神经干细胞移植在缺血性脑损伤治疗中的应用

20世纪90年代以来,神经干细胞（neural stem cell,NSC）相继从胚胎和其他成体哺乳动物的中枢神经系统分离培养成功,“中枢神经系统受损后不能再生”的传统观点被打破,这为中枢神经系统疾病的治疗提供了新途径。NSC的研究成为神经科学领域研究的热点。NSC能分化为神经元和神经胶质细胞,参与脑组织结构和功能的修复,还可作为基因修饰载体用于中枢神经系统疾病的基因治疗。     

神经干细胞移植治疗大鼠脑外伤

已有报道表明神经干细胞移植可在一定程度上恢复受损中枢神经系统的功能[1,2],其治疗机制是通过移植入宿主体内的神经干细胞在中枢神经系统损伤部位定居、增殖并分化成具有修复神经损伤功能的神经元和神经胶质细胞等,同时这些分化的神经元应能与周围神经系统建立起正确的突触联系[3]。     

PKH26荧光示踪剂在神经干细胞移植大鼠创伤性脑损伤中的应用

目的探讨神经干细胞移植创伤性脑损伤（TBI）过程中有效的示踪剂,并进一步观察移植后NSCs的自然存活与分化情况。方法Feeney法制备大鼠TBI模型;将体外培养的NSCs进行PKH26荧光示踪剂标记,并于损伤后第3天移植入脑损伤灶区,对照组注射等量生理盐水。分别于移植后1天、4天、7天及2周、3周、4周、8周取材,行全脑冷冻切片,观察PKH26标记的NSC的自然存活及分布情况;Nestin、βⅢ-微管蛋白和GFAP免疫细胞化学染色观察移植后NSCs的分化。同时,于取材前采用Corner试验进行神经行为学检测。结果PKH26标记NSCs的阳性率＞95%。移植后第1天、4天,NSCs主要分别于注射部位周围,细胞胞体较小,分布均匀,大部分仍为Nestin阳性表达细胞。移植后第7天,移植NSCs可迁移至嗅球、额叶及枕叶皮质等区域。针道及周围组织NSCs分化为神经元和神经胶质细胞的比例分别为12.3％±2.1％和372％±7.6％。移植后第2周,海马、脑桥、小脑普肯耶细胞层等广泛区域均可见移植细胞。移植后第4～8周,移植细胞存活数量呈减少趋势。移植细胞的PKH26染色未见明显减弱。同一时间段内,与对照组相比,NSCs移植组动物的感觉运动功能均有明显改善。结论PKH26荧光示踪剂可用于体外培养的NSCs脑内移植示踪观察。移植NSC于损伤灶区,可自然分化为神经元和神经胶质细胞,并可迁移至脑内多处远距离部位,能明显改善TBI动物的感觉运动功能。     

基因工程神经干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤研究进展

缺氧缺血性脑损伤( hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因.目前临床上常用的治疗新生儿HIBD的方法如高压氧疗法、亚低温疗法等都仅局限于对症、支持治疗,只能在一定程度上缓解症状,尚难从根本上恢复神经系统功能.大量研究[1-3]发现,通过移植具有多向分化潜能的神经干细胞( neural stem cells,NSCs)能减少HIBD新生大鼠由于局部缺血而导致的神经细胞死亡,使之运动和学习记忆能力均得到提高.将经过基因修饰的NSCs进行移植,有望为HIBD的治疗提供一个崭新的思路.     

叶酸联合成体神经干细胞治疗创伤性脑损伤大鼠的实验

目的观察叶酸联合成体神经干细胞对创伤性脑损伤大鼠的治疗作用,探讨其可能作用机制。方法 120只Wistar大鼠随机分为6组,正常组,模型组,假手术组,叶酸注射组,成体神经干细胞移植组,成体神经干细胞移植+叶酸注射组。倒置显微镜下观察神经干细胞形态学变化;流式细胞仪检测神经干细胞表面标记物CD105、CD45、CD44、CD29的表达;免疫荧光法检测神经元特异性烯醇酶(NSE成熟神经元的特异性标志)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP胶质细胞的标记物)的表达;平衡木实验检测大鼠运动协调与整和能力;Morris水迷宫实验测试各组大鼠的学习记忆能力;HE染色及Brdu免疫组化实验观察脑组织形态学变化;酶联免疫吸附试验检测大鼠脑组中脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)的表达;蛋白质印迹法检测脑组织中凋亡相关蛋白BCL-2、Bax、Caspase-3的表达。结果分离所得细胞能在体外传代培养,流式细胞仪检测发现细胞阳性表达CD44、CD29,阴性表达CD105、CD45,细胞经胎牛血清诱导分化后能形成NSE或GFAP阳性细胞。实验表明,叶酸与成体神经干细胞干预创伤性脑损伤大鼠模型后能显著改善其行为学变化,减轻脑组织的炎症反应,恢复受损神经细胞,增加脑组织内BDNF、NGF的含量,上调BCL-2的表达,下调Bax、Caspase-3的表达。结论叶酸联合成体神经干细胞干预创伤性脑损伤大鼠能显著改善中枢神经功能,对维持神经元微环境稳态具有重要的作用。     

