Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

STAT3基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,以信号转导和转录激活因子3(STAT3)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析鉴定。方法设计一条有小发夹结构的DNA序列,聚合酶链反应(PCR)扩增合成siRNA表达框架(SECs)表达框架,克隆至载体psi Lent GeneTM中构建重组体,转化E.coli DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后测序分析。结果重组质粒经EcoRⅤ酶切、电泳、测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。结论成功构建了STAT3靶向RNA干扰重组体,为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。     

C-erbB2基因 siRNA 质粒的构建、鉴定及转染

目的 构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响.方法 利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDNA基因为靶标设计RNA干扰片段和阴性对照片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-erbB,进行鉴定及测序.并稳定转染至HT-29细胞.结果 测序证明人C-erbB2 siRNA表达载体质粒pGenesil-erbB构建成功,pGenesil-erbB稳定转染入人结肠癌HT-29细胞,采用Western blot实验证明pGenesil-erbB可显著抑制Her-2蛋白的表达.结论 成功构建了人CerhB2干扰载体质粒pGenesil-erbB.稳定转染至结肠癌HT-29细胞株,并能抑制HT-29细胞的Her-2蛋向的表达,为靶向CerbB2的siRNA对结肠癌的放射增敏研究奠定了基础.     

18S rRNA基因siRNA表达质粒的构建和鉴定

目的:构建和鉴定水牛18S rRNA干扰真核表达载体,为进一步研究18S rRNA功能奠定基础.方法:人工设计合成水牛18S rRNA-sh565干扰序列,经基因重组定向克隆插入到真核表达载体pGPH1/GFP/Neo,随机挑选2个克隆菌提取质粒并进行酶切和测序鉴定.结果:质粒酶切和测序结果显示,siRNA寡核苷酸按正确方向和序列插入质粒.结论:成功构建pGPH1/GFP/Neo-buffalo-18S rRNA-sh565干扰表达质粒.     

小鼠STAT4，STAT6基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定小鼠信号转导子和转录激活因子4(STAT4),信号转导子和转录激活因子6(STAT6)具有发夹结构小干扰RNA(shRNA)表达质粒.方法:根据STAT4和STAT6基因mRNA序列,在体外分别合成有小发夹结构的2条STAT4特异性寡核苷酸序列,2条STAT6特异性寡核苷酸序列,退火后与线性化pGenesil-3质粒连接,转化感受态细胞DH5α,扩增,纯化得到所需质粒.同时设计构建分别针对小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的干扰质粒作为阳性对照,不具有基因同源性的非特异性基因的质粒作为阴性对照序列.通过酶切后琼脂糖凝胶电泳和基因测鉴定纯化质粒分子量及插入片段的序列.结果:经限制性酶切和测序鉴定分析证实基因插入正确,与设计的序列完全相符.结论:成功构建了针对小鼠STAT4,STAT6基因的发夹结构小干扰RNA表达载体.为今后利用基因沉默技术从转录后水平抑制STAT4,STAT6的研究奠定基础.     

p27Kip1基因shRNA表达质粒的构建鉴定及功能研究

目的 构建细胞周期性激酶抑制剂p27Kip1的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对牛角膜内皮细胞增殖能力的影响.方法 设计有发夹状结构的3条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列,并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照.转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pGenSil-1质粒,构建重组质粒pGenSil-1/p27Kip1-1、pGenSil-1/p27Kip1-2、pGenSil-1/p27Kip1-3、pGenSil-1/HK.转化DH5α菌株,提取质粒行酶切及测序鉴定.以脂质体法将4个重组质粒分别导入牛角膜内皮细胞.转染后48 h以Western blot法检测p27Kip1蛋白水平及MTT法检测各实验组和对照组细胞增殖情况.结果 酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功.3个实验组p27Kip1蛋白水平分别下降了66.41%、61.51%、71.32%,shRNA可显著促进牛角膜内皮细胞增殖.结论 成功构建了针对p27Kip1的RNA干扰表达载体.     

