不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。     

弓形虫SAG2基因体外扩增、克隆及在耻垢分支杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增弓形虫RH株的SAG2基因,克隆入pGEMT载体,然后构建亚克隆ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将SAG2基因的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠,Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的SAG2基因;正确构建穿梭质粒ps3000-SAG2,免疫印迹分析,免疫小鼠血清能所识别SAG2重组蛋白。结论耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白SAG2,具有抗原性,刺激小鼠机体产生出了抗弓形虫的抗体,为下一步弓形虫重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原P35基因片段的表达纯化和抗原性分析

目的制备具有免疫活性的弓形虫表面抗原P35基因片段的重组蛋白,并对其抗原性进行分析。方法根据弓形虫RH株表面抗原P35的cDNA序列设计一对引物,利用PCR技术从RH株弓形虫基因组中扩增出P35的基因片段,将其克隆到T载体中,并通过基因测序加以证实;将其亚克隆至原核表达载体pET KDO中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。采用免疫印迹法对表达产物进行抗原性分析。结果从弓形虫RH株基因组中成功扩增到P35目的基因,该基因在原核系统中经诱导表达出分子量约42 000 Da大小的融合蛋白,经免疫印迹实验表明,表达产物具有良好的抗原性,经亲和层析纯化后得到了重组蛋白。结论运用基因工程技术得到了高纯度并具有良好抗原性的弓形虫重组P35融合蛋白。     

编码弓形虫致密颗粒抗原-1（GRA1）质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性

目的 构建真核表达质粒pcGRA1，并观察其免疫小鼠的保护性。方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRAl编码基因，定向克隆入pcDNA3的EcoRI／XhoI位点，从而获得pcGRA1。用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定。将100μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注，于注射后2周和4周各加强1次；分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性。结果DNA序列测定结果表明，将573bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3EcoRI／XhoI位点，成功构建了重组质粒pcGRA1；免疫小鼠血清中检测到特异性IgG；不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因；IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应；弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠，其存活时间长于对照组。结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应，对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性。     

编码弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性

目的构建真核表达质粒pcGRA1,并观察其免疫小鼠的保护性. 方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRA1编码基因,定向克隆入pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ位点,从而获得pcGRA1.用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定.将100 μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注,于注射后2周和4周各加强1次;分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性. 结果 DNA序列测定结果表明,将573 bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/XhoⅠ位点,成功构建了重组质粒pcGRA1;免疫小鼠血清中检测到特异性IgG;不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因;IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应;弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠,其存活时间长于对照组. 结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应,对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性.     

弓形虫磷酸丙糖异构酶原核表达及免疫保护的初步研究

目的克隆刚地弓形虫磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)基因,原核表达和纯化蛋白,研究其对弓形虫感染小鼠的免疫保护作用。方法抽提弓形虫速殖子总RNA,利用PCR技术扩增刚地弓形虫TPI基因,构建重组原核表达载体TPI/p ET-28a(+),转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达,镍亲和层析法纯化目的蛋白。将与佐剂乳化后的TPI蛋白对小鼠颈背部多点皮内免疫,间隔2周,连续免疫4次,最后一次为加强免疫,同时设置佐剂对照组与正常对照组。尾静脉采血检测小鼠血清抗体效价。以400个弓形虫速殖子/只接种小鼠腹腔,观察记录各组小鼠的生存率。结果成功扩增到弓形虫TPI基因,构建原核表达载体TPI/p ET-28a(+),获得纯化的TPI蛋白,TPI免疫4次后的小鼠血清抗体效价可达1:100 000以上,且生存期显著高于佐剂对照组与正常对照组。结论弓形虫TPI蛋白对弓形虫感染小鼠具有一定的免疫保护作用,为研究弓形虫疫苗奠定了理论基础。     

弓形虫强毒株和弱毒株致密颗粒蛋白1基因的比较研究

目的比较弓形虫强毒株RH株、桂弓株和弱毒株B36株致密颗粒蛋白1(GRA1)基因片段的异同。方法分别从接种RH株、桂弓株、B36株弓形虫的小鼠腹水中收集、纯化虫体,提取基因组DNA,PCR扩增3个虫株的致密颗粒蛋白1(GRA1)目的基因片段;构建pMD-18-T/GRA1重组质粒,PCR和双酶切鉴定其准确性;测序并用NCBI中Blast软件和MEGA3.1软件分析比较3种不同毒力株GRA1基因的异同。结果获得3株弓形虫的GRA1目的基因片段并构建了pMD-18-T/GRA1重组质粒,经鉴定目的基因片段大小与预期理论值相符。测序分析3不同毒力株GRA1基因片段相似为100%。结论弓形虫强毒株RH株、桂弓株和弱毒株B36株的GRA1基因片段极其相似,且高度保守。因此认为弓形虫GRA1基因具有较高应用价值。     

