TIMP-3基因甲基化与结直肠癌临床病理的关系

目的：探讨TIMP-3基因甲基化与结直肠癌临床病理指标和转移复发的关系。 方法： 采用巢式甲基化特异性PCR技术（nMSP法）检测100例结直肠癌组织和100例癌旁非癌组织TIMP-3基因甲基化；采用RT-PCR检测100例结直肠癌组织和100例癌旁非癌组织TIMP-3 mRNA的表达。 结果： 肿瘤组织TIMP-3 mRNA的表达阳性率为64%，肿瘤组织TIMP-3 mRNA的表达率明显低于癌旁非癌组织（P＜0.01）；TIMP-3 mRNA的表达率无淋巴结转移组（34/42）高于淋巴结转移组（30/58）（P＜0.01），甲基化阳性率Duke’s C+D期伴淋巴结转移组明显高于Duke’s A+B期不伴淋巴结转移组（P＜0.05）。结肠近端、分化程度差的结直肠癌组织甲基化阳性率明显高于远端直肠和分化程度高者（P＜0.05）。 结论： TIMP-3基因甲基化容易发生在结肠近端、Duke’s C、D期、伴淋巴结转移、细胞分化差和浸润型结直肠癌患者。     

食管鳞癌组织中TIG1基因甲基化及其mRNA表达的研究

 目的：探讨他扎罗汀诱导基因1（tazarotene-induced gene-1, TIG1）基因甲基化及表达与食管鳞癌发生、发展的关系。方法：采用甲基化特异性PCR检测43例食管鳞癌组织、20例癌旁组织和15例正常组织中TIG1基因甲基化状态;实时荧光定量PCR法法检测TIG1 mRNA的表达。结果：食管鳞癌组织TIG1基因启动子甲基化率为25.6%（11/43）,癌旁组织5.0%（1/20）,正常组织中未检测到其甲基化,差异有统计学意义（P<0.05）;其甲基化水平与患者性别、年龄、肿瘤生长部位和分化程度无关（P>0.05）,但与患者TNM分期（P<0.01）及淋巴结转移（P<0.05）有关。鳞癌组织TIG1 mRNA显著低于癌旁组织（P<0.05）及正常组织（P<0.01）,甲基化组织TIGI mRNA表达显著低于非甲基化组织（P<0.01）。结论：甲基化可能是食管鳞癌中TIG1基因失活的重要机制,与患者病理分期及淋巴结转移有关。     

DAPK1基因启动子甲基化与乳腺癌临床病理特征的关系

目的：研究乳腺癌组织中死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase 1,DAPK1）启动子甲基化状态及其与临床病理特征之间的关系,并探讨该甲基化状态与DAPK1 mRNA表达的相关性。方法：应用甲基化特异性PCR法检测人乳腺癌组织和相应癌旁正常乳腺组织中DAPK1启动子甲基化状态,分析其与患者临床病理特征的关系,并结合半定量RT-PCR法的检测结果加以分析。结果：43例乳腺癌标本中DAPK1启动子甲基化阳性率为44.1%（20/43）,DAPK1启动子甲基化状态与年龄、肿瘤大小、组织学分级、TNM分期、ER状态、PR状态、Her2状态无关（P〉0.05）,而与有无淋巴结转移、P53是否阳性有关（P〈0.05）。DAPK1启动子甲基化标本中的DAPK1mRNA表达水平低于未甲基化标本,两者差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：乳腺癌中DAPK1基因启动子区高甲基化与其mRNA失表达有关,在乳腺癌发生、发展中可能起重要作用,有可能作为乳腺癌诊断和预后分析的检测指标之一。     

