CD40L对单纯疱疹病毒2型DNA疫苗的免疫增强作用研究

目的 研究重组质粒pcDNA3-Kan/CD40L辅佐HSV-2 DNA疫苗增强小鼠体液免疫和细胞免疫的作用效果,探讨其作为HSV-2 DNA疫苗佐剂的潜力。 方法 (1)构建鼠CD40L基因的重组真核表达质粒pcDNA3-Kan/CD40L。(2)体外细胞实验:检测重组质粒pCD40L刺激小鼠外周血淋巴细胞增殖情况和脾细胞分泌IFN-γ的能力。(3)体内动物实验:48只雌性BALB/c小鼠随机分为4个免疫组pK组、pgD组、pcCD40L+pgD组和pK+pgD组。小鼠后腿肌内注射,共免疫2次,间隔3周。末次免疫3周后,每组随机取4只小鼠进行致死剂量攻毒实验验证疫苗的保护作用。 ELISA检测小鼠血清抗HSV-2 IgG抗体水平和趋化因子RANTES;流式细胞术检测全血中CD4⁺和CD8⁺T细胞百分率以及分泌IFN-γ和IL-4的T细胞的百分率;MTS法检测小鼠脾脏T细胞的增殖能力。 结果 (1)体外实验结果:重组质粒pcDNA3-Kan/CD40L对小鼠外周血淋巴细胞的增殖能力和刺激脾细胞分泌IFN-γ的能力均显著大于空质粒pcDNA3-Kan(P<0.05)。(2)体内实验结果:小鼠血清抗HSV-2 IgG水平、趋化因子RANTES、脾淋巴细胞刺激指数和外周血CD4⁺T细胞数和分泌IFN-γ的Th1细胞数均高于其他免疫组(P<0.05)。pcDNA3-Kan/CD40L+pgD组预防小鼠感染HSV-2效果好于其他免疫组。 结论 (1)重组质粒pcDNA3-Kan/CD40L能够诱导外周血淋巴细胞增殖并刺激脾细胞分泌IFN-γ具有作为疫苗佐剂的潜力。(2)pcDNA3-Kan/CD40L可以辅助HSV-2 DNA疫苗诱导BALB/c小鼠产生特异性抗HSV-2的体液免疫和细胞免疫,具备作为HSV-2 DNA疫苗免疫佐剂的能力。     

骨髓细胞固定液DNA提取与质量评价的实验研究

目的 利用骨髓染色体核型分析后剩余骨髓细胞固定液标本提取基因组DNA并评价DNA质量。方法 将60例骨髓细胞固定液标本按保存时间的不同分为3组,同时另取新鲜骨髓标本（冻存于-80℃）20例,利用天根公司DNA提取试剂盒（离心柱型）提取基因组DNA,通过紫外分光光度仪检测DNA浓度与纯度、DNA凝胶电泳观察DNA条带、聚合酶链反应检测有无不同片段大小的目的基因的扩增以评价DNA质量。结果 骨髓细胞固定液标本及新鲜骨髓（冻存）标本所提取的基因组DNA的A260/A280比值分别为1.93±0.03、1.92±0.04;两者纯度比较,差异无统计学意义（P>0.05）;不同保存时间（<3年、3～5年、>5年）的骨髓细胞固定液标本所提取DNA的A260/A280比值分别为1.94±0.03、1.91±0.03、1.93±0.04,其纯度差异无统计学意义（P>0.05）。上述实验标本均能通过PCR反应扩增出不同片段大小的目的条带。结论 利用染色体核型分析后剩余的骨髓细胞固定液标本可以提取出质量合格的基因组DNA,其可作为分子生物学相关研究的标本来源。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

