SIRT1基因在糖尿病性白内障患者晶状体上皮细胞表达的初步研究

目的:探讨SIRT1基因在糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的表达.方法:选取2012-01/2014-10来我院治疗的糖尿病性白内障患者、年龄相关性白内障患者和外伤性白内障患者各20例,采用RT-PCR法检测各组患者晶状体上皮细胞中SIRT1基因含量,Western blot法检测晶状体上皮细胞中SIRT1蛋白含量,TUNEL法检测晶状体上皮细胞的凋亡率.结果:RT-PCR检测结果显示,外伤性白内障患者组SIRT1 mRNA相对含量最高为1.000±0.078,其次为年龄相关性白内障患者组为0.427±0.067,糖尿病性白内障组为0.389±0.112,与外伤性白内障组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blot检测显示,外伤性白内障患者晶状体上皮细胞中SIRT1蛋白的表达量最高,其次是年龄相关性白内障组,糖尿病性白内障组SIRT1蛋白的表达量最低;TUNEL法检测结果显示,外伤性白内障组和年龄相关性白内障组患者LECs细胞凋亡率分别为(4.5±2.3)％和(8.7±4.1)％,差异无统计学意义;而糖尿病性白内障组LECs凋亡率为(24.3±6.1)％,与外伤性白内障组及年龄相关性白内障组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:糖尿病性白内障患者晶体上皮细胞中SIRT1基因及蛋白表达下降,提示该基因参与了糖尿病性白内障的发生,这为我们今后进一步的研究提供了可靠的理论依据.探索调节SIRT1基因在晶状体上皮细胞中表达的有效途径,将为糖尿病性白内障的早期干预治疗提供新的思路.     

核因子κB在年龄相关性白内障晶状体前囊膜的表达

目的研究核因子κB（NF-κB）在正常人、年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜上皮细胞中表达的差异,探讨NF-κB在年龄相关性白内障发病机制中的作用。方法收集白内障术中60例60眼年龄相关性白内障的前囊膜组织（白内障组）,选取正常供体5例10眼的透明晶状体前囊膜组织作为正常对照组。取白内障组30眼标本和正常对照组5眼标本用于免疫组织化学法检测NF-κBp65蛋白在晶状体前囊膜上皮细胞中的表达;另外白内障组30例标本及正常对照组的5例标本采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法检测NF-κBp65mRNA在晶状体前囊膜上皮细胞中的表达。结果正常晶状体前囊膜上皮细胞细胞质和细胞核中可见NF-κBp65蛋白的弱阳性表达,以细胞质为主;年龄相关性白内障晶状体前囊膜上皮细胞的细胞质和细胞核中NF-κBp65蛋白呈强阳性表达。白内障组NF-κBp65吸光度（A）值为0.1658±0.022,正常对照组为0.2889±0.043,差异有统计学意义（t=6.2109,P〈0.05）。白内障组NF-κBp65mRNA表达量为1.454±0.081,正常对照组为0.951±0.075,差异有统计学意义（t=12.9683,P〈0.05）。结论 NF-κB表达水平的升高与年龄相关性白内障的发病密切相关,其表达异常可能参与年龄相关性白内障的发生发展。     

晶状体上皮细胞凋亡及bcl-2、bax表达与年龄相关性白内障形成的关系

目的：探讨晶状体上皮细胞凋亡与年龄相关性白内障发生的关系。方法：用透射电镜观察2例年龄相关性白内障患者和1例正常人晶状体上皮细胞的超微结构。用脱氧核苷酸末端转移酶缺口标记原位细胞检测法(the terminal deoxynucleotidyl transferasa(TdT)-medinted dUTP nick-end labeling TUENl)检测晶状体上皮的凋亡细胞。采用链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶标免疫组织化学法(streptavidin-peroxidase,SP)染色，镜下检测46例年龄相关性白内障患者和13例健康成年人、7例胚胎的晶状体上皮细胞的bax基因与bc1—2基因的表达情况。结果：在年龄相关性白内障患者的晶状体上皮细胞的超微结构中可见凋亡之细胞，健康成年人晶状体上皮细胞正常。年龄相关性白内障患者的晶状体上皮细胞凋亡百分率为21．20％，健康成年人的晶状体上皮细胞凋亡百分率为0．25％。年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞的bax基因表达为100％，bcl—2基因表达为0％，健康成年组和胚胎晶状体上皮细胞的bax基因表达为0％，Lcl—2基因表达为100％。结论：晶状体上皮细胞的凋亡在年龄相关性白内障的发生中起重要作用。     