结直肠癌细胞中脾酪氨酸激酶基因甲基化状态和表达的关系

目的：探讨结直肠癌细胞中脾酪氨酸激酶基因甲基化和表达的关系。方法：应用亚硫酸盐修饰测序、甲基化特异性聚合酶链反应和蛋白印迹技术检测结直肠癌细胞脾酪氨酸激酶的甲基化状态以及表达情况；荧光素酶报告分析法研究启动子区域CpG岛的甲基化与启动子活性的关系；甲基化转移酶抑制剂处理脾酪氨酸激酶甲基化失表达的结直肠癌细胞株，观察处理前后细胞内脾酪氨酸激酶基因甲基化状态和表达情况。结果：（1）23个结直肠癌细胞中，9个细胞启动子发生甲基化而失去蛋白质表达；其余则正常表达，甲基化发生率为39.2％；（2）9个甲基化的细胞中，7个存在微卫星不稳定；而14个未发生甲基化的细胞中，仅有4个存在微卫星不稳定。二者之间的差异显著（P<0.05）；（3）脾酪氨酸激酶启动子全长和未甲基化启动子荧光素酶的活性分别是甲基化组的4.5和4.7倍；5-Aza-CdR可恢复甲基化启动子的活性；（4）5-Aza-CdR可去甲基化而使脾酪氨酸激酶基因重新表达，而且具有时间依从性。结论：结直肠癌细胞中，启动子区域的甲基化导致Syk基因丧失表达，5-Aza-CdR可以去甲基化而恢复脾酪氨酸激酶基因的表达。     

胃癌中p16INK4a基因启动子高甲基化及其蛋白表达

目的探讨胃癌中p16^INK4a基因失活的主要分子机制及其与胃癌发生、发展的关系。方法采用甲基化特异性PCR技术检测62例胃癌和癌旁组织及10例慢性胃炎黏膜p16^INK4a基因启动子区CpG岛甲基化状态,用免疫组化EnVision两步法检测p16^INK4a蛋白的表达。结果62例胃癌和癌旁组织p16^INK4a基因启动子高甲基化率分别为51．6％（32／62）和19.4％（12／62）,10例正常对照胃黏膜未发现高甲基化,胃癌组织p16^INK4a基因启动子高甲基化率高于癌旁组织和正常对照（P〈0．05）。58.1％（36／62）的胃癌组织p16^INK4a蛋白表达阴性,其中72.2％（26／36）的病例具有p16^INK4a基因启动子的高甲基化,p16^INK4a基因启动子的高甲基化与其蛋白失表达密切相关（P〈0.05）。结论胃癌中p16^INK4a基因启动子的高甲基化是p16^INK4a基因失活的主要机制,并可能是胃癌发生中的早期分子事件。     

肾细胞癌RASSF1A基因启动子区甲基化状况与表达水平研究

目的检测19例肾细胞癌患者癌组织及癌旁组织Ras相关区域家族蛋白1A（RASSFlA）基因启动子区甲基化情况并检测其mRNA表达水平，探索两者之间的联系。方法收集肾细胞癌患者癌组织及相应癌旁组织19份，分别提取其基因组DNA，以甲基化特异性PCR（Methylation special PCR，MSP）法检测RASSFlA基因启动子区甲基化情况。并以QPCR法检测了RASSFlA基因的mRNA表达水平。结果19例中有lO例肾细胞癌患者癌组织存在高甲基化，mRNA表达水平表达降低，二者之间存在显著负相关性（r=-0．8734，P〈0．01）。结论肾细胞癌中RASSFlA基因启动子区存在高甲基化，并抑制该基因的表达。     

口腔鳞癌组织中PTPRK基因的异常表达及甲基化分析

目的分析口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中受体型蛋白酪氨酸磷酸酶K(protein tyrosine phosphatase,receptor type K,PTPRK)基因的甲基化状态及其mRNA和蛋白表达,探讨OSCC的发生、发展机制。方法收集OSCC组织57例及癌旁正常口腔黏膜组织41例,采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)、RT-qPCR和免疫荧光染色分析OSCC组织及癌旁正常口腔黏膜组织中PTPRK基因甲基化状态、mRNA和蛋白的表达以及甲基化与临床病理特征之间的关系。结果 OSCC组织中PTPRK基因甲基化阳性率高于癌旁正常口腔黏膜(59. 65%vs 34. 15%,P 0. 05)。OSCC组织中PTPRK的mRNA和蛋白表达量明显低于癌旁正常口腔黏膜(mRNA水平:0. 53±0. 23 vs 1. 05±0. 08,P 0. 001;蛋白水平:0. 43±0. 21 vs 1. 02±0. 78,P 0. 01),OSCC组织中PTPRK基因mRNA的表达与PTPRK基因的甲基化状态相关(P 0. 01)。PTPRK基因的高甲基化状态与淋巴结转移、TNM分期及病理分级相关(P 0. 05)。结论 PTPRK基因启动子区Cp G岛高甲基化可能与OSCC的发生、进展相关,有可能成为OSCC早期诊断及药物治疗的分子靶点。     