乌药总生物碱提取工艺的优选及镇痛作用的研究

目的 优选乌药总生物碱（TALR）的提取工艺并研究其镇痛作用。方法 采取乙醇回流法提取,考察乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数影响,进行L₉(3⁴) 正交试验设计,以乌药总生物碱的紫外吸收峰最大吸光度A值为指标进行优选。镇痛实验取最佳提取方法所得TALR的不同浓度水溶液ig给予小鼠后,采用醋酸小鼠扭体法研究TALR的镇痛作用。结果 优选工艺为：加入14倍量95%乙醇提取1 h,酸溶碱沉得TALR,因其A值远高于其他工艺,故判断此法所得TALR质量分数相对最高。药理实验表明TALR可显著减少小鼠扭体次数。结论 优选工艺简单可行,质量分数较高;TALR具有较强的镇痛作用。     

苯吸入对骨髓细胞凋亡和组蛋白去乙酰化酶影响

目的 观察苯吸入对小鼠骨髓细胞损伤情况以及去乙酰化酶水平的变化。方法 自制动式苯吸入装置中放8~9周龄CD1雄性小鼠实验组吸入苯,正常对照组吸空气,6h/d,5天/周,300ml/m³及900ml/m³维持12周。末次吸苯后第2天,获取小鼠骨髓单个核细胞,利用流式细胞仪测骨髓细胞凋亡情况及用去乙酰化酶（HDAC）试剂盒测去乙酰化酶（HDAC酶）活性变化。结果 300ml/m³∶实验组小鼠骨髓细胞中早期凋亡细胞（AnnexinⅤ+PI-）比例（13.80%±5.31%）是对照组（8.33%±0.61%）的1.65倍（P<0.05）;晚期骨髓凋亡细胞（AnnexinⅤ+PI+）比例与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。900ml/m³∶实验组小鼠骨髓细胞中早期凋亡细胞（AnnexinⅤ+PI-）比例（13.10%±5.39%）是对照组（7.16%±2.18%）的1.83倍（P<0.05）;实验组晚期凋亡骨髓细胞（AnnexinⅤ+PI+）比例（7.11%±3.54%）是对照组（4.54%±0.84%）的1.57倍（P<0.05）。（2）900ml/m³苯浓度吸入小鼠组骨髓单个核细胞去乙酰化酶活性[（7.89±2.58）×10^-3A值/微克]是正常对照组[（5.00±1.52）×10^-3A值/微克）]的1.58倍（P<0.05）。结论 苯吸入可致小鼠骨髓细胞产生凋亡坏死。苯吸入致小鼠骨髓细胞组蛋白去乙酰化酶活性升高。     

刺松藻水溶性多糖抗肿瘤及免疫调节作用研究

目的 研究刺松藻水溶性多糖（WSPCF）抗肺癌和免疫调节作用。方法 采用MTT法检测WSPCF对人肺腺癌A549细胞体外生长的抑制作用,对正常C57BL/6J小鼠脾淋巴细胞增殖的影响和对脾淋巴细胞与巨噬细胞抑瘤作用的影响;中性红比色法检测WSPCF对C57BL/6J小鼠脾巨噬细胞吞噬活性影响;检测WSPCF对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长、脾脏和胸腺的影响;采用ELISA法检测荷瘤小鼠的细胞免疫因子指标。结果 WSPCF质量浓度高于1 000 μg/mL时,对A549细胞生长有抑制作用,500 μg/mL时能显著增强淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬活性（P＜0.05）,提高两者的抑瘤效果;与对照组相比,WSPCF对荷瘤小鼠的抑瘤率分别为39%、42%,差异有统计学意义（P＜0.05）,荷瘤小鼠血清中的免疫因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IFN-γ、FAS-L水平均显著提高（P＜0.05）。结论 WSPCF在体外对人肺腺癌A549细胞有一定的抑制作用,能提高小鼠细胞和分子免疫应答水平;在体内可改善Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能,通过激活机体免疫系统实现有效的抗肺癌活性和免疫调节作用。     

