人纤溶酶原Kringle 5区的基因克隆的表达及纯化

目的克隆人纤溶酶原Kringle5(K5)区基因,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定.方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因,构建K5的原核表达载体pET-22b(+)-K5-6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+-树脂亲和层析进行纯化,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性.结果经PCR成功扩增出了243 bp的K5区基因,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET-22b(+),重组质粒在BL21中成功表达出分子量为14 000的蛋白质,纯化后的蛋白纯度达95%,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能,K5蛋白浓度为4 μg/mL时抑制率达50%.结论纤溶酶原K5的成功克隆、表达及纯化可能在肿瘤和动脉粥样硬化的抗血管生成治疗中具有一定作用.     

人纤溶酶原Kringle 5区的基因克隆的表达及纯化

目的克隆人纤溶酶原Kringle5(K5)区基因,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定.方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因,构建K5的原核表达载体pET-22b(+)-K5-6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+-树脂亲和层析进行纯化,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性.结果经PCR成功扩增出了243 bp的K5区基因,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET-22b(+),重组质粒在BL21中成功表达出分子量为14 000的蛋白质,纯化后的蛋白纯度达95%,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能,K5蛋白浓度为4 μg/mL时抑制率达50%.结论纤溶酶原K5的成功克隆、表达及纯化可能在肿瘤和动脉粥样硬化的抗血管生成治疗中具有一定作用.     

具有抗血管新生活性的K5突变体GST-K5M5基因的构建、表达及纯化

目的构建可溶性的人纤溶酶原Kringle 5(K5)突变体GST-K5M5基因,并在单位体积的原核系统中获得高表达、高纯度、可水溶的融合GST-K5M5蛋白粉针剂。方法 K5M5突变体基因(模板已经对K5N端5个带负电的酸性氨基酸进行中性氨基酸丝氨酸的中性突变),通过PCR从本实验室保存的pET22b(+)/K5mut5 cDNA模板中扩增得到,再克隆到pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表达系统中。用自动诱导培养系统诱导其表达,提高产量。通过GST树脂亲和层析柱分离,双蒸水透析纯化,再制成冻干粉剂保存。结果该重组GST-K5M5蛋白的分子量为37000Mr,通过SDS-PAGE和Western-blot可以检测到其存在。冻干粉复溶的GST-K5M5呈剂量依赖抑制内皮细胞的增殖。结论在以前的研究基础上设计并用自动诱导培养的方法在大肠杆菌中表达纯化出了GST-K5M5融合蛋白,得到的GST-K5M5蛋白产量高、纯度高、可溶性好、生物学效应强,且方法简便、经济,为工业大规模发酵提供了基本参数。     

药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸的酶法合成

目的 利用在大肠杆菌中高效重组表达的O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶A(OASS-A)合成药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸,并对合成产物进行纯度及结构鉴定.方法 通过PCR扩增目的基因Cys K,并连接到pET-22b(+)载体上构建原核表达质粒,重组体转到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达,重组蛋白采用Ni2-树脂柱亲和层析纯化,利用SDS-PAGE鉴定表达纯化蛋白,通过HPLC对合成产物纯度进行检测,应用1H NMR技术对化合物进行结构鉴定.结果 成功构建了OASS-A原核表达载体,在IPTG诱导下获得了高效表达.重组酶高效合成非蛋白质氨基酸S-苯基-L-半胱氨酸.合成的化合物以晶体形式析出,采用HPLC和1HNMR技术对其结构进行了鉴定,合成产物的纯度为100％.结论 利用大肠杆菌中重组表达的OASS-A能够高效合成药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸.     

华支睾吸虫的一个μ型GST基因的表达、纯化与免疫反应性鉴定

[目的]扩增华支睾吸虫一个μ型谷胱甘肽转移酶(mu-class glutathione transferase of Clonorchis sinensis,CsGSTM)基因,明确是否存在内含子,进行原核表达,纯化其表达产物,鉴定免疫反应性.[方法]用PCR方法从成虫cDNA文库和基因组中扩增出目的基因,测序,定向克隆到原核表达载体pET-30a( ),在大肠杆菌BL21/DE3表达,按照Ni-NTAagarose说明书纯化重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、薄层色谱(thin-layer chromatography,TLC)和免疫印迹(Western blotting)分析.[结果]CsGSTM基因全长657 bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a( )-CsGSTM在大肠杆菌中得到了有效表达,Mr,pET-30a( )-CsGSTM=31×103.重组蛋白达总蛋白的39%,纯化后的重组蛋白纯度为98%,重组蛋白在纯化前后均有免疫反应性.[结论]CsGSTM基因没有内含子,在大肠杆菌中能有效表达,纯化前后的重组蛋白都具有免疫反应性.     

