观察并行HE组织切片、免疫组化染色观察。结果实验组膝关节呈进行性骨性关节炎改变,组织学观察显示透明软骨进行性退变,胶原破坏、蛋白聚糖降解、软骨细胞变性坏死。免疫组化染色显示透明软骨内MMP-3、TIMP-1表达均明显升高。结论膝关节骨性关节炎造成软骨所处生物力学和生化环境紊乱,软骨组织结构退变、功能丧失而进一步加重骨性关节炎病变。     

超声波治疗兔膝骨关节炎对MMP-1和MMP-13表达的影响

目的探讨兔膝骨关节炎模型软骨基质金属蛋白酶(MMP)-1、-13超声波治疗前后在软骨组织中的表达及其作用机制。方法 30只新西兰大白兔随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)和超声波治疗组(C组),每组10只。B、C组骨关节炎造模后6周,C组实施超声波治疗,8周后取各组软骨予HE染色,免疫组化行MMP-1和MMP-13分析,观察软骨HE改变、MMP-1和MMP-13表达的变化。结果 HE染色结果采用Mankin′s评分比较,A组与B组、B组与C组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。软骨免疫组化MMP-1、-13测定,A组与B组、B组与C组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论超声波能有效治疗膝OA,其作用机制可能是减少软骨MMP-1、-13的含量,降低Ⅱ型胶原的降解、促进新的Ⅱ型胶原的生成,从而有利于软骨细胞外基质的合成,有利于软骨细胞的修复。     

MMP-1、13 mRNA和DDR2表达与关节软骨退变的关系

目的探讨关节软骨基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）-1、13mRNA及盘状结构域受体（discoidin domain receptor，DDR2）三者与关节软骨退变的关系。方法对58例关节软骨标本应用反转录-多聚酶链反应法（RT-PCR）测定MMP-1、13mRNA的表达，免疫组化法显色DDR2表达，进行图像分析研究。结果在轻度退变关节软骨中MMP-1、13呈低表达，在中重度退变软骨中MMP-1、13表达显著增高，在重度退变软骨中MMP-1，13有相对的下降，DDR2表达也呈现出与MMP-1、13相同的表达特点。结论MMP-1、13的过表达导致软骨Ⅱ型胶原的降解是软骨退变的重要原因，Ⅱ型胶原降解片段诱导DDR2表达增高进一步介导MMP-1、13的表达形成一个放大效应而加速了关节软骨退变。     

软骨形态发生蛋白1诱导真皮成纤维细胞表达软骨细胞表型的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白(CDMP)生长因子,体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性.方法取包皮环切术后丢弃真皮组织共3例,成纤维细胞体外培养扩增至第二代,以1×104/cm2密度接种,12 h后加入细胞诱导液(10%胎牛血清F-12培养液,CDMP1终浓度为100 ng/ml)单层培养,未加的成纤维细胞培养用CDMP1为对照.诱导7 d后观察细胞形态变化,Image Plus图像分析软件计算细胞长宽比例.激光共聚焦显微镜分别观察诱导前后细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达及分布,Western印迹检测诱导前后细胞Ⅱ型胶原蛋白表达.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测诱导后成软骨相关的Sox9、聚集蛋白聚糖与Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达;同时检测与成骨相关的X型胶原、碱性磷酸酶(AKP)mRNA表达.培养第二代细胞以2×107个细胞/ml细胞密度进行离心管法培养,诱导14 d后行阿辛蓝与Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果诱导后可见单层培养的成纤维细胞形态由长梭形向软骨细胞样多角形转变,Image Plus图像分析软件计算细胞诱导后的长宽比例为(1.40±0.15),较诱导前(7.40±1.30)差异有显著意义(P＜0.05);与正常软骨细胞(1.29±0.24)差异无显著意义.免疫荧光激光共聚焦观察发现诱导后细胞内出现Ⅱ型胶原表达,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈阳性.RT-PCR检测成软骨相关的Sox9,聚集蛋白聚糖,Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达阳性;X型胶原、AKP未检测到mRNA阳性表达.Western印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性.离心管培养诱导7 d后阿辛蓝染色示糖胺聚糖(GAG)均匀分布于基质中,免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性.结论第二代成人真皮成纤维细胞在CDMP1生长因子诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的种子细胞来源.     