肿瘤相关成纤维细胞通过IL-6/STAT3通路介导胰腺癌中髓源性抑制细胞的分化

目的 探讨胰腺导管腺癌（PDAC）中肿瘤相关成纤维细胞（CAF）介导髓源性抑制细胞（MDSC）分化相关作用机制及生物学意义,为揭示CAF和MDSC通过重塑胰腺癌微环境促进胰腺癌进展提供理论基础和实验依据。方法 分离纯化PDAC肿瘤组织中原代CAF,以人包皮成纤维细胞（HFF）作为对照,通过实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验检测筛选CAF中表达上调的细胞因子。分别使用CAF和HFF培养上清培养人外周血单个核细胞（PBMC）,观察PBMC的分化情况,研究上述细胞因子参与调节MDSC分化、发挥募集作用的具体机制。结果 分离的原代CAF表达活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和成纤维细胞激活蛋白a（FAPa）,对照细胞HFF不表达α-SMA和FAPa。CAF培养上清中白细胞介素6（IL-6）、基质细胞衍生因子1（SDF-1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的表达量均高于HFF培养上清（P均<0.01）,而且IL-6、SDF-1、MCP-1的表达量随培养时间的延长而增加（P均<0.01）。与HFF培养上清相比,CAF培养上清能够促进更多的PBMC分化成CD13高表达的中性粒细胞样MDSC（CD13^hi-nMDSC;P<0.01）。在培养体系中单独加入人重组IL-6蛋白可以诱导PBMC向CD13^hi-nMDSC分化（P<0.01）,单独加入人重组SDF-1或MCP-1蛋白不能诱导CD13^hi-nMDSC亚群的增加;加入IL-6中和抗体或信号转导与转录激活因子3（STAT3）抑制剂FLLL32后能够明显减少由CAF培养上清诱导的分化（P<0.05）。结论 CAF可通过IL-6/STAT3通路促进PBMC分化为CD13^hi-nMDSC。     

莱菔硫烷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与Fas/FasL途径的相关性研究

目的 研究莱菔硫烷对人肝癌HepG2细胞Fas、FasL、Bid蛋白表达的影响,探讨其诱导HepG2细胞凋亡过程中Fas/FasL途径的作用。方法 Caspase-8试剂盒检测莱菔硫烷对HepG2细胞Caspase-8活性的影响;流式细胞仪检测莱菔硫烷对HepG2细胞中Fas、FasL、Bid蛋白表达的影响。结果 莱菔硫烷10、20、40 μmol/L作用于HepG2细胞48 h,可显著升高HepG2细胞Caspase-8活性（P＜0.01）;可使HepG2细胞 Fas、FasL蛋白的表达显著升高（P＜0.01）;莱菔硫烷20、40 μmol/L时,可显著提高Bid蛋白的表达（P＜0.01）,上述作用均呈剂量相关性。结论 激活Fas/FasL途径可能是莱菔硫烷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的重要机制之一。     

利用细菌内同源重组技术构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体

目的 构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体,最终获得胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入小鼠,为胰岛β细胞功能研究提供良好的基因敲除动物模型。方法 以低拷贝质粒pBR322-2s为骨架构建取获载体（retrieving vector）,应用λ噬菌体Red重组酶介导的缺口修复（gap-repair）方法,通过细菌内的同源重组克隆长度约为12 kb的小鼠胰岛素2（Ins2）基因组DNA,同时构建1个带有内部核糖体进入位点（IRES）序列、Cre重组酶序列和正负向筛选标记基因的微型打靶载体（mini-targeting vector）,最后通过同源重组获得Ins2-Cre打靶载体。结果 以Ins2基因的第3外显子为靶点,成功构建了受内源性Ins2基因启动子严格调控的表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体。结论 成功构建了在胰岛β细胞中特 异性表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体,为获得胰岛β细胞中基因特异性敲除小鼠模型提供了关键材料。     