MTA1基因过表达与直肠癌浸润和转移的关系

目的：研究MTA1基因mRNA在直肠癌中的表达,阐明该基因可能是直肠癌浸润和转移的分子机制之一。方法：建立测定MTA1基因mRNA表达的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）最适条件,在半定量水平测定42 例直肠癌标本癌组织和癌旁正常粘膜组织MTA1基因mRNA表达的相对水平,探讨与临床和病理组织学特征的关系。结果：42例直肠癌中有17例MTA1基因mRNA过度表达（癌组织与癌旁正常粘膜组织MTA1基因mRNA表达半定量之比≥2）,过度表达MTA1基因mRNA的直肠癌浸润层次深,淋巴结转移率高,与剩余病例组比较有显著差异（P<0.05）。结论：MTA1基因过度表达与直肠癌浸润和转移相关。     

乳腺癌中印记基因SLC22A18/TSSC5/BWR1A启动子区甲基化及mRNA表达的研究

目的： 研究印记基因SLC22A18启动子区甲基化对乳腺侵润性导管癌组织中的SLC22A18 mRNA表达的影响，探讨其与临床病理特征之间的关系。方法：实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative RT-PCR）方法检测40例乳腺侵润性导管癌及其癌旁组织中SLC22A18 mRNA的表达，甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测SLC22A18基因启动子区的甲基化状态。检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dc）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（TSA）作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231后，对SLC22A18基因启动子区DNA甲基化和mRNA表达的影响。结果：SLC22A18在40例乳腺侵润性导管癌中mRNA表达量低于癌旁组织（0.12±0.10 vs 0.69±1.05，P＜0.01）；40例乳腺侵润性导管癌及对应癌旁组织中，SLC22A18启动子区的甲基化发生率分别为75％和37.5%，差异有统计学意义（P＜0.01）；在40例乳腺侵润性导管癌组织中，甲基化组SLC22A18 mRNA表达量低于非甲基化组（0.11±0.08 vs 0.24±0.18，P＜0.01）。5-aza-dc和5-aza-dc/TSA能不同程度逆转乳腺癌细胞株MDA-MB-231中SLC22A18基因的甲基化状态，并上调SLC22A18基因表达。结论：SLC22A18基因甲基化与乳腺癌发生有一定的关联，SLC22A18基因表达下调与其启动子区CpG岛异常甲基化相关。     

原发胃癌中p16和p15基因表达及甲基化异常

为检测胃癌组织中抑癌基因p16,p15及其启动子区甲基化状态和P16、P15蛋白表达情况。选择p16、p15基因及启动子区域，用PCR－SSCP、MSP（甲基化特异的PCR）和测序法对100例胃癌患者的癌组织、癌旁正常组织和5例正常组织进行检测，同时用免疫组化法检测了癌组织和正常对照组织的P16和P15的表达。结果发现癌组织p16和p15基因启动子区甲基化率显著高于癌旁正常组织和正常对照；胃癌组织中，71％的病例P16表达阴性，54％的病例具有p16基因启动子区的高甲基化，无突变和纯合缺失检出；11％的病例P15表达阴性，9％的病例具有p15基因启动子区的高甲基化，p15异常与低分化胃癌有关，p15基因内含子1和外显子1内各发现1例DNA序列改变；癌组织中p16和p15基因启动子区甲基化与其蛋白表达密切相关。结果显示p16基因启动子区域高甲基化是胃癌中p16基因失活的关键因素之一，并在胃癌的发生发展中发挥重要作用；p15基因启动子区域高甲基化在胃癌中起一定作用。     