首乌延寿丹对家兔骨关节炎的防治作用及其可能机制

目的观察首乌延寿丹对兔骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的防治作用。方法将24只日本大耳白兔随机分成空白对照组、模型组、首乌延寿丹组。ACLT术[1]制作OA模型。于第12周末观察软骨病理形态学改变;免疫组化法测定软骨Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的表达。结果以ACLT术成功建立了OA模型。首乌延寿丹组病变明显减轻,Ⅱ型胶原的蛋白表达明显升高（P〈0.01）;MMP-1表达明显降低（P〈0.01）。结论首乌延寿丹可明显抑制OA发展,这一作用可能是通过增加Ⅱ型胶原的蛋白表达、下调MMP-1表达来实现的。     

益气养血方抗兔膝骨关节炎模型软骨退变的作用及机制研究

目的探讨益气养血方对兔膝骨关节炎(KOA)模型软骨细胞凋亡及血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Ⅱ型胶原蛋白(COL-Ⅱ)、人基质金属蛋白酶-13(MMP13)表达的影响,揭示其抗骨关节炎软骨退变的作用及机制。方法 40只日本大耳白兔随机分为4组,即假手术组、KOA模型组、阳性药(双醋瑞因)组、益气养血方组各10只。石蜡切片HE染色观察软骨退变情况,TUNEL法检测软骨细胞凋亡,免疫组化检测COL-Ⅱ、MMP13的表达。结果益气养血方对KOA模型兔膝关节软骨退变具有一定抑制作用,能下调血清促炎细胞因子TNF-α产生水平(P0.05),抑制软骨细胞凋亡;能下调软骨组织MMP-13蛋白的表达(P0.01),上调软骨组织COL-Ⅱ胶原的表达(P0.05),抑制软骨基质降解。结论益气养血方通过下调TNF-α、MMP-13蛋白表达,同时上调COL-Ⅱ胶原表达,抑制软骨细胞凋亡及细胞外基质降解,可能是益气养血方治疗骨关节炎的作用机制之一。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的:寻找良好的软骨组织工程种子细胞.方法:抽取兔骨髓液,分离纯化骨髓液中的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并传代扩增.将第3代BMSCs分成实验组和对照组,实验组用10%胎牛血清的LG-DMEM培养液加入转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和地塞米松联合诱导,对照组用10%胎牛血清的LG-DMEM培养液自然分化.在诱导4、7、14 d后,分别用甲苯胺蓝染色检测细胞蛋白多糖的表达,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测细胞Ⅱ型胶原的表达并计算阳性率.结果:BMSCs取材方便,体外培养生长稳定,细胞活性好.实验组BMSCs向软骨细胞分化,细胞甲苯胺蓝染色异染,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性率(72.51±9.49)%与对照组(2.15±1.88)%相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:BMSCs是软骨组织工程良好的种子细胞.     

腰椎间盘组织中MMP-7的表达及意义

目的 检测突出间盘组及对照组腰椎间盘中基质金属蛋白酶-7(MMP-7)的表达情况，探讨MMP-7在腰椎间盘退变突出中的作用。方法 应用免疫组化链霉素亲生物素-过氧化物酶法(S-P)对实验组32例腰椎间盘突出标本及对照组11例非突出间盘标本分别进行抗MMP-7蛋白单克隆抗体染色。实验组按术中病理分型分为突出、脱出、游离型。显微图象分析系统采集灰度值，数据进行统计学分析。结果 实验组MMP-7蛋白表达高于对照组，实验组中游离型及脱出型的MMP-7蛋白表达均比突出型高，游离型和脱出型之间MMP-7蛋白表达无差异。结论 腰间盘组织中MMP-7蛋白表达情况与腰椎间盘退变突出有关，MMP-7蛋白表达增加可能是导致腰间盘退变突出的原因之-。     