S100A6基因沉默对人食管癌Eca109细胞增殖活性和迁移能力的影响

目的 观察S100A6基因沉默对人食管癌Eca109细胞增殖活性及迁移能力的影响。 方法 查找人S100A6 mRNA序列,设计针对其编码区的siRNA序列; 根据siRNA序列设计合成shRNA并构建shRNA重组表达载体;用阳离子脂质体转染重组质粒至Eca109细胞,于转染后48 h,采用real-time PCR法检测细胞中S100A6 mRNA表达量,蛋白质印迹法检测细胞中S100A6蛋白表达量;MTT法检测细胞增殖活性,绘制细胞生长曲线;通过细胞划线法检测基因沉默对于肿瘤细胞迁移能力的影响。 结果 成功构建了针对S100A6基因的shRNA真核表达载体; 通过脂质体转染的方法可在Eca109细胞内高效沉默S100A6,细胞转染后48 h,与未转染细胞比较,S100A6 mRNA表达量降低,且差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,蛋白表达量检测结果与mRNA检测结果一致; S100A6基因沉默可明显抑制对数生长期Eca109细胞增殖活性,与未转染细胞比较,差异有统计学意义（P<0.01）; S100A6基因沉默可明显抑制对数生长期Eca109细胞迁移能力。 结论 通过shRNA表达载体途径可在Eca109细胞中有效沉默S100A6基因,S100A6基因沉默能够显著抑制Eca109细胞增殖活性及迁移能力。     

应用酵母单杂交系统筛选CpG免疫激活序列的特异性结合蛋白

目的：寻找与CpG免疫激活序列（immunostimulatory sequence,ISS)有选择性相互作用的蛋白,以进一步探讨其分子作用机制。方法：采用酶母单杂交系统,以4重复的ISS为“锈饵”,对人骨髓细胞cDNA文库进行初步筛选,并对部分阳性克隆以电泳迁移率变动分析（EMSA）进行验证。结果：已获得4个双阳性克隆,其中两个编码功能未知的蛋白,而另外两个均属抗体轻链,分别与抗DNA抗体和抗乙肝表面抗原抗体（HBsAb)高度同源;EMSA发现HBsAb可在偏酸pH条件下（pH6.4和5．8时）特异性地与含ISS的寡核苷酸（CpG-ODN）结合。结论：HBsAb可与ISS特异性结合。     

CpG-ODN调节小鼠免疫细胞对HBsAg体液免疫应答性的初步研究

目的：初步探寻能够刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳CpG-ODN序列。方法：应用正交设计法设计含有不同序列的10例CpG-ODN免疫小鼠，以研究影响CpG-ODN免疫活性的6个因素；免疫时间，CpG基序侧翼核苷酸、5‘‘‘‘‘‘‘‘-poly(A)、硫代修饰，回文结构和CpG-基序数量，筛选出量优组合的CpG-ODN。结果：10例CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠均可不同程度地诱导小鼠抗HBsAg抗体水平的变化，显示出CpG-ODN较强的佐剂效应。结论：CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠可诱导小鼠产生强烈的抗体应答，以六个因素均存在时CpG-ODN的免疫刺激活性较强，即10号序列5‘‘‘‘‘‘‘‘-AAAAAACGTTAACGTT-3’为本实验中刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳序列。     

CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠

目的:探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对HBsAg诱导BALB/c和HBV转基因小鼠产生免疫应答的影响. 方法: 用人工合成CpG ODN与血源HBsAg联合免疫BALB/c和HBV转基因C57BL/6J小鼠,采用ELISA方法观察小鼠血清HBsAg及抗-HBs水平,用ELISPOT方法判断CpG ODN对HBsAg免疫小鼠脾T淋巴细胞分泌细胞因子的影响. 结果: CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠较HBsAg单独注射组同期抗-HBs滴度明显提高,尤其在首次免疫后6、8、12 wk,2组比较差异显著(P<0.05),联合免疫较CpG ODN单独免疫自首次免疫后4 ～16 wk差异显著(P<0.05).与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或9倍;CpG ODN,HBsAg联合免疫可诱导转基因小鼠产生抗-HBs,随时间延长,抗体滴度逐渐升高,并能使更多小鼠产生抗体,而单用HBsAg组、CpG ODN组均不能诱导抗-HBs的产生,免疫后各组血清HBsAg浓度较免疫前明显下降(P <0.05),但组间无明显差别(P>0.05),与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或11倍. 结论: CpG ODN作为佐剂可增强HBsAg诱导BALB/c小鼠产生体液及细胞免疫应答,CpG ODN ,HBsAg联合免疫可打破HBV转基因小鼠对HBsAg免疫耐受,可望成为慢性乙型肝炎的有效预防和治疗性疫苗.     