细胞色素c在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞凋亡中的作用

目的观察年龄相关性白内障晶状体上皮细胞细胞色素c表达情况，探讨其与晶状体上皮细胞凋亡的关系。方法取手术中取下的年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜。采用免疫组织化学染色法（SP）检测晶状体上皮细胞细胞色素c表达情况，TUNEL法检测晶状体上皮细胞凋亡情况，并分析与细胞色素c表达的关系。透射电镜观察分析晶状体上皮细胞超微结构。结果正常人晶状体上皮细胞可见细胞色素c均匀胞浆低表达。年龄相关性白内障组在细胞色素c胞浆低表达细胞中，可见散在分布的胞浆高表达细胞。TUNEL阳性细胞仅存在于白内障组。细胞色素c表达与凋亡指数成正相关（P〈0．01）。电镜下可见染色质边集、凋亡小体和线粒体肿胀等特征。结论晶状体上皮细胞凋亡可能参与年龄相关性白内障的形成，线粒体细胞色素c凋亡途径可能在白内障的发生发展中起重要作用。     

晶状体囊膜HSP 70的表达与年龄相关性白内障

目的 探讨年龄相关性白内障的发生与晶状体前囊膜中热休克蛋白70（HSP70）表达之间的相关性。方法 选取年龄为43—51岁的成年尸眼透明晶状体6例，取前囊膜；选择年龄相关性白内障患者6例，年龄为40～50岁，白内障手术时撕取前囊膜；行SDS—PAGE、Western—blot法检测样品中HSP70蛋白，并进行分析比较。结果 白内障患者晶状体囊膜中HSP70含量较正常人明显减少。结论 HSP70表达量的下降与年龄相关性白内障的发生有关。     

骨桥蛋白在白内障晶状体上皮细胞中的表达

目的：探讨骨桥蛋白（osteopontin，OPN）在白内障晶状体上皮细胞中的表达水平及作用。方法：采用免疫组织化学法检测22例前囊下性白内障、17例核性白内障、14例皮质性白内障患者和11例正常晶状体上皮细胞中OPN的表达，并进行阳性细胞计数和各组间比较。结果：OPN在前囊下白内障患者晶状体上皮细胞中的表达明显增多，其阳性表达率与核性白内障、皮质性白内障及正常人晶状体比较，差异有显著意义（P〈0．01）。结论：OPN在前囊下性白内障晶状体上皮细胞中表达阳性，在前囊下白内障的形成过程中可能起重要作用。     

晶状体上皮细胞中骨连蛋白的研究

目的对比骨连蛋白（SPARC）在不同年龄白内障及正常人晶状体中的表达,并对人品状体上皮细胞（LECs）进行热应激、氧化损伤等预处理后检测其骨连蛋白表达的变化,以探讨其在白内障发病机制中的作用。方法将80例不同年龄白内障患者平均分为4组（〈50岁组,50～65岁组,66～80岁组,〉80岁组）,于白内障超声乳化手术中环行撕囊后取晶状体的前囊膜,对照组取6例角膜移植手术供体眼的晶状体前囊膜。常规蛋白印迹法检测样品中SPARC的含量。将永生化人LECsSRA01／04解冻,传代培养。分为正常对照组、氧化损伤组、热应激处理组,蛋白印迹法观察各组SPARC的表达情况。结果组织样本对照组未检出SPARC表达,自内障组可见明确SPARC表达,并有随着年龄增长表达增加的趋势。细胞样本正常对照组未见明确SPARC表达,氧化损伤组、热应激处理组均可见SPARC表达上调。结论白内障患者LECs中SPARC较正常人表达增高,且随年龄的增长表达逐渐增高。氧化损伤及热应激可使LECs中SPARC表达上调,提示SPARC在白内障的发生发展中可能起一定的作用。     

年龄相关性白内障晶状体前囊膜中c-myc基因表达的研究

C—myc是原癌基因家族成员,是myc基因家族的重要成员之一。研究表明,在晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）中c-myc mRNA水平与发育期增生细胞的百分数成正比,当这些细胞进入静止期时,c—mycmRNA表达静止或减少。C—myc的过度表达可能促进年龄相关性白内障的发生。本研究对年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜及正常人晶状体中c-myc基因的表达进行检测,探讨c-myc在年龄相关性白内障发病机制中的作用。     

