CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251体外增殖和侵袭能力的影响,为CXCR4 shRNA治疗胶质瘤提供实验依据. 方法 用脂质体LipofectimineTM2000将CXCR4-shRNA转染U251细胞,MTT实验检测转染细胞的增殖,Transwell侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力. 结果 与转染非特异的pGPU6/GFP/NC组和未转染组比较,转染CXCR4-shRNA载体pGPU6/GFP/Rac 1-421组的U251细胞CXCR4 mRNA显著降低(P＜0.05),并且细胞体外增殖能力减弱(P＜0.05),侵袭到滤膜底面的细胞数为36.67±9.76,分别低于对应的pGPU6/GFP/NC组和未转染组(P＜0.05). 结论 CXCR4 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-421可下调U251细胞CXCR4的表达,抑制U251细胞的增殖和迁移侵袭能力,提示CXCR4在胶质瘤发展过程中具有重要作用.     

可调控型反义MMP-9表达与恶性肿瘤转移表型的相关性研究

目的探讨金属蛋白酶MMP-9与肿瘤转移的相关性。方法利用基因重组技术构建反义MMP-9cDNA四环素可调控表达载体,用脂质体法转染反义MMP-9至转移性人黑色素瘤细胞株WM451(高表达MMP-9)。检测转染后细胞MMP-9表达水平的改变以及裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果转染反义基因后,WM451细胞MMP-9的表达及活性明显下降,体外侵袭能力及裸鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制;运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达。结论反义MMP-9基因下调MMP-9的表达,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制,说明MMP-9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用。同时,四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达。     

沉默CXCR4基因表达抑制胰腺癌增殖和侵袭的体外研究

目的 利用RNAi技术构建CXCR4 shRNA表达载体,观察CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖及侵袭能力的变化.方法 在不同分化程度胰腺癌细胞株中筛选出CXCR4高表达胰腺癌细胞株,RNAi技术构建CXCR4shRNA表达载体,转染胰腺癌CXCR4高表达细胞Miapaca-2并应用G418筛选出稳定表达株,Real-time PCR、Western blot实验观察RNAi对CXCR4基因的抑制效率;MTT实验检测CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖,应用Transwell侵袭小室观察CXCR4干扰对胰腺癌细胞侵袭转移力的影响.结果 胰腺癌细胞株Miapaca-2 CXCR4表达异常增高,特异性CXCR4基因沉默能够在基因和蛋白水平稳定、高效、特异地抑制CXCR4的表达,抑制效率达70％以上.特异性CXCR4 shRNA能够抑制细胞生长,细胞达到对数生长期的时间延长(P＜0.05).Transwell实验证明CXCR4基因干扰后细胞侵袭能力减低(P＜0.05),即使SDF-1的刺激也不能够使细胞侵袭能力增加.结论 成功构建了针对胰腺癌细胞CXCR4的siRNA载体;CXCR4基因沉默能抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和成瘤能力.     

稳定沉默CXCR4表达的肾癌A498细胞株的构建

目的应用RNA干扰技术降低肾癌A498细胞株的CXCR4基因表达水平,并建立稳定转染细胞株。方法针对CXCR4基因设计合成siRNA,转染肾癌A498细胞株,采用RT-PCR法检测CXCR4基因表达变化,根据有效干扰片段结果合成重组shRNA质粒,稳定转染至A498细胞系并进行G418抗性筛选细胞株。采用RT-PCR和Westen印迹法检测CXCR4mRNA及蛋白表达水平,应用流式细胞技术检测CXCR4shRNA诱导A498细胞凋亡的效应,Transwell试验检测细胞侵袭能力的改变。结果将CXCR4重组shRNA质粒成功转染A498细胞后,肾癌细胞内可见绿色荧光,通过G418筛选,获得了CXCR4基因沉默的A498细胞系,RT-PCR及Western印迹检测证实该细胞系的CXCR4水平明显低于对照组的表达水平(P<0.05)。CXCR4shRNA组细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均显著高于对照组(P<0.05),Tran-swell体外侵袭实验显示CXCR4shRNA能明显抑制A498细胞的体外侵袭力(P<0.05)。结论成功构建稳定沉默CXCR4表达的肾癌A498细胞株,转染后的细胞凋亡率升高,体外侵袭能力降低,为后续研究奠定了基础。     