活体电穿孔导入法增强恶性疟原虫核酸疫苗免疫反应研究

目的 采用活体电穿孔免疫方法,研究恶性疟原虫DNA核酸疫苗不同免疫剂量对于动物免疫反应的影响,并对载体中CpG寡脱氧核苷酸基序的免疫刺激活性进行了初步探讨。方法 将恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1基因克隆于真核表达载体VR1012中,使用电穿孔导入方法免疫小鼠,采用ELISA检测抗体效价、ELISPOT测定细胞因子分泌水平,探索基因疫苗最佳免疫剂量以及考察免疫反应类型。使用计算机分析恶性疟核酸疫苗中特殊CpG基序组成,实验验证基因疫苗中CpG基序的免疫刺激活性。结果 相同DNA免疫剂量下,电穿孔免疫法与单纯肌内注射免疫法相比较,小鼠血清IgG抗体效价提高118倍,且能显著诱导体内特异性Th1和Th2型细胞反应。电穿孔免疫小鼠血清可识别天然虫体抗原,抗体效价可达1：1200。恶性疟原虫核酸疫苗抗原DNA含有24个CpG免疫活性基序,可以有效的刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）增殖与IL-6分泌。结论 活体电穿孔方法可以显著提高恶性疟原虫DNA疫苗体液免疫和细胞免疫水平。     

K型和D型CpG寡脱氧核苷酸对猪外周血单个核细胞免疫刺激活性的比较研究

目的：比较K、D两型CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对猪外周血单个核细胞(PBMC)免疫刺激活性的差异。方法：用人工合成的-K型和D型两类CpG ODN和不含CpG基元的对照ODN D48分别刺激已分离的猪PBMC,^3H—TdR掺入法测定每分闪烁次数(cpm)值,计算刺激指数(SI)。双抗体夹心ELISA法测定活化细胞上清中IFN—γ和IL—2表达水平。结果：D和K型CpG ODN对猪PBMC增殖均具有较强刺激作用,K型的增殖效应高于D型。含“GTCGTT”基元的2006作用尤为显著,但不能有效刺激猪：PBMC分泌IFN—γ和IL—2。D型刺激增殖效应低于K型,但能有效地促进猪PBMC分泌IFN—γ和IL—2。结论：K型和D型CpG ODN在刺激猪PBMC增殖及其分泌IFN—γ、IL—2的水平有所不同。     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶（CHS）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9%以上。结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