错配修复基因MSH3在人晶状体中的表达

目的　研究错配修复基因MSH3在人晶状体上皮细胞系SRA01/04、年龄相关性白内障（age-related cataract,ARC）患者晶状体组织以及24周人胎眼晶状体组织中的表达情况，探讨其与ARC形成的关系。方法　采用RT-PCR检测人晶状体上皮细胞系SRA01/04、ARC患者晶状体组织和健康人脐带（阳性对照）中MSH3基因的表达水平，免疫荧光检测24周人胎眼晶状体中MSH3蛋白的表达。结果　MSH3在晶状体上皮细胞系SRA01/04中高表达，在ARC患者晶状体组织中表达下调。MSH3在24周人胎眼晶状体纤维细胞、晶状体上皮细胞以及晶状体前囊组织中均有表达，且在晶状体上皮细胞中高表达。结论　MSH3在人胎眼晶状体组织和SRA01/04中高表达，而在ARC患者晶状体组织中表达下调，这种表达差异可能会影响DNA的错配修复过程，进而影响晶状体发育导致ARC的发生。     

年龄相关性白内障基因异常表达的研究

目的比较年龄相关性白内障晶状体上皮细胞(LEC)基因表达与正常人的差异,探讨白内障发病的分子机制。方法术中撕取晶状体前囊36眼,其中单纯核性年龄相关性白内障10眼,成熟期年龄相关性白内障19眼,角膜移植供体眼及外伤性晶状体脱位7眼(正常对照)。3组晶状体囊膜分别提取总RNA,将合格的各组RNA样品做差异显示(DD-RT-PCR),寻找差异表达基因,再将其分离、扩增、测序,最后选取与白内障形成密切相关的胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-5)及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)基因进行验证。结果各组RNA纯度达到要求,总RNA完整,经差异显示,年龄相关性白内障组比正常人组低表达的条带有5条,高表达条带15条。对6条明亮条带测序后,其中3个片段分别与IGFBP-5、LAMP-2及小核糖体蛋白10(rps10)有很高的同源性,其他3个片段均为新近克隆未知功能的基因或基因组序列。验证表明,年龄相关性白内障IGFBP-5表达水平低于正常对照(P<0.01),而年龄相关性核性白内障LAMP-2表达水平高于正常对照。结论IGFBP-5和LAMP-2是年龄相关性白内障相关基因,差异显示技术在研究年龄相关性白内障发生中有重要意义。     

老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡及相关基因蛋白的表达

目的 探讨老年性白内障与晶状体上皮细胞凋亡的关系。方法透射电镜下观察老年性白内障晶状体上皮细胞的超微结构；Tunel法检测凋亡细胞百分率；并对其晶状体上皮细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳；免疫组化法检测P53、bcl-2在老年性白内障晶状体上皮细胞中的蛋白表达。结果 透射电镜下发现老年性白内障晶状体上皮细胞中有凋亡细胞；凋亡细胞百分率为8．4％～37．8％，琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带；P53在老年白内障晶状体上皮细胞中蛋白表达率为16．9％～19．1％，bcl-2无蛋白表达。结论 老年性白内障的发生可能与其晶状体上皮细胞凋亡有关。     

色素上皮衍生因子在人晶状体上皮细胞表达的意义

目的:观察色素上皮衍生因子(PEDF)在人晶状体内的分布,探讨人晶状体上皮细胞(LEC)中PEDF表达水平与年龄及白内障发生发展的关系。方法:收集老年性和先天性白内障患者术中所取前囊膜、新鲜眼库眼透明晶状体样品,冰冻切片标本用间接免疫荧光组织化学法检测PEDF蛋白在人晶状体中的分布,前囊膜标本分别用蛋白质免疫印迹(Western-blot)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测LEC中PEDF蛋白和基因的表达水平。结果:人晶状体中存在PEDF蛋白,主要分布于前囊下LEC胞浆中。按透明晶状体、轻度白内障、重度白内障及年龄分组分析,人LEC内PEDF基因及蛋白的表达水平在晶状体由透明变混浊、混浊由轻变重的过程中呈下调趋势(P<0.01),且随着机体的衰老显著下降(P<0.01)。结论:人LEC中PEDF表达随晶状体衰老和白内障发生发展显著下调。     