强力霉素对制动兔骨关节炎模型对侧膝关节早期退变的影响

目的：研究口服强力霉素对制动兔骨关节炎模型对侧膝关节早期退变的影响及作用机制。方法：36只新西兰大白兔随机分为空白对照组,模型对照4、8、12周组,给药8、12周组。模型组与给药组均给予石膏固定左下肢。石膏固定4周后,给药组给予强力霉素。分别在8周、12周处死动物,观察指标包括：软骨大体形态、软骨man—kin评分、软骨Ⅱ型胶原、uPA、MMP-13。结果：与模型对照组比较,给药组软骨面光滑,mankin评分较低,Ⅱ型胶原含量较高,uPA、MMP-13活性较低（P〈0．01）。结论：强力霉素对制动兔骨关节炎模型对侧膝关节软骨早期退变有缓解作用,作用机制与抑制MMP-13、uPA的表达有关。     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

软骨源性形态发生蛋白2基因转染自体成肌细胞表达软骨细胞表型的实验研究

目的研究软骨形态发生蛋白-2(CDMP-2)对小鼠成肌细胞向软骨分化的作用。方法体外培养小鼠成肌细胞,贴壁细胞传代,取第3代细胞,对照组(A组)以无血清L-DMEM培养液培养,实验组(B、C、D组)以无血清L-DMEM培养液培养,分别加入透明质酸钠、CDMP-2(100ng/mL)和CDMP-2基因转染的小鼠成肌细胞,14d后终止培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色糖胺聚糖(GAG),行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、灰度值分析和Western blot检测。结果培养14d后转染组和诱导组可见成肌细胞形态由梭形向软骨细胞的多边形转变。甲苯胺蓝染色示糖胺聚糖(GAGs)均匀分布于基质中,免疫组织化学染色和Western blot示实验组Ⅱ型胶原表达阳性,且CDMP-2基因转染组细胞表达Ⅱ型胶原水平高于单独给予CDMP-2,且具有统计学意义;对照组和透明质酸钠组未见阳性表达。结论 CDMP-2基因转染的小鼠成肌细胞能够更好的表达软骨特异性Ⅱ型胶原。     

手法干预对实验性兔退变颈椎间盘Ⅱ型胶原的影响

目的:观察手法干预对实验性兔退变颈椎间盘Ⅱ型胶原的影响。方法:建立兔颈椎间盘退变模型,25只成年新西兰家兔随机分为正常对照组、模型组、手法预防组、手法治疗组,应用免疫组织化学方法观察手法干预对实验性兔退变颈椎间盘Ⅱ型胶原的影响。结果:与正常对照组比较,在模型组兔颈椎间盘中,髓核与软骨终板中Ⅱ型胶原阳性表达信号明显减弱。手法治疗、预防组均能不同程度的抑制髓核和软骨终板中Ⅱ型胶原的阳性表达程度下降,且手法早期干预效果优于晚期干预。结论:手法干预能不同程度的延缓颈椎间盘Ⅱ型胶原的退行性改变。     

自体骨髓基质干细胞修复股骨头关节软骨缺损的实验研究

目的 探讨自体骨髓基质干细胞修复兔股骨头软骨缺损的可行性.方法 1、建立兔髋关节软骨缺损动物模型16只,对照组8只,实验组8只;2、取兔髂骨骨髓,体外分离、培养、扩增、骨髓基质干细胞,诱导分化为软骨样细胞并进行细父胞标记;3、与生物材料混合后植入体内修复兔股骨头关节软骨缺损,8周后观察修复效果;结果 8周后大体标本显示关节软骨缺损为白色软骨样组织填充,组织切片显示缺损处有新生软骨形成,阿新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化检测有GAG和Ⅱ型胶原强阳性表达;结论经诱导分化后的自体骨髓基质干细胞复合生物材料移植可用于修复兔股骨头关节软骨缺损.     