PKM2基因沉默对人肺癌细胞生物学特性的影响

目的 探讨M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）下调对人肺癌A549细胞生物学特性的影响。方法 采用免疫荧光技术检测A549细胞中PKM2蛋白的表达;将构建有PKM2-shRNA的重组质粒转入A549细胞;分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测PKM2 mRNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测PKM2基因沉默对A549细胞增殖能力的影响;采用葡萄糖测定试剂盒测定细胞对葡萄糖的消耗量;Transwell实验检测细胞穿过人工基膜的能力。结果 肺癌A549细胞的细胞质及细胞核中均有PKM2表达;PKM2-shRNA质粒转染A549细胞48h后,可明显下调A549细胞中PKM2 mRNA及蛋白的表达水平,并且明显抑制A549细胞增殖;PKM2 shRNA可减少A549细胞葡萄糖的消耗,还可抑制细胞侵袭能力。结论 在肺癌细胞A549中,抑制PKM2表达可显著抑制细胞增殖、侵袭和糖代谢能力。     

RNA干扰沉默CXCR4基因对肝癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨RNA干扰质粒靶向沉默CXCR4基因表达,对人肝癌细胞增殖和侵袭作用的影响及其机制。方法检测不同分化程度的肝癌细胞株CXCR4表达程度。将CXCR4干扰质粒转染肝癌细胞HepG2,经G418筛选出稳定抑制细胞,使用Western blotting和Real time RT-PCR验证干扰质粒对CXCR4基因的靶向沉默效率。MTT法和Transwell小室试验检测CXCR4基因沉默后肝癌细胞的增殖能力和侵袭能力。Western blotting检测基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,免疫荧光检测MMP-2在细胞内表达。结果不同分化程度的肝癌细胞均有CXCR4表达,其中HepG2细胞表达最强。通过RNA干扰技术靶向沉默CXCR4基因,可高效、稳定地抑制CXCR4表达。CXCR4基因靶向沉默后明显抑制肝癌细胞增殖和侵袭。Western blotting提示CXCR4基因靶向沉默导致MMP-2蛋白表达明显下调。结论 CXCR4基因沉默可以抑制肝癌细胞增殖和侵袭,可能与其抑制侵袭相关分子MMP-2有关,提示CXCR4可能是肝癌治疗的一个有效靶点。     

CXCR7-shRNA慢病毒载体对人肝癌细胞生长及侵袭能力的抑制作用

目的探讨CXCR7-shRNA慢病毒表达载体靶向抑制CXCR7的表达对人肝癌细胞增殖及侵袭能力的影响。方法利用
RNA干扰技术,构建CXCR7的shRNA慢病毒表达载体,转染人肺转移肝癌细胞株HCCLM3,分别通过RT-PCR和Western blot
检测HCCLM3细胞中CXCR7 mRNA和蛋白质表达水平的变化;然后通过MTT法考察CXCR7沉默对HCCLM3细胞增殖侵袭
能力的影响,通过体外粘附实验和Transwell小室法分别考察CXCR7沉默对HCCLM3细胞粘附及侵袭能力的影响。结果与空
白对照组比较,转染CXCR7-shRNA慢病毒载体的HCCLM3细胞中CXCR7 的mRNA及蛋白水平表达均明显降低（P<0.01）,
SDF-1诱导的HCCLM3细胞的增殖能力显著下降（P<0.05）,同时HCCLM3细胞的粘附及侵袭能力也明显受到CXCR7-shRNA
的抑制（P<0.01）。结论靶向沉默CXCR7能显著抑制结肝癌细胞的增殖和侵袭能力,为肝癌的治疗提供一个潜在的作用靶点。
     

miR-15b在恶性黑色素瘤A375细胞中的表达及其对细胞转移和侵袭的影响

目的 研究微小RNA-15b（microRNA-15b,miR-15b）在恶性黑色素瘤A375细胞中的表达,以及miR-15b对恶性黑色素瘤细胞转移和侵袭能力的影响。方法 应用荧光实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）方法检测恶性黑色素瘤A375细胞与正常黑素细胞HM中miR-15b的表达水平。沉默恶性黑色素瘤A375细胞中miR-15b的表达后,应用划痕实验检测miR-15b对恶性黑色素瘤A375细胞迁移距离的影响,应用Transwell实验检测miR-15b对恶性黑色素瘤A375细胞转移和侵袭能力的影响。结果 miR-15b恶性黑色素瘤A375细胞中的表达水平显著高于正常黑素细胞。沉默恶性黑色素瘤细胞中miR-15b的表达后,细胞迁移距离、细胞转移和侵袭能力均受到显著抑制。结论 miR-15b在恶性黑色素瘤A375细胞中表达显著升高并可促进恶性黑色素瘤A375细胞转移和侵袭。     