水通道蛋白1在老年性白内障及透明晶状体前囊膜上皮细胞的表达

目的明确水通道蛋白1(aquaporin1,AQP1)在透明晶状体及老年性白内障晶状体上皮细胞及前囊膜的表达及分布,并初步探讨AQP1在老年性白内障发病中的重要作用。方法收集52例老年性白内障及10例正常透明晶状体前囊膜,通过HE染色和免疫组化方法检测AQP1的表达。结果老年性白内障及正常透明晶状体上皮细胞中均可见AQP1的表达,透明晶状体组中AQP1的阳性细胞表达率(100%)显著高于老年性白内障组(53.8%)(P<0.05)。而在晶状体纤维中未见表达。结论晶状体上皮细胞是晶状体代谢最活跃的部位,终身进行有丝分裂,并移行至赤道部分化成晶状体纤维。晶状体上皮细胞有AQP1的活性表达,这对于维持晶状体上皮细胞一定的增殖潜能,保证晶状体的生理动态平衡和晶状体的透明性起到了重要的作用。提示AQP1在老年性白内障晶状体前囊膜及上皮细胞中的异常表达与老年性白内障的发生密切相关,具体调控机制有待进一步研究。     

p53和 bcl-2在老年性白内障晶状体上皮细胞中的蛋白表达

目的：研究p53,bcl-2基因在老年性白内障晶状体上皮细胞中的蛋白表达，探讨p53,bcl-2在老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡中的作用。方法：应用免疫组织化学方法，对30例老年性白内障及10例正常透明晶状体上皮细胞进行p53,bcl-2基因蛋白表达的检测，计算p53,bcl-2基因蛋白表达阳性细胞百分率，结果：p53在正常晶状体上皮细胞中无蛋白表达，在老年性白内障晶状体上皮细胞中蛋白表达率为16．9％－19．1％，bcl-2在2组中均无蛋白表达，结论：p53在老年性白内障晶状体上皮细胞中蛋白高表达，p53可能促进了老年性白内障中晶状体上皮细胞的凋亡。     

正常幼儿及不同年龄段白内障患者晶状体中常见miRNA的表达

目的：检测并分析miRNA在正常幼儿及不同年龄段白内障患者晶状体中的表达差异,初步探讨其在维持晶状体正常功能和不同年龄段白内障形成中的可能作用。

方法：使用stem-loop RT-PCR法检测正常幼儿和幼儿(先天性白内障)、中青年及老年(年龄相关性白内障)白内障患者晶状体中miRNA的表达情况,比较各组间miRNA表达差异。

结果：正常幼儿晶状体中miR-184表达量最高。与正常幼儿相比,白内障幼儿晶状体中miR-184、miR-182表达升高,miR-124、miR-204表达降低。与幼儿患者相比,中青年患者晶状体中miR-204、miR-124和let-7d表达升高,miR-184、miR-183和let-7a表达降低,而老年患者晶状体中所有被检测miRNA表达均有改变,其中miR-182、miR-204、miR-124表达均升高,miR-184、miR-181b、miR-183、miR-125b、let-7a/b/d表达均降低。

结论：正常幼儿及不同年龄段白内障患者晶状体中miRNA表达差异显著,部分miRNA与晶状体的正常形态、功能及某些病理状态相关,这为进一步研究miRNA在维持幼儿晶状体正常功能及不同年龄段白内障形成过程中的可能作用机制提供了理论依据。     

蛋白激酶C-α在晶状体上皮细胞中的表达及其与白内障关系的研究

目的 研究蛋白激酶C-α(PKC-α)在晶状体上皮细胞中的表达及其在皮质性白内障形成过程中的变化及作用。方法 离体培养的大鼠晶状体,应用Western-blot检测蛋白激酶C在晶状体上皮细胞中的表达和分布;H_2O_2诱导大鼠皮质性白内障形成,Western-blot检测晶状体上皮细胞内蛋白激酶C-α的蛋白表达变化;RT-PCR检测其mRNA含量改变。同时,流式细胞仪检测晶状体上皮细胞调亡率。结果 在正常晶状体上皮细胞中PKC-α高表达,经H_2O_2处理产生凋亡的晶状体上皮细胞中PKC-α的蛋白表达和mRNA含量均降低,与对照组比较,差异有显著意义(P<0.05)。结论 H_2O_2可抑制大鼠晶状体上皮细胞中PKC-α的活性,提示PKC-α与白内障的发生发展有关。     