自体骨髓基质干细胞修复股骨头关节软骨缺损的实验研究

目的 探讨自体骨髓基质干细胞修复兔股骨头软骨缺损的可行性.方法 1、建立兔髋关节软骨缺损动物模型16只,对照组8只,实验组8只;2、取兔髂骨骨髓,体外分离、培养、扩增、骨髓基质干细胞,诱导分化为软骨样细胞并进行细父胞标记;3、与生物材料混合后植入体内修复兔股骨头关节软骨缺损,8周后观察修复效果;结果 8周后大体标本显示关节软骨缺损为白色软骨样组织填充,组织切片显示缺损处有新生软骨形成,阿新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化检测有GAG和Ⅱ型胶原强阳性表达;结论经诱导分化后的自体骨髓基质干细胞复合生物材料移植可用于修复兔股骨头关节软骨缺损.     

退变腰椎软骨终板细胞生物学特征实验研究

目的 通过对人腰椎软骨终板细胞的培养,观察细胞的形态学和生物学性状,探讨影响其生物学行为的因素.方法 取腰椎退变和未退变终板软骨细胞,在加10%灭火胎牛血清的DMEM培养液中培养.建立体外终板软骨细胞培养模型,采取HE染色、绘制细胞生长曲线、Annexin-V/PI法、免疫组织化学染色、real-time PCR等方法,对细胞形态、活力、生长情况、凋亡、及软骨细胞基质合成进检测.结果 软骨终板细胞可以在体外进行培养;终板软骨细胞的生长情况及细胞表型类似关节软骨,有Ⅱ型胶原表达.退变软骨终板较未退变软骨终板活性及增殖能力降低.细胞凋亡增加,Ⅱ型胶原合成减少.结论 体外成功培养了人腰椎终板软骨细胞,并证明了退变软骨终板细胞凋亡增加,而活性降低,基质合成减少.该研究也为进一步研究终板软骨的生物学性状奠定基础.     

人Ad-BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞对其Ⅱ型胶原和碱性磷酸酶表达的影响

目的：用人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体（Ad-BMP-2）转染兔骨髓基质干细胞（BMSC）,观察Ad-BMP-2转染对细胞分化的影响。 方法：将Ad-BMP-2转染体外培养的兔BMSC,7 d后利用原位杂交和免疫组化方法检测细胞内BMP-2及Ⅱ型胶原的表达,同时行碱性磷酸酶染色。 结果：BMP-2和Ⅱ型胶原原位杂交法显示实验组细胞胞浆中有棕黄色阳性杂交信号,对照组阴性。BMP-2和Ⅱ型胶原免疫组化法显示实验组细胞胞浆棕黄色阳性着色,胞核阴性表达,对照组阴性;碱性磷酸酶染色见实验组细胞胞浆呈棕黑色阳性着色,可见细小的棕黑色颗粒,对照组染色阴性。结论：Ad-BMP-2可高效转染BMSC,且促进其向成骨细胞和软骨细胞方向转化。     

超声波对骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原代谢的影响

目的 探讨低强度超声波对骨折愈合中Ⅰ、Ⅱ型胶原代谢的影响。方法建立大鼠双侧胫骨近侧皮质骨缺损的动物模型，随机分为2组，实验组每日接受低强度超声波刺激，而对照组给予假刺激。于术后10、20、30d处死动物，取标本(骨痂)进行组织学及免疫组化染色观察。结果组织学检查显示：实验组的血肿机化、吸收，软骨性骨痂和软骨内化骨明显早于对照组，免疫组化检查显示：实验组在20d时Ⅱ型胶原的表达明显高于对照组；在30d时Ⅰ型胶原的表达也略高于对照组。结论低强度超声波通过增加骨痂内Ⅰ、Ⅱ型胶原的合成来促进骨折的愈合，其中以Ⅱ型胶原的作用尤其明显。     