人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)抑制小鼠肝癌的血管生成和肿瘤生长

[目的]体内、体外实验观察人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)对肝癌血管生成和肿瘤生长的影响.[方法]大肠杆菌中表达,组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5蛋白,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定K5蛋白的表达;MTT法分析K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞(BRCEC)和肝癌细胞株Bel-7402、HepG2增殖的影响;建立皮下种植肝癌鼠模型,瘤内注射K5,检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度(MVD).[结果]SDS-PAGE及Western blot鉴定获得K5纯化蛋白;K5特异性地抑制BRCEC的增殖,IC50=160 nmol/L,而对肝癌细胞株Bel-7402、HepG2的增殖无抑制作用;K5显著抑制小鼠肝癌生长,治疗组肝癌组织MVD明显低于对照组.[结论]K5抑制移植性小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长,特异性抑制血管内皮细胞的增殖可能是K5抑制肝癌血管生成的主要机制.K5具有治疗肝癌的潜在临床价值.     

GL1-EGFP融合蛋白的原核表达及对神经胶质瘤细胞的靶向作用分析

[目的]构建、纯化神经胶质瘤靶向肽GL1和EGFP融合蛋白表达载体(GL1-EGFP),并且分析其靶向作用。[方法]通过PCR扩增目的基因GL1-EGFP,并连接到pET-22b(+)载体上构建原核表达质粒,重组体转到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达,重组蛋白利用Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达纯化蛋白,激光共聚焦显微镜检测GL1-EGFP对神经胶质瘤细胞的靶向作用。[结果]构建了GL1-EGFP原核表达载体,在IPTG诱导下获得了高效表达。Western blotting分析证明纯化蛋白为目的蛋白GL1-EGFP。体外细胞实验表明GL1-EGFP融合蛋白对神经胶质瘤细胞U87△EGFR具有靶向作用。[结论]GL1-EGFP靶向融合蛋白对恶性神经胶质瘤细胞有明显的靶向定位作用。     

重组apo(a) Kringle Ⅳ-10的纯化及生物活性

目的:通过研究重组apo(a) Kringle Ⅳ-10(KⅣ-10) 的赖氨酸结合能力对纤溶酶原与内皮细胞结合的影响,探讨apo(a)在抑制纤溶过程中的作用,为Lp(a)致动脉粥样硬化机制研究提供依据.方法:将含apo (a) 野生型KⅣ-10 (wt-KⅣ-10 / Trp72)和突变型KⅣ-10 (mut-KⅣ-10/Arg72)基因片段的重组质粒,分别转化至E.coli DH5α菌株中并表达含这2个重组片段的融合蛋白,通过Glutathione-Agarose beads亲和层析进行分离和提纯,经L-Lys-Sepharose 4B亲和层析检测其赖氨酸结合能力.再以异硫氰酸荧光素标记的纤溶酶原为配基,观察这2种基因表达片段对纤溶酶原与人脐静脉内皮细胞结合的影响.结果:实验结果显示:在E.coli DH5α菌株中表达的GST-wt-KⅣ-10/Trp72能有效抑制纤溶酶原与人脐静脉内皮细胞的结合;而GST-mut-KⅣ-10/Arg72在任一浓度范围内均无这种抑制作用.结论:apo (a) KⅣ-10对纤溶的抑制作用与其赖氨酸结合能力密切相关;而KⅣ-10的赖氨酸的结合能力与其赖氨酸结合位点中的Trp72有关.     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