Sox9、siRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建Sox9 siRNA表达载体，分析Sox9在软骨肉瘤中的作用机制。方法根据Kou Ⅰ，IkegawaS提椟的Sox9 mRNA序列，设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSilencer质粒中，并对重组质粒（命名为pSilencer／Sox9 siRNA）进行酶切及测序鉴定。结果双酶切证实Sox9 siRNA表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。结论成功构建Sox9 siRNA表达载体。     

靶向survivin基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向survivin基因的siRNA的表达载体,研究survivin在喉癌中的作用机制。方法根据基因库上sur-vivin cDNA序列,设计合成靶基因序列,将其寡核苷酸退火后插入到Pgenesil-1表达载体中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。结果酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向survivin基因表达的siR-NA干扰质粒载体Pgenesil/survivin,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

大鼠Pik3cb shRNA质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制移植术后血管再狭窄的研究做准备。方法根据大鼠Pik3cb mRNA序列设计6条并经预实验挑选出2条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠Pik3cb shRNA表达载体质粒。结论成功构建了2条大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。     

uPA基因真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因真核表达载体,并转染人肝癌细胞,为进一步体外研究uPA在肝癌发生发展中的作用奠定基础.方法:从肝癌组织中提取RNA,通过RT-PCR的方式,获得基因uPA的全长cDNA,并克隆于含有HA2-标签(tag)的真核表达载体pCMV上,酶切鉴定,质粒测序鉴定,用pCMV-uPA-HA2进行细胞瞬时转染及WesternBlotting鉴定.结果:经过测序证实得到获得包含uPA基因的pCMV-HA2真核表达载体,瞬时转染细胞有蛋白表达.结论:克隆了人肝癌的uPA基因,成功构建真核表达载体.     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E真核表达载体的构建与鉴定

目的 :构建水痘 -带状疱疹病毒 (VZV)糖蛋白E(gE)真核表达质粒。方法 :以水痘 -带状疱疹病毒基因组DNA为模板 ,用PCR扩增出约 85 2bpVZVgE片段。将其分别与pUC -T载体连接。经过蓝白筛选后 ,用双酶切得到目的基因片段 ,定向克隆到pcDNA3载体中。并用PCR、电泳和基因测序方法鉴定。结果 :用PCR方法扩增出与预期大小相符的VZVgE基因片段 ,蓝白筛选得到白色菌落及pUC -VZVgE载体 ,用PCR、电泳和基因测序方法证实pcDNA3-VZVgE(pcVZV -E)及pUC -VZVgE构建成功。结论 :本试验构建的pcVZV -E真核表达质粒 ,含有真核表达所必需的启动子等元件。目的基因克隆方向正确 ,读码框与翻译产物和VZVgE相符合 ,为进一步研制VZVDNA疫苗提供了有利条件     

真核表达质粒pcDNA3-hsp70的构建及鉴定

目的：构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3—hsp70。方法：用基因释放刑提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增、获得hsp70目的基因后，与pcDNA3载体进行连接重组。结果：pcDNA3—hsp70真核表达质粒构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论：pcDNA3—hsp70真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3—hsp70DNA疫苗奠定了基础。     

人心房肌KChIP2基因表达质粒pEGFP-KChIP2

目的：KChIPs作为瞬时外向钾通道（Ito）最重要的辅助亚基,在调控通道基因表达和电流特性中起重要作用。本实验拟构建人心房肌KChIP2基因表达质粒,为研究KChIP2对Ito的调控功能奠定基础。方法：①提取人心房肌总RNA,逆转录得到cDNA;②通过特异性引物进行PCR扩增得到KChIP2编码区全长序列,亚克隆到pMD18-T载体中．得到重组克隆质粒pMD18-T—KChIP2;③再设计带有酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ的特异性引物,对重组克隆质粒pMD18-T—KChIP2进行PCR扩增,得到含有酶切位点的KChIP2编码区全长序列;④对含有酶切位点的KChIP2全长片段和pEGFP—c1进行HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切反应,然后进行电泳后胶回收,再进行连接和转化反应;⑤提取质粒,测序鉴定。结果：质粒测序结果与PubMed数据库KchIP2（AY026328）序列比对,同源性为99％。结论：成功构建人心房肌KChIP2基因表达质粒,为下一步转染实验研究KChIP2对瞬时外向钾通道的功能调控奠定了基础。     