脑损伤的修复与神经干细胞移植的研究进展

中枢神经系统受损后再生非常困难。传统观点认为，“神经组织损伤不能再生”，“成年动物神经细胞不能分裂”、“哺乳运动中枢神经系统的神经元只产生于胚胎期及出生后不久的一段时间，其后神经元的分裂即告结束”。因此，当中枢神经系统由于创伤、缺血及变性疾病等原因造成大量神经元缺失时，因不能产生新的神经元，建立新的突触联系，     

移植的神经干细胞在脑损伤区壳聚糖载体中的存活与分化

目的:探讨移植的NSCs在大鼠脑损伤区壳聚糖载体中的存活、分化情况及其对TBI大鼠认知功能的影响。方法:低温冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架。将从鼠胚前脑中分离的NSCs扩增、标记BrdU。Feeney法制备SD大鼠TBI模型,随机分为3组:损伤对照组清创后不做移植;NSCs 支架移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植;NSCs 支架 NGF移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植,并在其中加入NGF。术后1、2、3个月行避暗回避和跳台试验。脑切片行Nissl染色、BrdU与NF-200免疫荧光双标染色。结果:两移植组的认知功能在术后1、2、3个月较损伤对照组明显改善,含NGF的移植组改善更加显著。两移植组术后1、2、3个月在移植区均可见BrdU与NF-200免疫荧光双标细胞,含NGF移植组中的双标细胞数量多、胞体大、突起多且长。结论:大鼠TBI后移植的外源性NSCs可以在脑损伤区壳聚糖载体中长期存活并向神经元分化,可以改善大鼠的认知功能;NGF对其具有促进作用。     

神经干细胞治疗癫痫脑损伤的展望

癫痫是由多种病因引起的慢性脑功能障碍综合征,是大脑神经细胞群反复超同步放电引起的发作性、突然性、短暂性脑功能紊乱,属于一种慢性反复发作性的脑功能失常性疾患。每年全球发病人数约650万,我国就达45万。它的发病涉及到神经系统的内在性质,兴奋、抑制的失衡,发作起点,神经冲动的同步化,发作传播及终止等多方面。传统观点认为,成年中枢神经系统神经元不能再生,进行自我完善。然而,从90年代神经干细胞的发现、研究到治疗一些神经系统退行性变疾病(如PD,HD )、脑缺血疾病、脊髓损伤等,均为治疗癫痫也提供了极大可能。笔者探讨神经干细胞对癫痫治疗可能性。1神经干细胞(NeuralStemCells,NSCs)治疗癫痫的理论基础1.1神经干细胞的基本特征人体中多数细胞是不断更新的,成年动物产生新细胞机制靠的就是干细胞。1992年Reynolds首次从成年鼠纹状体中分离出能在体外持续增殖且有向神经元及星形胶质细胞分化潜能的细胞群,证明在成年鼠脑内存在有干细胞特性的细胞群。1998年Eriksson[1]证实成年人脑同样存在NSCs。Mckay在Science上定义NSCs具有能进行自我复制、自我更新和多分化潜能,分化为本系大部分类...     