针刺对颈椎间盘退变大鼠椎间盘VEGF、PLA2和PGE_2和细胞外基质胶原、代谢酶表达的影响

目的:探究针刺对颈椎间盘退变大鼠椎间盘血管内皮生长因子(VEGF)、脂蛋白相关磷脂酶A2 (Lp-PLA2)、前列腺素E_2(PGE_2)和细胞外基质胶原、代谢酶表达的影响。方法:将大鼠随机分配到以下3组(每组25只):假手术组(切开颈部皮,然后缝合)、模型组(采用建模方法处理)和针刺治疗组(每天持续30 min,完整疗程包括14 d,两个疗程间隔2 d);通过qRT-PCR分析VEGF、PLA2和PGE_2的mRNA表达水平;通过蛋白质印迹法测定VEGF、PLA2和PGE_2蛋白的蛋白质水平;通过免疫组织化学染色检测Ⅰ型和Ⅱ型胶原;通过酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)含量;使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)测定评估针刺治疗对颈椎间盘退变大鼠细胞凋亡的影响。结果:模型组较假手术组VEGF、PLA2、PGE_2 mRNA、蛋白质表达水平升高,而针刺治疗组能够降低模型组VEGF、PLA2、PGE_2 mRNA、蛋白质表达水平(P<0.05);Ⅰ型胶原与椎间盘退变正相关,Ⅱ型胶原与椎间盘退变呈负相关。模型组较假手术组Ⅰ型胶原表达水平升高,Ⅱ型胶原表达水平降低,而针刺治疗组能够恢复模型组Ⅰ型和Ⅱ型胶原水平(P<0.05);与假手术组相比,模型组TNF-α、IL-1β、MMP-1、MMP-3表达水平升高,而针刺治疗组能够降低模型组TNF-α、IL-1β、MMP-1和MMP-3表达水平(P<0.05);模型组核膜被破坏,细胞核变得更致密,针刺治疗组中的细胞显示相对完整的核膜。与假手术组相比,模型组中TUNEL阳性细胞的数量增加。与模型组相比,针刺治疗组中TUNEL阳性细胞的数量减少(P<0.05)。结论:针刺能够降低颈椎间盘退变大鼠椎间盘VEGF、PLA2和PGE_2和细胞外基质Ⅰ型胶原和代谢酶表达,增加Ⅱ型胶原表达。     

力学刺激影响猪骨髓基质干细胞体外软骨形成的初步研究

目的研究力学刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建组织工程化软骨的影响.方法取第二代猪BMSC以5×107/cm3的密度接种于聚羟基乙酸/聚羟基乳酸(PGA/PLA)圆盘形支架上,一周后均改用软骨诱导液[高糖DMEM培养基含10%胎牛血清(FBS) 、转化生长因子(TGF)β110 ng/ml、胰岛素样生长因子(IGF)-I 50 ng/ml、地塞米松 40 ng/ml]体外培养.根据不同的施加力分为3组离心组设定离心力100 g,2次/d,30 min/次,间隔12 h;摇床组设定为80 r/min,每天施力8 h;静止培养作为对照组.分别于第4周、第8周进行大体观察、组织学、组织化学、免疫组织化学,蛋白聚糖(GAG)定量等检测,比较不同力学刺激对诱导BMSC体外软骨形成的影响.结果第4周时两实验组,即摇床组及离心组形成的细胞材料复合物基本保持原来的体积与外形,软骨陷窝形成,呈结节状或巢状分布并伴有GAG沉积及胶原合成,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.静止组体积缩小,有少量软骨陷窝结构形成;8周时两实验组形成的细胞材料复合物形状保持良好,浅灰白色,光泽好;HE染色结果显示大量成熟软骨陷窝形成,核仁清楚并有多处分裂相,细胞外基质沉积均匀;Safranin-O染色显示有大量的GAG形成,Masson染色显示有较多新生胶原组织形成,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达强阳性.静止组可见部分陷窝结构分布在复合物外周,其间分布大量纤维样组织,组织化学及免疫组化检测阳性表达区域明显少于实验组.GAG含量两实验组分别为5.98 mg/g和5.62 mg/g,约为正常耳软骨含量的80%左右,明显高于对照组.结论利用BMSC为种子细胞体外构建组织工程化软骨中,施加力学刺激可以促进软骨组织成熟.