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4（GRA4）基因，构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4，重组耻垢分枝杆菌，鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因，克隆入pGEM-T载体，然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒，经电转化方法，将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis mc^2155）中，用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠，Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4，Western blot分析显示，GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别，分子质量单位约为40．0ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4，具有抗原性，刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体，为弓形虫重组BCG（Bacillus Calmette-Guerin）疫苗的研究奠定了基础。     

截短弓形虫表面抗原SAG2C的基因克隆、蛋白表达及其初步应用

目的克隆截短的弓形虫表面抗原SAG2C基因,在大肠埃希菌中表达SAG2C蛋自,并探讨其在弓形虫病诊断中的应用。方法对已知的弓形虫SAG2C基因序列进行部分取舍,用RT-PCR技术从弓形虫Prugniaud（PRU）株的总RNA中扩增截短的SAG2基因片段,插入载体pET32a（＋）中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达,应用westemblot和EI—ISA检测重组表达蛋白的免疫反应性。用重组SAG2C蛋自ELISA祛检测弓形虫感染血清特异抗体．观察初步应用效果。结果从弓形虫PRU株总RNA中扩增出截短的SAG2CC基因片段,成功构建了重组表达质粒pET32a（＋）-tSAG2C;该重组质粒经IPTG诱导能表达可溶性大小为51ku的SAG2C蛋白。Western blot显求重组SAG2C能被弓形虫感染小鼠血清识别;以重组SAG2C蛋门、重组SAG1蛋白及BAG1蛋白ELISA检测精神病患者血清弓形虫抗体,阳性率分别为8．07%（23／285）、4．56％（13／285）和7．37％（21／285）,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功构建了重组质粒pET32a（＋）-tSAG2C,表达的融合蛋白具有免疫反应性,具有用于弓形虫感染诊断的潜在价值。     

弓形虫Prugniaud株感染小鼠后脑组织病理学动态观察

目的观察Prugniaud株弓形虫感染小鼠后脑的组织病理学动态变化及包囊的形成。方法弓形虫Prugniaud株10个包囊/只鼠（0.5mL）经腹腔感染40只ICR小鼠,对照组22只小鼠接种同等量的PBS,观察小鼠的发病情况,并于感染第5d、10d、15d、20d、25d、30d、60d、90d、120d、150d和180d剖杀小鼠,取脑组织制作切片,作HE染色和免疫组织化学检测,同时提取脑组织DNA,用PCR法扩增弓形虫B1基因特异性片段。结果经腹腔感染小鼠从第6d开始出现食欲减退、耸毛、怠惰、抖动、腹泻及死亡等临床症状,死亡率为15%,第20d后症状开始减轻。HE染色镜检在感染第5d未见明显病理变化,第10d起见明显的神经元变性、卫星现象及噬神经现象,第15d起见神经胶质结节及较小的弓形虫包囊,第20d起珠网膜下腔见炎症细胞浸润,第25d起见血管套现象,第90d时珠网膜下腔见肉芽组织,第120~180d观察到弓形虫包囊、神经胶质结节及珠网膜下腔少量炎症细胞浸润共存现象。免疫组织化学显示在感染第10d脑组织细胞胞浆和胞核中发现弓形虫抗原颗粒,以后随着包囊增多抗原开始逐渐减少。PCR法从感染第10d至180d小鼠脑组织中均检测到弓形虫B1基因特异性片段。结论弓形虫Prugniaud株感染小鼠后速殖子可在几天内侵入脑,但出现包囊的时间可晚至15d,该虫可导致小鼠脑组织细胞变性坏死和非特异性脑膜脑炎的病理改变。15d以后随包囊形成脑组织病变逐渐减轻,但包囊可存在于脑组织中达180d。     

Immunization with a DNA plasmid encoding the SAG1 (P30) protein of Toxoplasma gondii is immunogenic and protective in rodents

Immunization with DNA can induce humoral and cell-mediated immune responses, both of which are important in conferring immunity to Toxoplasma gondii. The efficacy of genetic vaccination with a cDNA encoding the T. gondii SAG1 (P30) surface antigen was evaluated. Sera of immunized mice showed recognition of T. gondii tachyzoites by immunofluorescence and exhibited high titers of antibody to SAG1 by ELISA. SAG1-stimulated splenocytes from vaccinated mice produced primarily interferon-gamma and interleukin-2. Vaccinated mice survived challenge with 80 tissue cysts of ME49 strain, whereas all control mice died; challenge with 20 tissue cysts resulted in fewer brain cysts, compared with controls. Challenge of vaccinated rats with VEG strain oocysts resulted in a reduction in brain cysts. No protection was observed when mice were challenged with the highly virulent RH strain tachyzoites. These results suggest that nucleic acid vaccination can provide protection against T. gondii infection in mice.     