CpG寡聚脱氧核苷酸抑制肾癌细胞增殖及肿瘤生长的体内外实验研究

目的 研究CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）在体内外对肾癌细胞增殖及肿瘤生长的抑制作用,并探讨其可能的作用机制.方法 采用CCK-8法检测不同浓度CpG ODN1826和non-CpG ODN1982（ODN1982）干预对体外培养人肾透明细胞癌Caki-1细胞增殖的影响.24只BALB/c裸鼠皮下接种Caki-1细胞建立荷瘤裸鼠模型,4 d后根据每周1次的治疗方式随机分为对照组（PBS）、ODN1982组（50μgODN1982）、小剂量CpG ODN1826组（25 μg CpG ODN1826）和大剂量CpG ODN1826组（50 μg CpGODN1826）,每组6只.于建模后35 d处死动物,比较各组荷瘤裸鼠的肿瘤体积、质量及肿瘤组织学改变;体外分离各组荷瘤裸鼠脾淋巴细胞,乳酸脱氢酶释放法检测不同靶标比例（脾淋巴细胞：Caki-1细胞或脾淋巴细胞：小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞）的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性.结果 ODN1982对Caki-1细胞的体外增殖活性无显著影响;500μg/mL CpGODN1826干预可显著抑制Caki-1细胞增殖.至实验终止时点,小剂量和大剂量CpG ODN1826组荷瘤裸鼠的肿瘤体积显著小于ODN1982组和对照组（P＜0.05）;各组间肿瘤质量比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;组织学观察显示,小剂量和大剂量CpG 0DN1826组肿瘤组织较多炎性细胞浸润.当靶标比例为50∶1时,大剂量CpG ODN1826组裸鼠脾淋巴细胞对Caki-1细胞和YAC-1细胞的杀伤活性分别为（9.74±1.16）%和（79.65±5.23）%,显著高于对照组的（7.67±0.22）%和（10.12±3.03）%及ODN1982组的（7.66±0.93）%和（27.60±9.83）%（P＜0.05）.结论 CpG ODN对体外肾癌细胞增殖及荷瘤裸鼠肿瘤组织生长均具有明显抑制作用,其机制可能与CpG ODN增强荷瘤裸鼠的固有免疫应答有关.     

TLR9在非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞抗肿瘤免疫中的调控作用

目的 研究TLR9激动剂--含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血单个核细胞(PBMC)抗肿瘤免疫的影响.方法 分离36例NSCLC患者PBMC和肺癌细胞,RT-PCR检测TLR9 mRNA表达.PBMC分别经空白培养、不含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸(non-CpG ODN)和CpG ODN共培养72 h.3H-TdR掺入法测定PBMC增殖变化.流式细胞仪检测T细胞表面CD69分子变化、T细胞亚群比例以及CD8+T胞内IFN-γ和IL-4的表达.ELISA法测定PBMC上清液IFN-α的浓度,并评价抑制性ODN和氯喹对IFN-α产生的影响.分别以自体肿瘤细胞和K562细胞为靶细胞(T),以PBMC为效应细胞(E)流式细胞仪检测不同E/T时PBMC的细胞毒活性.结果 NSCLC患者PBMC表达TLR9 mRNA,其表达强度(0.76±0.09)与健康者(0.77±0.09)差异无统计学意义(t=0.00,P=1.00).CpG ODN诱导肺癌患者PBMC增殖(P<0.01),上调CD3+T细胞表面CD69分子表达(P<0.01),增加CD4+T/CD8+T比值(P<0.01),增强CD8+T产生IFN-γ的能力(P<0.01).CpG ODN促进PBMC分泌IFN-α(P<0.01),抑制性ODN和氯喹抑制CpG ODN诱导产生的IFN-α.CpG ODN增强PBMC对K562和自体肿瘤细胞的细胞毒活性(均P<0.01).结论 TLR9参与调控NSCLC患者的抗肿瘤免疫,TLR9的激活效应主要包括促进PBMC活化、增殖并诱导产生IFN-α,增加PBMC中CD4+T的比例并促进CD8+T分泌IFN-γ,增强PBMC对肿瘤细胞的细胞毒活性.     

Modulation of TLR9 on anti-tumor immune responses of peripheral blood mononuclear cells from patients with non-small-cell lung cancer