内皮素-3基因表达和启动子甲基化与乳腺癌的相关性研究

目的:检测分析内皮素-3(EDN-3)基因表达及其启动子甲基化在乳腺癌患者各种临床状态的变化。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)和甲基化PCR(MS-PCR)方法检测54例乳腺癌患者(实验组)及60例体检健康女性(对照组)外周血中EDN-3mRNA表达及其启动子甲基化发生率,比较以上两指标变化在乳腺癌患者不同临床状态的统计学差异。结果:实验组EDN-3mRNA表达较对照组显著降低,差异有统计学意义(t=-7.84,P0.01),但这种降低在患者不同年龄、不同肿瘤组织类型和大小、有否区域淋巴结转移及远处转移之间差异均无统计学意义(P0.05)。实验组EDN-3启动子甲基化检出率为55.56%(30/54),对照组未检出甲基化,差异有统计学意义(χ2=45.238,P0.01);EDN-3启动子甲基化在上述不同临床状态时的差异亦无统计学意义(P0.05)。结论:EDN-3mRNA转录下调和启动子甲基化可能与乳腺癌的发生有关,与患者临床病理状态无关。     

粪便DNA中X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子甲基化状态在结直肠癌筛查中的应用研究

目的以粪便DNA中x染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子（XAF）1基因启动子区域的甲基化状态为靶目标,建立新的有效的筛查结直肠癌的方法。方法收集需做肠镜检查患者自然排泄粪便,经肠镜或病理学检查确诊后,分为3组,结直肠正常组45例,结直肠腺瘤组30例,结直肠腺癌组24例。使用QIAampDNAStoolMiniKit自粪便抽提人DNA。应用甲基化特异性的PCR（MSP）检测粪便DNA中XAFl基因启动子区域甲基化状态。结果经genomic—DNAPCR,证实所提取DNA均含有人基因组DNA。经MSP检测,正常组存在高甲基化15例,阳性率33．33％;腺瘤组18例,阳性率60．00％;腺癌组15例,阳性率62．50％,腺瘤组、腺癌组与正常组比较差异有统计学意义（P〈0．05）,但腺瘤组与腺癌组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论使用Qiagen试剂盒抽提粪便中人DNA的方法比较稳定。以粪便DNA中XAFl基因启动子区域甲基化状态为靶目标进行结直肠肿瘤的早期诊断,敏感度、特异度较高,但尚需要大样本研究进一步验证。     

启动子DNA甲基化调节胃癌中PDX1基因表达

目的明确PDXl启动子DNA甲基化,探讨启动子甲基化对PDXl在胃癌中表达的调节作用。方法收集3例胃癌活检组织,免疫组化检测PDXl蛋白表达：吉西他滨处理3株胃癌细胞,RT—PCR检测不同药物剂量和作用时间下PDXlmRNA表达;构建PDXl报告基因,检测启动子活性及吉西他滨处理前后启动子活性的变化;甲基化特异性PCR（MSP）检测3株胃癌细胞和8对配对胃癌组织中PDXl启动子甲基化状态。结果免疫组化结果显示胃癌中PDXl表达低于正常胃黏膜;RT—PCR显示吉西他滨使PDXlmRNA重获表达,且随剂量和时间依赖性。F383有最强启动子活性,吉西他滨显著增加了PDXl启动子活性（P〈0．05）。F383在AGS、BCG823、SGC7901中呈DNA完全甲基化状态;87．5％的胃癌组织出现F383部分甲基化,12．5％出现完全甲基化。癌旁正常组织仅有37．5％出现F383部分甲基化,未出现完全甲基化,两者比较有显著性差异（P〈0．05）。结论PDXl启动子存在DNA高甲基化,抑制了胃癌中PDXl的表达。     

Semaphorin-3F functions as a tumor suppressor in colorectal cancer due to regulation by DNA methylation

Semaphorin-3F (SEMA3F) is a member of the class III semaphorin family, and is seen as a candidate tumor suppressor gene. The aims of this study were to evaluate the effect of SEMA3F in colorectal cancer (CRC) patients, and to explore the mechanism for that SEMA3F suppresses tumor progression and metastasis. The expression levels of SEMA3F in the colorectal cancer tissues and corresponding non-tumor colorectal tissues were determined by Western blotting and real-time quantitative PCR (qRT-PCR). In addition, we evaluate the effects of SEMA3F on CRC cell migration and colony formation in vitro. Subsequently, quantitative methylation-specific PCR (qMSP) was used to detect the DNA methylation status in the CpG islands of SEMA3F gene promoter in normal colon and colorectal cancer cell lines, colorectal cancer tissues and corresponding non-tumor colorectal tissues. We found that SEMA3F was downregulated in the protein (P < 0.01) and mRNA (P < 0.001) levels in CRC tissues as compared to matched adjacent non-tumor tissues. Moreover, MSP assay showed high levels of SEMA3F gene promoter methylation in the CpG islands in some CRC cell lines and tissue samples. Furthermore, SEMA3F expression was reactivated in CRC cell lines after treatment with 5-Aza-CdR, demethylation of SW620 cells resulted in cell colony formation and invasion inhibition. These findings suggest DNA methylation of promoter CpG island-mediated silencing of the tumor suppressor SEMA3F gene plays an important role in the carcinogenesis of CRC.     