丰富康复训练对缺血性脑损伤神经干细胞的影响及研究思路

神经干细胞(NSC)的增殖、迁移和分化是脑可塑性的一个重要方面,也是缺血性脑损伤康复研究的一个新的热点。康复训练和丰富环境干预对脑损伤后的功能恢复有可靠疗效,能调控NSC生存的特殊微环境中的多种因子,促进NSC增殖、迁移和分化,影响脑损伤后的神经发生和脑的可塑性,促进脑结构和功能恢复。本文分析NSC增殖分化在缺血性脑损伤康复中的作用机制以及丰富环境刺激对NSC的影响,提出丰富环境刺激、康复训练和传统中医药等多种方法的综合运用,可能通过干预NSC增殖分化机制,提高脑损伤患者的康复疗效。     

神经干细胞移植对创伤性脑损伤大鼠脑组织中连接蛋白43表达的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)移植对创伤性脑损伤(TBI)大鼠脑组织中连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法将6～7周龄雄性SD大鼠36只随机分为对照组和NSCs移植组,每组18只。从15只E14大鼠胚胎分离NSCs,进行原代培养及传代培养;用含体积分数10%胎牛血清的培养基对NSCs进行诱导分化;采用免疫细胞化学技术对培养的NSCs及其分化为神经元的表型进行鉴定;采用改良的Feeney法制备TBI模型;利用脑立体定位仪和微量注射泵进行NSCs脑内移植;采用免疫组织化学技术、免疫印迹技术和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测在移植后不同时间脑组织损伤区Cx43的表达。结果在培养基中,NSCs呈球团状悬浮生长,神经上皮干细胞巢蛋白表达阳性。NSCs体外诱导分化第2天,多数细胞伸出突起,以后突起逐渐延长,分支增加;分化后第5天,部分细胞βⅢ-微管蛋白阳性。免疫组织化学结果显示,无论有无NSCs移植,在移植后第1、2和4周受损脑组织中,均可见Cx43在细胞膜上、膜旁的细胞质及突起中呈棕黄色表达。NSCs移植大鼠的Cx43染色在各个时间点均显著强于对照组(P<0.05)。在移植后的4周内,NSCs移植组移植点及其周围脑组织中Cx43 mRNA和蛋白表达显著高于对照组(P<0.01)。结论移植NSCs至TBI大鼠损伤脑组织,在移植点周围脑组织中Cx43的表达显著增加。     

BDNF修饰神经干细胞移植对脑缺血损伤的影响

①目的探讨脑源性神经营养因子基因(BDNFmRNA)修饰神经干细胞(NSCs)移植到大鼠脑缺血损伤处后的基因表达变化。②方法64只成年SD大鼠随机分为4组,正常对照组(A组)、手术对照组(B组)、NSCs移植组(C组)、BDNF基因修饰NSCs移植组(D组),每组16只。应用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型。C、D组分别将制备好的NSCs和BDNF基因修饰NSCs细胞悬液10μL(约6×104个细胞)用微量注射器注入损伤处,缝合皮肤。各组分别于手术后7、14、21、30d将4只大鼠麻醉,取脑,制备组织切片,应用X-gal组化、原位杂交等方法,检测移植处细胞的标记基因表达和BDNF的表达。③结果X-gal组化染色结果显示,移植的NSCs和BDNF基因修饰NSCs均能在脑缺血区内存活,并分化成各种细胞,D组X-gal阳性细胞比C组多,且在移植7、14d时细胞形态清晰,大部分为密集团状生长。原位杂交显示,手术后各组各时间点脑组织切片上均可见BDNFmRNA阳性细胞表达,其中D组的阳性细胞数目明显高于C组。图像分析结果显示,C组BDNFmRNA阳性细胞的平均吸光度值在移植后7~14d时最高,以后呈逐渐下降趋势,至21d时与B组相比差异均有显著性(F=6.27~14.35,q=4.96~7.85,P<0.01),到30d时与B组差异无显著意义。C组与D组比较,各时间点BDNFmRNA阳性细胞的平均吸光度值差异均有显著意义(q=5.17~9.28,P<0.01)。④结论BDFN基因修饰NSCs能在脑损伤移植处存活,强烈表达BDNFmRNA。BDNFmRNA修饰NSCs可以作为脑缺血损伤修复的移植材料。     

异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病的效果

目的探讨异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)治疗恶性血液病的效果。方法10例恶性血液病病人进行Allo-HSCT治疗,供者中9例为HLA完全相合的同胞,1例为HLA半相合的同胞。预处理方案包括:马利兰-环磷酰胺、马法兰-足叶乙甙-阿糖胞苷-环磷酰胺、氟达拉滨-阿糖胞苷-马法兰-环磷酰胺、卡莫司汀-足叶乙甙-阿糖胞苷-环磷酰胺。结果全部病人均获得造血重建,中性粒细胞≥0.5×109/L、血小板>20×109/L的中位时间分别是14.51、8.3 d;5例发生急性移植物抗宿主病(GVHD),6例发生慢性GVHD,4例血型不合者均于移植后3个月内血型转为供者型。10例病人28 d时DNA图谱均转为供者型。随访4~23个月尚无复发及死亡病例。结论Allo-HSCT虽然会发生GVHD等严重并发症,但仍然是治疗恶性血液病的最有效的方法。HLA半相合同胞Allo-HSCT的开展解决了供者来源少的难题。     