OBJECTIVE: To assess the modulation of TLR9 on anti-tumor immune responses in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC). METHODS: PBMCs were isolated from 36 NSCLC patients. Lung cancer cells were isolated from these patients and further enriched. PBMCs were cultured in RPMI-1640 medium (blank control group), and medium with cytosine guanine oligodeoxynucleotide (CpG ODN, an TLR9 agonist) or control ODN for 72 h; and then flow cytometry was used to examine the expression of CD69 antigen on the surface of CD3 cells, [3H]-thymidine incorporation method was used to examine the cell proliferation, and the IFN-alpha level in the supernatant was measured. Another PBMCs were cultured in medium with interleukin (IL)-1 and then CpG ODN, control ODN, and CpG ODN + chloroquine or inhibitory ODN were added respectively for 24-48 h. Then the IFN-alpha in the supernatant was measured. Subsets were assessed by flow cytometry and the expression of TLR9-mRNA in freshly isolated PBMC was detected by RT-PCR. The production of interferon (IFN)-alpha in the PBMCs was measured by ELISA. The proliferation of the PBMCs was determined by [3H]-thymidine incorporation. The PBMCs co-cultured with CpG ODN and autologous lung tumor cells treated with mitomycin C were used as effector cells, and K562 cells and autologous tumor cells were used as target cells flow cytometry was used to detect the capacity of PBMCs to kill autologous lung tumor cells and K562 cells. Meanwhile we investigated the intracellular expression of IFN-gamma and IL-4 in CD8+ T. RESULTS: The expression level of TLR9 of the PBMCs from patients was not significantly different from that of the PBMCs from the healthy donors. The proportion of CD69 antigen expressing CD3+ T cells of the CpG ODN group was (39.5 +/- 8.9)%, significantly higher than those of the blank control group [(8.8 +/- 1.2)%, t = 40.30, P = 0.00] ands control ODN group [(10.6 +/- 1.0)%, t = 41.85, P = 0.00]. Examination with beta liquid scintillation counter showed that the cpm value of the CpG ODN group was (1.61 +/- 0.20) x 10(4), significantly higher than those of the blank control group [(0.27 +/- 0.14) x 10(4), t = 20.43, P = 0.00] and control ODN group [(0.34 +/- 0.13) x 10(4), t =20.20, P = 0.00]. Chloroquine and inhibitory ODN dose-dependently inhibited the IFN-alpha levels in the supernatant. The CD4 + T/CD8 + T of the CpG ODN group was (3.44 +/- 0.20), significantly higher than those of the control ODN group (1.73 +/- 0.27, t = 19.85, P = 0.00) and blank control group (1.69 +/- 0.13, t = 29.32, P = 0.00). The IFN-gamma positive CD8 + T cells of the CpG ODN group was (18.5 +/- 4.2)%, significantly higher than those of the control ODN group [(4.2 +/- 1.0)%, t = 24.12, P = 0.00] and blank control group [(3.1 +/- 1.2)%, t = 25.1, P = 0.00]. There was no significant differences in the proportion of IL-4 positive CD8 + T cells among different groups. When the E/T was 40:1 the killing capacity of PBMCs against the K562 cells was (19.5 +/- 1.0), significantly higher than those of the control ODN group (7.9 +/- 1.1, t = 19.9, P = 0.00) and blank control group (5.1 +/- 1.6, t = 21.9, P = 0.00), and the killing capacity of PBMCs against the autologous lung tumor cells was (29.8 +/- 2.1), significantly higher than those of the control ODN group (8.1 +/- 0.9, t = 36.9, P = 0.00) and blank control group (5.7 +/- 1.6, t = 35.7, P = 0.00). CONCLUSION: TLR9 signal takes part in the immunomodulation of PBMCs. The activation of TLR9 results in enhanced anti-tumor response in the PBMCs against autologous lung cancer cells and K562 cells.     

Enhancement of Immunological Activity of CpG ODN by Chitosan Gene Carrier

To investigate the enhancement of immunological activity of CpG ODN by chitosan gene carrier in mice, the effect of lymphocyte proliferation was detected in mice by using MTT, the levels of IgG and cytokines (IL-2 and IL-12) in serum were measured by ELISA and peripheral blood T lymphocyte subsets CD4 , CD8 were analyzed by flow cytometry. Our results showed that spleen lymphocytes isolated from the CS-CpG ODN group of mice showed the strongest proliferation (SI =1.551), and the levels of IgG, IL-2 and IL-12 in serum were higher than those of other groups. Com- pared with the immunization with CpG ODN, the immunization with CS-CpG ODN gene carrier was more efficient in up-regulating the percentage of CD4 T cells and the ratio of CD4 /CD8 of mice. It was concluded that CS gene carrier of CpG ODN was much more effective in improving immunity of CpG ODN in mice.