重组apo（a）KringleⅥ—10的纯化及生物活性

目的：通过研究重组apo(a)KringleⅣ-10（KⅣ-10）的赖氨酸结合能力对纤溶酶原与内皮细胞结合的影响。探讨apo(a)在抑制纤溶过程中的作用，为La(a)致动脉粥样硬化机制研究提供依据。方法：将含apo(a)野生型KⅣ-10（wt-KⅣ-10/Trp^72)和突变型KⅣ-10(mut-KⅣ-10/Arg^72)基因片段的重组质粒，分别转化至E.coliDH5α菌株中并表达含这2个重组片段的融合蛋白，通过Glutathione-garose beads亲和层析进行分离和提纯，经L-Lys-Sepharose4B亲和层析检测其赖氨权结合能力。再以异硫氰酸荧光素标记的纤溶酶原为配基，观察这2种基因表达片段对纤溶酶原与人脐静脉内皮细胞结合的影响。结果：实验结果显示；在E.coliDH5α菌株中表达的GST-wt-KⅣ-10/Trp^72能有效抑制纤溶酶原与人脐静脉内皮细胞的结合；而GST-mut-KⅣ-10/Arg^72在任一浓度范围内均无这种抑制作用。结论：apo(a)KⅣ-10对纤溶的抑制作用与其赖氨酸结合能力密切相关；而KⅣ-10的赖氨酸的结合能力与其赖氨酸结合位点中的Trp^72有关。     

人胎盘纤溶酶原的分离纯化

目的 建立从人胎盘组织中分离纯化天然型纤溶酶原的方法.方法 采用Lys-sepharose 4B亲和层析和 Sephadex G-25层析法分离纯化纤溶酶原.采用发色底物法测定纤溶酶原活性,SDS-PAGE鉴定纤溶酶原纯度.结果 获得电泳纯天然型纤溶酶原(Glu-plg),比活441.520%/mg.结论 该法原料来源丰富、成本低廉、操作简单,为获取纤溶酶原提供了新方法.     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

α-OGG1与ACO2蛋白的表达纯化及其相互作用鉴定

[目的]原核表达纯化获得可溶性α-OGG1,ACO2蛋白并初步鉴定其相互作用.[方法]将α-OGG1,ACO2基因构建到pGEX-4T-2-TEV和pET-28a-TEV表达载体上,转化至BL21(DE3)大肠杆菌.IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni柱和GST柱亲和层析法纯化目标融合蛋白;采用SDS-PAGE检测表达产物;采用GST-Pulldown方法鉴定蛋白与蛋白的相互作用;采用双质粒共转化,表达纯化α-OGG1,ACO2蛋白复合体.[结果]成功克隆并构建了α-OGG1及其N-半段、C-半段基因和ACO2基因的原核表达载体,并转化至大肠杆菌表达.通过Ni柱和GST柱亲和层析法得到可溶性表达的6×His_α-OGG1(1-326)和GST_ACO2(29-780)蛋白,SDS-PAGE检测结果表明2个蛋白条带均与理论大小相符.GSTPulldown实验结果证实α-OGG1与ACO2直接相互作用.通过共转化、表达纯化得到了α-OGG1与ACO2的复合物.[结论]采用原核表达和亲和层析纯化得到了可溶性6×His_α-OGG1,GST_ACO2融合蛋白及两者的复合体,并初步证实α-OGG1与ACO2存在直接相互作用.     

大鼠IgE依赖组胺释放因子重组蛋白纯化效果的优化

目的提高大鼠IgE依赖组胺释放因子(rHRF)的可溶性表达水平,改善其亲和层析纯化效果,为深入研究该重组蛋白的生物学功能奠定基础。方法选择多克隆酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ,将rHRF完整编码区基因从原有的pET-30a-rHRF重组质粒亚克隆至pET-28a载体,构建重组质粒pET-28a-rHRF;转化大肠杆菌BL21(DE3)后,通过改变IPTG浓度(0.1～1.0mmol/L),调节诱导表达温度(25～37℃)和时间(1～5h),筛选能够提高rHRF可溶性表达水平的条件;同时改进亲和层析纯化的条件,提高纯化效果。结果成功构建重组质粒pET-28a-rHRF,不同IPTG浓度、诱导温度和时间对重组蛋白的可溶性表达水平无明显影响。但是,与pET-30a-rHRF转化菌相比,pET-28a-rHRF转化菌所表达的重组蛋白因其N端和C端均带有6×his标签,增强了目的蛋白与树脂的结合力,而使亲和层析纯化效果(重组蛋白的浓度和纯度)显著提高。结论rHRF重组蛋白的可溶性表达水平不受IPTG浓度、诱导表达温度和时间的影响,但是可溶性重组蛋白两端均携带6×his标签可使亲和层析纯化效果显著提高,从而有利于获得足量rHRF用于进一步的生物学功能研究。     