猪囊尾蚴cYI基因表达重组子的建立及在大肠杆菌中的表达

目的研究猪囊尾蚴cYI基因在大肠埃希菌中的表达情况。方法以本室保存的cYI基因为模板,应用PCR技术获得目的基因,运用分子克隆技术,将cYI基因插入到质粒pET28b的NdeI和XhoI位点构建pET28b-cYI重组表达质粒,转化到大肠杆菌DE3后,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法观察其表达情况。结果成功建立了pET28b-cYI重组质粒,并转化到大肠杆菌DE3中表达出相对分子量为18 000的特异性蛋白,表达量为菌体蛋白的30%。结论cYI基因重组子可在大肠杆菌中表达出特异性蛋白,表达量为菌体蛋白的30%。     

STAT3与PCNA蛋白在胃癌中的表现及临床意义

目的研究信号转导与转录活化因子（STAT3）和增值核抗原（PCNA）在胃癌中的表达情况及其在胃癌发生发展中的作用。方法采用免疫组化二步法检测40例胃癌组织和40例正常组织中STAT3与PCNA的表达。结果胃癌组织中STAT3的阳性表达率为65．0％,明显高于正常组织（27．5％）。PCNA的阳性表达率为57．6％,明显高于正常组织（25．0％）。STAT3的表达与临床分期、淋巴结是否转移和分化程度相关（P〈0．05）,与患者年龄、性别无关（P〉0．05）,并且与PCNA的表达呈正相关。结论STAT3的异常活化可促进细胞的过度增值,PCNA值可反映癌细胞的增值状态。二者联合检测可作为预测胃癌恶性程度和预后的重要方法,可能对胃癌的辅助诊断具有一定的意义,     

STAT1特异性siRNA真核表达载体的构建及体外转染优化

目的:构建STAT1特异性siRNA真核表达载体,并转染人气道上皮细胞(16HBE).方法:根据GeneBank数据库提供的STAT1基因两种变异体的共同核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链siRNA,再转化为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)的DNA序列,并将其连接到带有卡那霉素抗性和增强绿包荧光蛋白的pGenesil-1.1真核表达载体上,将其转染至气道上皮(16HBE)细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率.结果:通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建了二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到(16HBE)细胞株中,质粒/脂质体为1μg:2μl条件,能有效地转染细胞,转染效率达到50%以上.结论:成功构建siRNA真核表达载体并能成功体外转染,为下一步气道炎症性疾病的基因沉默研究奠定了良好的基础.     

应用荧光定量PCR和Western—blot检测RNA干扰肺腺癌A549细胞STAT3基因表达水平的实验研究

目的：研究RNAi技术对人肺腺癌A549细胞系中STAT3基因的阻断效应,探讨STAT3在肺癌中的重要作用,为肺癌的基因治疗寻找新的靶点。方法：将化学合成siRNA用脂质体介导法转染肺腺癌A549细胞,应用荧光定量PCR法检测RNA干扰后STAT3 mRNA表达量,得出抑制率。应用Western-blot检测RNA干扰后对STAT3蛋白表达的影响。结果：成功将siRNA转染肺腺癌A549细胞,荧光定量PCR结果显示,在转染24h、48h、72h后,各干扰组与阴性组比较STAT3基因表达量明显下调（P〈0.05）,Western blot显示转染前后STAT3蛋白的表达水平明显受到抑制,干扰组与阴性组空白组相比具有显著差异（P〈0.05）,内参基因在各组的表达量无明显差异。结论：将合成的STAT3 siRNA能有效抑制STAT3蛋白的表达、降低STAT3 mRNA水平,对STAT3有高效和特异的沉默作用,以STAT3为靶点的RNA干扰技术可望成为肺癌基因治疗的新策略。     

HCMV即刻早期基因原核表达克隆的构建

①目的构建人类巨细胞病毒ＡＤ１６９株即刻早期基因ＵＬ３７×１基因片段的原核表达克隆。②方法通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增目的基因，然后用限制性内切酶将目的基因与原核表达载体ｐＢＶ２２０定向连接。③结果获得了重组的原核表达质粒。④结论用限制性内切酶鉴定原核重组表达质粒构建成功