弓形虫GJS株表面抗原1基因的原核细胞表达及其抗原性分析

目的构建弓形虫GJS株表面抗原1（SAG1）重组表达质粒,研究SAG1蛋白疫苗诱导的保护性免疫作用。方法根据RH株弓形虫SAG1基因序列设计1对引物,利用PCR方法获得SAG1基因,克隆入pMD18-T载体,测序后进行序列分析;重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-30a中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达;重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,ELISA法测定其抗体滴度的变化,并用弓形虫速殖子攻击检测免疫保护力。结果与已知的SAG1基因核苷酸序列（$76248）及其编码氯基酸序列的同源性分别为99％、97％;表达的SAG1蛋白以包涵体形式存在,该重组抗原能被羊抗弓形虫阳性血清所识别;经间接ELISA检测,小鼠免疫后产生了较高的抗体;动物保护性实验表明,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论成功构建了弓形虫SAG1重组表达质粒,SAG1蛋白疫苗诱导小鼠的免疫保护力不强。     

小鼠口服弓形虫DNA混合疫苗的免疫保护反应

目的 观察携带弓形虫表面抗原复合基因重组沙门氏菌经口免疫BALB/c小鼠所诱导的免疫反应。 方法 构建弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2复合基因真核表达质粒，将其转入减毒鼠伤寒沙门氏菌BRD509 (BRD509/pSAG1/SAG2)，经口服免疫BALB/c小鼠，以携带空载体质粒的减毒沙门氏菌BRD509及生理盐水（NS）组为对照，分别于每次免疫前和免疫后断尾取血，并于末次免疫后第4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性、天然杀伤细胞（NK细胞）活性和T细胞亚群；ELISA法测定IgG抗体及血清中的细胞因子干扰素（IFN-γ），白介素-4（IL-4）。与末次免疫后4周，每只小鼠腹腔注射0.1 ml(10⁵)弓形虫RH株速殖子攻击，观察小鼠存活时间。 结果 免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高，滴度为1∶100；NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强，其中NK细胞杀伤活性为85%±7%，T细胞增殖指数为2.83，与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。免疫鼠攻击感染后平均存活时间比对照组长5 d。 结论 弓形虫口服DNA混合疫苗可诱导小鼠产生保护性免疫。     

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅲ．不同毒力株速殖子培养检出时间的差异

本文观察了弓形虫ＲＨ株、Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ株和８株源自羊水等标本的野生株速殖子，在以单核细胞ＴＨｐ－１作为受染细胞的培养系统中不同接种量其检出时间的差异。结果表明，ＲＨ株和Ｐｒｕｇｎｉ－ａｕｄ株各不同接种量最早可在１～４ｄ内获阳性结果，而野生株仅１株可检测到每管（２ｍｌ）１０速殖子的接种量（第１４ｄ），１００速殖子接种量６／８株在第１４ｄ检获阳性。提示在以细胞培养进行弓形虫病原检测时适当延长培养检测时间可提高阳性率。     

Biological role of surface Toxoplasma gondii antigen in development of vaccine

AIM: To analyze the biological role of the surface antigen of Toxoplasma gondii (T gondii) in development of vaccine. METHODS: The surface antigen of T gondii (SAG1) was expressed in vitro. The immune response of the host to the antigen was investigated by detection of specific antibody reaction to SAG1 and production of cytokines. Mice were immunized with recombinant SAG1 and challenged with lethal strain of T gondii RH. The monoclonal antibody to r-SAG1 was prepared and used to study the effects of SAG1 on T gondii tachyzoites under electromicroscope. RESULTS: The mice immunized with recombinant SAG1 delayed death for 60 h compared to the control group. The recombinant SAG1 induced specific high titer of IgG and IgM antibodies as well as IFN-γ, IL-2 and IL-4 cytokines in mice. In contrast, IL-12, IL-6 and TNF-αwere undetectable. When T gondii tachyzoites were treated with the monoclonal antibody to r-SAG1, the parasites were gathered together, destroyed, deformed, swollen, and holes and gaps formed on the surface. CONCLUSION: SAG1 may be an excellent vaccine candidate against T gondii. The immune protection induced by SAG1 against T gondii may be regulated by both hormone- and cell-mediated immune response.     