细胞移植修复脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤的修复,一直是医学界的难题.大量的动物实验证实,细胞移植能促进脊髓损伤的修复,为治疗脊髓损伤带来了新的希望.本文就细胞移植治疗脊髓损伤的有关研究进展进行综述.     

骨髓基质干细胞附和同种异体骨移植治疗股骨头缺血性坏死

目的：探讨股骨头缺血性坏死的机理和治疗方法。方法：34例股骨头缺血性坏死Ⅰ、Ⅱ期患者,男28例,女6例;年龄34岁～53岁,平均45岁。患者术前均行X线和MR检查。病变累及髋关节左侧8例,右侧14例,双侧12例,共46个关节,按Ficat分期：Ⅰ期21例、Ⅱ期25例。采用股骨头髓芯减压术清除坏死骨,将同种异体骨与之前提取的骨髓基质干细胞附和,植入缺损区。采用股骨头缺血性坏死疗效评价法评估疗效。结果：34例患者术后无一例症状加重。平均手术时间120min,平均出血量200mL,术后随访时间12—18个月,平均14个月。16例Ⅰ期股骨头坏死恢复至正常,10例Ⅱ期恢复至正常,9例Ⅱ期恢复至Ⅰ期,其余均无进展。结论：骨髓基质干细胞附和同种异体骨移植是治疗股骨头缺血性坏死的一种安全有效方法。     

GENETIC ENGINEERING NEURAL STEM CELL MODIFIED BY LENTIVIRUS FOR REPAIR OF SPINAL CORD INJURY IN RATS

THE functional repair after spinal cord injury(SCI) is one of the research focuses in neuro-science in recent years·According to the tradi-tional views, the central nervous system (CNS) does notregenerate once it is injured·However, from the1980s,large …     

自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血性疾病的初步实验研究

目的 对比骨髓干细胞移植、皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-colony stimulating factor,rhG-CSF)、骨髓干细胞移植联合rhG-CSF皮下注射3种方法对糖尿病兔缺血组织血管新生的作用效果.方法 健康新西兰兔,用四氧嘧啶(alloxanate,ALX)诱导糖尿病后,结扎兔右后肢股动脉,建立糖尿病下肢缺血动物模型,随机分成4组,A组(rhG-CSF动员组),B组(rhG-CSF动员+局部千细胞移植组),C组(局部干细胞移植组),D组(PBS对照组).治疗28 d后全麻,4组均以右侧股内侧正中部位为中心等距离取局部肌肉组织,制作切片,免疫组织化学染色,检测各组骨骼肌微血管密度及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达水平.结果 ①A、B、C组均使局部缺血组织微血管数量增加,B组微血管数量明显高于其他2组(P<0.05).②A、B、C 3组局部缺血组织VEGF的表达量均增加,但B组VEGF的表达量明显高于其他2组(P<0.05).结论 rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血性疾病,其效果明显优于单纯用rhG-CSF治疗和单纯骨髓干细胞移植治疗.     

经颈内动脉骨髓干细胞移植治疗脑梗死后遗症

目的:探讨骨髓干细胞移植治疗脑梗死后遗症的临床疗效与可行性。方法:病人9例,平均60.5岁。脑梗死发生后2wk～22mo。50岁以下取自体骨髓血120～150mL,50岁以上(含50岁),取胎儿脐带血约80mL。实验室即刻分离,分离后的骨髓干细胞(混于10mL生理盐水中)。经股动脉穿刺,以Seldinger氏方法,送入5.0F猎人头导管,导管尖端置于颈内动脉处缓慢注入。结果:移植术后2wk～3mo观察。肢体运动,痛温感觉语言功能。明显改善6例,改善2例,无变化1例。总有效率89%。结论:经颈内动脉骨髓干细胞移植治疗脑梗死后遗症方法近期有效,安全性目前可靠。     

脐血造血干细胞移植的研究进展

造血干细胞移植(hemopoietic stem cell transplantation,HSCT)是通过异体或自体的造血干细胞(HsC)植入受者体内,而使受者获得造血和免疫功能重建的方法.随着实验血液学、临床血液学和移植免疫学的不断发展,特别是人类白细胞抗原(HLA)配型技术的发展,使HSCT技术逐渐成熟并广泛应用,成为治愈某些恶性血液病的重要方法.脐带血作为Hsc的来源之一,已成功应用于临床,并有望在今后的生物学治疗和基因治疗中发挥重要的作用.本文就近年来有关脐带血HSCT移植的研究进展作一综述.     