金属蛋白酶MMP-9表达与人黑色素瘤细胞系转移表型的相关性

目的 :探讨金属蛋白酶MMP 9与肿瘤转移的相关性。方法 :利用基因重组技术构建反义MMP 9cDNA真核表达载体 ,用脂质体法转染MMP 9高表达的转移性人黑色素瘤细胞株WM 45 1,检测转染后细胞MMP 9表达水平的改变以及体外生长、侵袭、裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果 :转染细胞MMP 9的表达及活性明显下降 ,同时MMP 2的表达也受到一定抑制 ,细胞生长速度、体外侵袭能力及裸鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制。结论 :通过反义RNA技术下调MMP 9的表达 ,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制 ,说明MMP 9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用     

S100A4-siRNA体外转染下调MMP-2表达抑制胰腺癌细胞侵袭能力的研究

目的观察S100A4基因沉默后人胰腺癌Bxpc-3细胞株S100A4和MMP-2的表达及肿瘤细胞迁移和侵袭能力的变化,探讨S100A4基因在肿瘤转移中的作用机制。方法采用RNA干扰技术将S100A4-siRNA转染至人胰腺癌Bxpc-3细胞,采用荧光实时定量PCR和Western免疫印迹方法检测转染前后S100A4和MMP-2的mRNA和蛋白表达;以Transwell小室模型检测转染前后癌细胞迁移和侵袭能力变化。结果转染后S100A4和MMP-2的表达均下调;细胞体外迁移和侵袭能力显著降低（P〈0.05）。结论 S100A4基因上调MMP-2的表达是肿瘤细胞具有高侵袭性的机制之一。S100A4基因可以作为胰腺癌基因治疗的一个靶点。     

靶向抑制存活素基因对大肠癌细胞SW80侵袭和转移的实验研究

目的 构建靶向存活素(survivin)基因的短发夹干扰RNA(shRNA)表达载体,导入人大肠癌细胞SW480中,研究靶向抑制survivin基因对SW480细胞侵袭和转移的影响.方法 根据siRNA设计原则,在survivin序列中选取设计含19个核苷酸(19 nt)的靶序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制survivin基因的sihNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin;采用Lipofectamine 2000TM转染试剂将干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-survivin导入到大肠癌细胞SW480中;用Western blotting从蛋白水平检测干扰效果;分别采用肿瘤侵袭粘附实验和明胶酶谱分析法检测pRNAT-U6.1/Neo-survivin对SW480细胞的侵袭和转移潜能的影响.结果 Survivin基因的蛋白表达均得到显著抑制;沉默SW480的survivin基因可以显著抑制SW480细胞的侵袭和转移潜能,而且survivin基因表达被抑制后,SW480细胞分泌基质金属蛋白酶明显减少.结论 Survivin基因可能在SW480的侵袭和转移潜能中起重要作用,沉默SW480的survivin基因可以显著抑制其侵袭、转移和基质金属蛋白酶分泌,因而survivin影响SW480的侵袭和转移可能与调控基质金属蛋白酶分泌密切相关.     

SRC激酶抑制剂PP2 通过上调Cx43蛋白表达降低肺癌A549 细胞的侵袭和转移

目的观察SRC激酶抑制剂PP2对肺癌细胞A549侵袭转移能力的影响,并探讨相关机制。方法采用MTT法检测PP2对 A549细胞的增殖抑制作用;利用细胞划痕实验和Transwell 实验分别测定不同浓度PP2处理A549细胞24 h后的侵袭和转移能 力;采用Western blot法检测SiRNA沉默Cx43基因、mRNA过表达Cx43基因和PP2处理后细胞内Cx43、MMP-2的表达。结果 MTT法显示2、4、8、16、32 μmol/L PP2显著抑制A549细胞的增殖,且在该范围内有浓度依赖性。采用1、2、4、8、16 μmol/L PP2分 别作用于A549细胞24 h,细胞的侵袭、转移能力也逐渐降低（P<0.05）。4 μmol/L 和8 μmol/L PP2可以显著增加细胞Cx43蛋白 水平,降低MMP-2蛋白水平。过表达Cx43蛋白后,PP2抑制细胞侵袭转移能力增强;沉默Cx43蛋白后,PP2抑制细胞侵袭转移 能力降低（P<0.05）。结论SRC激酶抑制剂PP2可以降低肺癌细胞A549的侵袭转移能力,该作用与细胞Cx43蛋白的表达有关。     