人DNA聚合酶δ结合蛋白PDIP38的克隆、表达和纯化

[目的] 克隆表达和纯化野生型及 3种缺失突变型人 PDIP38 谷胱甘肽 S 转移酶( glutathion S transferase,GST)融合蛋白.[方法]采用常规 PCR扩增法得到野生型及 3种缺失突变型人 PDIP38的 cDNA; 4种 cDNA与 GST融合载体 pGEX-4T-1重组并转化大肠杆菌 DH5α;采用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定插入的 DNA序列;采用谷胱甘肽-sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白.[结果] 野生型和 3种缺失突变型人 PDIP38 GST融合蛋白在 DH5α中高效表达;经谷胱甘肽-sepharose 4B亲和层析柱一步纯化后, 4种蛋白的纯度均达到 85%以上.[结论] pGEX-4T-1 GST蛋白融合载体可高效表达人 PDIP38蛋白;用谷胱甘肽-sepharose 4B亲和层析柱一步纯化法可简单、快速地得到高纯度的蛋白.     

PTD-SH2融合蛋白的原核表达和纯化

目的:构建含SH2与蛋白转导结构域(PTD)融合基因片段的重组表达载体,在大肠杆菌中进行表达并纯化蛋白. 方法: 通过PCR方法扩增出SH2基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD 的下游构建重组质粒pET-16b-PTD-SH2,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果:构建了重组融合表达质粒pET-16b-PTD-SH2, 表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr为15×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的16%, 可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后得到了目的蛋白. 结论: 成功构建了PTD-SH2的重组表达载体,使融合蛋白在E. coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为后续的SH2结构域的功能研究奠定了基础.     

猴D型逆转录病毒p27基因的克隆表达及诊断价值评价

目的 克隆表达猴D型逆转录病毒(SRV) p27基因,评价其诊断价值.方法 PCR扩增p27基因片段,定向克隆至原核表达载体pET-28b(+),重组质粒转化大肠杆菌Rosetta (DE3)中诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,目的蛋白经镍柱亲和层析纯化后用ELISA方法评价其诊断价值.结果 重组质粒转化宿主菌后在37℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓-度为0.5 mmol/L的条件下诱导4h,可溶性p27蛋白表达量最大,且具有免疫学活性.纯化后测定融合蛋白浓度为2.043 g/L,纯度93.3％,以融合蛋白为诊断抗原包被ELISA板检测3份标准阳性血清和22份阴性血清,检出率为100％.结论 p27基因成功表达并具有良好的反应原性,可作为猴D型逆转录病毒血清学检测的候选抗原.     

结核分枝杆菌GroEL2蛋白表达、纯化及生物信息学分析

目的 克隆、表达和纯化结核分枝杆菌H37Ra株GroEL2蛋白，并进行生物信息学分析。方法 以结核分枝杆菌H37Ra株基因组DNA为模板，PCR扩增GroEL2基因，克隆至pET-28a载体中，构建重组pET-28a-GroEL2载体，将其转化至BL21(DE3)菌株中，在异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达后，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳分析表达产物，镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱纯化重组GroEL2蛋白，Western blot鉴定GroEL2的表达效果。利用生物信息学方法对GroEL2蛋白的理化性质、蛋白结构、抗原表位等进行预测。结果 成功构建重组pET-28a-GroEL2表达载体，在大肠杆菌中以可溶形式表达GroEL2蛋白。Ni-IDA亲和层析柱纯化重组GroEL2蛋白，纯度达90%以上。生物信息学分析显示其能与多种蛋白相互作用，且存在多个潜在的T细胞、B细胞...     

导向性IFN-α2a-α-MSH基因的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建导向性IFN-α2a-α-MSH融合基因的原核表达载体,并建立重组蛋白的原核高效表达体系.方法:将本实验室已构建的pET-22b( )IFN-α2a-NGR用BamH Ⅰ和SalⅠ限制性内切酶进行双酶切,将得到的大片段与设计的α-MSH多肽片段退火后的产物进行连接,构建原核表达载体pET-22b( )IFN-α2a-α-MSH,将序列鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta-gamiTM2(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达目的蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定.结果:在大肠杆菌中成功实现了IFN-α2a-α-MSH的稳定高效表达,表达产物以包涵体形式存在,采用超声裂菌的方法,用疏水作用层析技术获得较高纯度的重组蛋白.结论:成功克隆、表达和纯化了IFN-α2a-α-MSH蛋白.