Pigment Epithelium-derived Factor in Cataractous Aqueous Humor and Lens Epithelial Cells

Purpose: To study the characteristics of PEDF in cataractous aqueous humor and its expression in human lens epithelium. Methods: The PEDF concentration in the aqueous humor was measured by enzyme -linked immunosorbent assay in senile (130cases) and congenital (18cases) cataract patients who underwent cataract phacoemulsification extraction surgery. Anterior lens capsular specimens were obtained from these patients to count lens epithelial cells (LEC) density. The Lens Opacities Classification System Ⅲ was used to classify the senile cataracts as cortical, nuclear, posterior subcapsular and mixed types of opacity, and quantitative analysis of the nuclear opacities was performed by Pentacam Scheimpflug imaging system. Anterior lens capsular specimens from another senile (10cases) and congenital (10cases) cataract were collected for immunofluorescence with polyclonal antibodies specific to human pigment epithelium -derived factor (PEDF). Results:The mean aqueous level of PEDF was(178. 9±87. 5)ng/ml, and there was negative linear correlation of PEDF level and age (r=0. 811, P<0. 001). In senile cases, the aqueous PEDF concentration decreased with increasing nuclear opacities (r=0. 447, P < 0.01) , and the mean PEDF level in nuclear cataract was significantly lower than that in posterior subcapsular opacity (P < 0.01) . PEDF immunostaining was detected in LEC of all capsular specimens. Conclusion : The PEDF level in human aqueous humor is related to age, types of cataracts and lens opacity. PEDF also express in human LEC. The study results suggest PEDF may regulate and/or protect LEC by paracrine and autocrine, and lack of PEDF may play a role in cataractogenesis.     

老年性白内障患者血清及房水中SOD、MDA表达与后囊膜混浊的关系

目的　探究老年性白内障患者血清及房水中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）表达与后囊膜混浊的关系。方法　选取2017年5月至2021年4月我院收治的200例（200眼）老年性白内障患者作为观察组,另选取同期健康体检者60名（60眼）作为对照组。比较两组受检者血清及房水中SOD、MDA表达,并评价受检者血清及房水中SOD、MDA对老年性白内障的诊断价值,分析老年性白内障患者术后后囊膜混浊发病的影响因素。结果　观察组患者血清及房水中SOD表达均较对照组低,血清及房水中MDA表达均较对照组高（均为P<0.05）。血清及房水中SOD、MDA联合诊断老年性白内障的AUC最大,为0.914（95%CI:0.873～0.945）,敏感度为86.67%,特异度为82.00%。年龄,人工晶状体材料,血清及房水中SOD、MDA含量手术前后差值绝对值均为老年性白内障患者术后后囊膜混浊发生的独立影响因素（均为P<0.05）。结论　老年性白内障患者血清及房水中SOD、MDA含量均存在一定变化,检测其表达水平,可为疾病诊断及术后后囊膜混浊预测提供参考依据。     

正常与老年白内障晶体生化研究

分析正常和老年性白内障晶体可溶性蛋白与不溶性蛋白、谷胱甘肽含量、17种元素含量、晶体皮质与核pH 测定。发现老年性白内障晶体可溶性蛋白含量比正常晶体减少(52.6%比94.2%),而不溶性蛋白增加(47.4%比5.8%),凝胶电泳呈现老年性白内障晶体与正常晶体蛋白有差异,谷胱甘肽含量减少与老年性白内障的程度及持续时间有关,老年性白内障晶体比正常的钙离子增高,而锌与钾离子减少,并讨论这些改变的意义。     

Cation pump activity and membrane permeability in human senile cataractous lenses

The majority of human senile cataractous lenses show a progressive alteration of electrolyte levels resulting in increased lens sodium and decreased potassium, and a concomitant increase in lens water. These changes are known to be associated with the cortical type of senile cataract. The aim of this study was to investigate the mechanisms responsible for the osmotic imbalance in cortical cataract.Determination of Na,K-ATPase activity gave a wide range of values that were not significantly different from normal controls, but rubidium influx showed a normal accumulation in cataractous lenses demonstrating a normal functioning of the cation pump. Both sodium influx and rubidium efflux are increased in the cataractous lenses and the increase is proportional to the absolute level of lens sodium. These results suggest that the biochemical change responsible for the osmotic imbalance in human senile cataract is not a defect in the cation pump mechanism but rather an increase in lens membrane permeability.