Oral immunization with a live recombinant attenuated Salmonella typhimurium protects mice against Toxoplasma gondii

The natural site of infection for T. gondii is the mucosal surface of the intestine, so the protective immunity obtained after natural infection with T. gondii points to the importance of developing a vaccine that stimulates mucosal defences. In this study, an aroA- and aroD- attenuated strain of Salmonella typhimurium (BRD509) has been used to deliver the recombinant eukaryotic plasmid pSAG(1-2)/CTA2/B expressing a multi-antigenic gene encoding SAG1 and SAG2 of T. gondii linked to A2/B subunits of cholera toxin as a candidate oral T. gondii vaccine. Immunoblot analysis showed compound gene expression in HeLa cells in vitro and intragastric immunization of mice with the recombinant salmonella resulted in the induction of humoral and Th1 type cellular immune responses and afforded protection against RH strain T. gondii challenge. Anti-T. gondii IgG values increased markedly in the BRD509/pSAG(1-2)-CTA2/B immunized group; these values were significantly higher than those in the negative controls (P = 0.008). With CTA2/B genetic adjuvant, the T. gondii-specific response was predominantly Th1, indicating that the CTA(2)/B genetic adjuvant was able to overcome the strong Th2-bias of the antigen (IgG2a > IgG1). Antigen-specific T cell proliferative responses and CTL activity were significantly enhanced when cholera toxin CTA2/B genetic adjuvant was used (P = 0.009; P = 0.006). Culture supernatants from antigen-stimulated splenocytes from mice in these groups were also examined by ELISA for Th1- and Th2-type cytokines; mean IFN-gamma levels produced after oral immunization with BRD509/pSAG(1-2)-CTA2/B were about nine-fold higher than after immunization with BRD509/pSAG(1-2) (P = 0.007). On the other hand, the levels of IL-4 were low for all groups and no increase was seen in the presence of CTA2/B genetic adjuvant. When the immunized mice were intraperitoneally challenged with 10(3) tachyzoites of the highly virulent RH strain, the survival time of the mice immunized with BRD509/pSAG(1-2)-CTA2/B was markedly longer than other groups (P = 0.003) and a 40% survival rate was achieved. This is the first report that demonstrates that an oral attenuated salmonella DNA vaccine can induce protective immunity against the acute phase of T. gondii infection.     

弓形虫对小鼠肝脏损害的观察

观察刚地弓形虫感染小鼠肝脏中弓形虫对肝脏损害的病理变化。方法采用免疫组化ＡＢＣ法。结果可见弓形虫从两方面对小鼠肝脏造成损害：一方面，弓形虫进行入血流，随血流进行入肝脏，在肝组织血管及毛细血管周围的肝细胞内寄生，繁殖，导致肝细胞发生肿胀变性，细胞破裂形成坏死灶，坏死区，同时也导致血管壁破坏，肝组织呐广泛出血，致使小鼠死亡。另一方面，经腹腔进入小鼠体内的弓形侵入肝脏边沿的肝细胞内寄生、繁殖形成坏死区，     

弓形虫抗原与霍乱毒素A2/B亚基复合基因在小鼠体内诱导的免疫反应

目的　观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法　将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 及pcDNA3.1 SAG1 SAG2 CTXA2 /B的重组子;碱裂解法大量制备经肌肉注射免疫BALB/c鼠,每只鼠经后腿肌肉注射质粒10 0 μg ,每2周免疫1次,共3次,以PcDNA3.1空质粒注射组及PBS组为对照,分别于每次免疫前断尾取血和免疫后4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性,ELISA法测定IgG抗体。结果　免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高,NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强。免疫鼠抗攻击感染的时间延长。结论　含有霍乱毒素的复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有提高。     

贵阳猫源弓形虫株基因分型及毒力研究

目的 观察流行于贵阳猫源弓形虫株基因型分布及其毒力。方法 采自贵阳的2株猫源性刚地弓形虫株(CT-1,CT-2),经PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP),在SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1和Apico十个位点进行基因分型;同时用弓形虫CT-1株1×10³个速殖子分别腹腔注射SPF级KM、BALB/c、C57BL、ICR小鼠,观察其存活率及死亡时间,进行毒力分析。结果 从贵阳分离出2株弓形虫株,在10个遗传位点经PCR-RFLP分析均为China 1型(ToxoDB #9)。通过进行不同品系小鼠毒力研究显示,CT-1虫株感染C57BL、BALB/c、KM和ICR小鼠死亡率分别为100%、100%、30%和20%,有显著差异;CT-1虫株对C57BL和BALB/c鼠的毒力显著高于KM和ICR小鼠(P＜0.01)。结论 流行我国的弓形虫分离株具有有限的遗传多态性;在生物多样性较为丰富的我国西南地区,弓形虫China 1仍为其优势基因型;该型CT-1虫株对不同品系小鼠的致死力具有显著性差异。