G31P对人肝癌细胞增殖黏附及侵袭作用的影响

目的探讨原发性肝细胞癌中CXCR1、 CXCR2和CXCL8的表达及CXCR1/2受体阻断剂G31P对Hep-G2细胞体外增殖、黏附和侵袭作用的影响。方法选取2018年12月至2020年12月在安徽医科大学第四附属医院普通外科和肿瘤科接受部分肝切除手术的50例肝癌患者,用免疫组织化学方法,检测癌组织和癌旁组织中CXCR1、 CXCR2、CXCL8的表达水平,分析比较CXCR1、CXCR2及CXCL8在肝癌不同临床病理特征中的表达情况。采用Spearman相关分析CXCR1、CXCR2及CXCL8表达与pAKT、pERK、CyclinD1、Bcl-2、VEGF、MMP-9表达量之间的相关性;分别用0、10、50 ng/mL的G31P处理肝癌细胞Hep-G2,每个浓度5个孔,用CCK-8法、ECM实验以及Transwell小室侵袭实验,观察其对Hep-G2增殖、黏附以及侵袭能力的影响。结果肿瘤组织中CXCR1、CXCR2和CXCL8的阳性率高于相应正常癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);且不同肝癌TNM分期的患者,CXCR1、CXCR2及CXCL8表达差异有统计学意义(P&l...     

MMP-9与人黑色素瘤细胞生长相关性的研究

目的 利用多种方法检测金属蛋白酶MMP—9基因与人黑色素瘤细胞生长的相关性。方法 利用细胞记数、MTT、^3H—thymidine掺入实验等方法检测分别转染正义和反义MMP—9CDNA后人黑色素瘤细胞生长速度的改变。结果 转染反义基因后WM45l细胞生长速度受到明显抑制(P＜0．05)；转染正义基因后WM35细胞生长速度受到明显促进(P＜0．05)。而运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达，其结果与对照细胞相似。结论 反义MMP—9基因使人黑色素瘤细胞的生长能力受到一定程度的抑制，正义MMP—9基因使人黑色素细胞的生长能力受到一定程度的促进。说明MMP—9在人黑色素瘤细胞生长过程中起重要作用。同时，四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达。     

CXCR4在不同转移潜能肝癌细胞中的表达及意义

  目的研究趋化因子受体CXCR4在高、低转移潜能肝癌细胞中的表达,并探讨其在肝癌细胞增殖和侵袭转移过程中的作用。方法 利用3B肝癌细胞株对人工基底膜穿透能力的差异获得不同转移潜能肝癌细胞亚系,并通过transwell小室侵袭实验比较两细胞亚系的侵袭能力从而对其进行验证, 应用RT-PCR和Western Blot检测CXCR4在两细胞亚系中的表达。CCK8法检测两细胞亚系生长曲线和倍增时间,流式细胞仪检测两细胞亚系细胞周期和凋亡率。结果成功筛选出高、低转移潜能肝癌细胞亚系,并通过transwell小室侵袭实验证实高转移潜能肝癌细胞的侵袭能力高于低转移潜能肝癌细胞;RT-PCR和Western Blot均显示高转移潜能肝癌细胞在基因水平和蛋白水平的CXCR4表达均显著高于低转移潜能肝癌细胞;且两细胞亚系体外生长速度、倍增时间、细胞周期和凋亡率均具有明显差异。结论上述结果表明CXCR4在肝癌进展中发挥了重要的作用,可能为未来肝癌的诊疗提供理论依据。     

靶向干扰CXCR7基因表达对肝癌(HCC)细胞增殖及凋亡的影响

 目的  探讨CXCR7基因在不同肝癌细胞系及肝癌组织中的表达情况,并研究靶向抑制CXCR7基因表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法  应用Western blot检测不同肝癌细胞系及10例肝癌组织中CXCR7蛋白的表达水平。采用短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默HCCLM3与MHCC97L细胞中CXCR7基因的表达,分别采用Western Blot和qRT PCR检测shRNA的靶向沉默效果。通过CCK-8增殖实验与Annexin V-FITC/PI细胞双染色研究CXCR7抑制对HCCLM3与MHCC97L增殖及凋亡的影响。结果  CXCR7表达水平与肝癌细胞的恶性程度呈正相关,肝癌组织中CXCR7表达水平较癌旁显著升高。实验成功构建了9个慢病毒表达载体,其中CXCR7 shRNA 566序列干扰效率最高。增殖实验显示干扰表达组细胞生长速度受到明显抑制(P<0.05);流式细胞仪分析显示干扰CXCR7表达可诱导细胞凋亡的发生。结论  CXCR7表达水平与肝癌恶性程度呈正相关,靶向干扰CXCR7表达可抑制细胞的增殖能力,诱导细胞发生凋亡。