EFFICACY OF URSODEOXYCHOLIC ACID IN TREATMENT OF ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY IN LIVER TRANSPLANTATION

Objective To investigate the efficacy of ursodeoxycholic acid in treatment of ischemia-reperfusion injury (IRI) in liver transplantation. Methods Eighty liver transplantation adult recipients were preoperatively enrolled and randomized into the ursodeoxycholic acid (UDCA) (42 cases) and control (38 cases) groups between May 2005 and June 2006. The two groups were statistically compared in liver biochemical parameters on post-transplant d 1, 7, 14, and 21. Rates of severe IRI-induced liver graft dysfunction, acute cellular rejection (ACR) episode, drug-induced hepatotoxicity, viral hepatitis, and recurrence of primary liver disease were measured within 3 weeks post-transplantation; and rates of vascular, biliary complications, and death were also measured within 3 months post-transplantation. Results In the UDCA group, serum levels of alanine aminotransferase (ALT) on post-transplant d 7, 14, and 21 were significantly lower than those in the control group (P＝0.002, 0.030, 0.049, respectively). Compared with the control group, serum levels of aspartate aminotransferase (AST) and γ-Glutamyl-transpeptidase (GGT) on d 7 were also lower in the UDCA group (P＝0.012 and 0.025). The cases of severe IRI-induced liver graft dysfunction in the UDCA group were significantly fewer than those in the control group (17.5% vs. 26.3%, P＝0.048). There were no significant differences in rates of ACR episode, histological Banff grading, or drug-induced hepatotoxicity within 3 weeks post-transplantation as well as rates of vascular, biliary complications, and death within 3 months post-transplantation between the two groups. We did not find any case of viral hepatitis or recurrence of primary liver disease in the study. Conclusion UDCA treatment can improve graft IRI early after liver transplantation. It significantly decreased serum ALT level and incidence of severe IRI-induced liver dysfunction within post-transplant 3 weeks. Cytoprection of hepatocytes by UDCA was more outstanding than that of bile duct when cold ischemia time was beneath 12h. Vascular and biliary complications within 3 months post-transplantation can not be affected by UDCA administration in the study.     

异基因骨髓干细胞移植后重建NOD小鼠T淋巴细胞亚群比值的研究

目的：探讨骨髓干细胞移植对NOD小鼠免疫系统重建和预防糖尿病发生的机制。方法：①21只6周龄NOD雌性鼠接受9．5cGy全身照射后随机分为两组,移植组10只,对照组11只;②每周监测血常规和血糖的变化;③小鼠饲养至发生糖尿病时或至30周龄时处死,摘取脾脏分离淋巴细胞,通过流式细胞术检测移植鼠与非移植鼠脾脏CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋、CD4^＋／CD8^＋淋巴细胞;采用ELISA法测定血清中IFN-γ水平;吉姆萨染色法计数小鼠骨髓分裂相中Y染色体所占比例,检测嵌合程度并作为细胞植活标记。结果：①移植后NOD受鼠经骨髓细胞的性别染色体检测显示均植入成功;②实验组糖尿病发病率显著低于对照组（P〈0．05）,且发病时间与对照组比较明显延缓（P〈0．05）;③实验组和对照组CD3^＋T细胞、CD4^＋T细胞比较差异无统计学意义（P〉0．05）,但实验组CD8^＋T细胞显著高于对照组（P〈0．05）。实验组的CD4^＋／CD8^＋比值显著低于对照组（P〈0．05）,血清IFN7数值也显著低于对照组水平（P〈0．01）。结论：NOD鼠在通过异基因骨髓干细胞移植后,能降低糖尿病的发生率和延缓糖尿病的发生,可能与移植后免疫重建,下调CD4^＋／CD8^＋T细胞的比值,使Th1／Th2极化向Th2偏移等机制相关,异基因骨髓干细胞移植可能成为防治1型糖尿病的新途径。