S-腺苷甲硫氨酸抑制大肠癌细胞生长的实验研究

目的探讨S-腺苷甲硫氨酸(SAM)对人大肠癌细胞生长的抑制作用及抑癌机制。方法用SAM对大肠癌细胞系HT-29进行处理,使其癌基因c-myc和H-ras启动子区域甲基化。用噻唑蓝(MTT)法检测肿瘤细胞生长状态;甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)(MSP)法检测c-myc和H-ras启动子区域甲基化状态;细胞免疫荧光染色检测C-MYC和H-RAS蛋白的表达情况。结果大肠癌细胞系HT-29经SAM处理后,癌基因c-myc和H-ras启动子区域重新出现甲基化。经SAM处理的大肠癌细胞组与对照组相比,细胞生长受到明显抑制,差异有统计学意义(P<0.05);C-MYC和H-RAS蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SAM能使HT-29中癌基因c-myc和H-ras启动子区域重新甲基化,降低C-MYC和H-RAS蛋白的表达水平,且有效抑制了肿瘤细胞的生长,从而为肿瘤治疗提供了新的靶点。     

HAS-2沉默抑制大肠癌细胞上皮间质转化

目的本研究主要探讨HAS-2沉默前后对大肠癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响。方法分别用Realtime PCR及Western blot方法检测HAS-2 siRNA转染前后E-cadherin、Vimentin、Slug、Snail mRNA、蛋白表达水平变化,用免疫荧光法观察HAS-2 siRNA转染前后E-Cadherin、Vimentin表达的变化。结果 E-Cadherin蛋白和mRNA在大肠癌细胞的表达水平在HAS-2 siRNA转染组比阴性对照组明显上调(0.05),而Vimentin蛋白和mRNA,Snail mRNA and Slug蛋白在大肠癌细胞的表达水平在HAS-2 siRNA转染组表达水平比阴性对照组明显下调(0.05)。结论 HAS-2沉默对大肠癌细胞EMT有抑制作用。     

结直肠癌组织中端粒酶和pRb表达及其临床意义

目的：观察端粒酶和视网膜母细胞瘤基因蛋白（pRb）在结直肠癌中的表达,并探讨它们之间的相关性。方法：应用免疫组化法检测48例结直肠癌组织中端粒酶和pRb的表达,并用统计学方法分析表达结果与结直肠癌临床病理因素间的关系。结果：结直肠癌中端粒酶和pRb的阳性表达率分别为87．5％和56．3％,且与结直肠癌区域淋巴结转移和临床分期关系密切（P〈0．05）,端粒酶表达还与组织病理学分级密切相关（P〈0．05）。结论：检测结直肠癌组织中端粒酶和pRb的表达有助于结直肠癌患者的预后评估,结直肠癌组织中端粒酶与pRb表达呈显著负相关关系,两者可能从不同方面共同促进结直肠癌的发生。     

Syk与VEGF-C在乳腺癌中的表达及临床意义

目的:检测Syk与VEGF-C在乳腺癌组织中的表达情况,探讨它们与乳腺癌病理、临床特征间的关系.方法:应用免疫组化Elvsion法检测64例乳腺癌患者手术切除的癌组织和癌周正常组织中Syk和VEGF-C的表达情况.结果:Syk在正常组织中表达的阳性率为90%,在乳腺癌组织中阳性表达率为59.37%;VEGF-C在正常组织中阳性表达率为0.0%,在乳腺癌组织中的阳性表达率为76.56%;二者比较差异均有统计学意义(P＜0.05).Syk与VEGF-C表达水平均与乳腺癌病理分级、临床分期、淋巴结转移有关(P＜0.05).结论:联合检测乳腺癌中Syk和VEGF-C表达水平,对乳腺癌的早期发现及预后判断有一定参考价值.