人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值研究

目的 探索HPV E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值。方法 收集2016年12月~2017年10月在笔者医院妇科行细胞学和HPV DNA基因分型联合筛查发现疑似宫颈病变并转阴道镜活检的女性病例262例,活检同期均行HPV E6/E7mRNA检测,以宫颈组织病理活检为标准对照。对比3种方法检测宫颈病变HSIL的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及受试者工作特征曲线下面积（AUC）,及3种方法在不同病理级别中的检出情况,并分析HPV E6/E7mRNA病毒载量与病变关系。结果 HPV E6/E7mRNA检测宫颈病变≥HSIL的敏感度与HPV DNA基因分型和细胞学相似,特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比均高于细胞学和HPV DNA基因分型;HPV E6/E7mRNA的受试者工作特征曲线下面积（AUC=0.80, P<0.01）高于细胞学（AUC=0.65, P<0.01）和HPV DNA分型（AUC=0.54,P>0.05）的曲线下面积;HPV mRNA和细胞学在不同病理级别中的检出率比较,差异有统计学意义（P<0.01）,HPV DNA基因分型在不同病理级别中的检出率比较差异无统计学意义（P>0.05）;HPV E6/E7 mRNA表达水平与组织病理分级之间的相关关系有统计学意义（P<0.01）,且HPV E6/E7mRNA表达水平与宫颈病理分级间呈正相关（r=0.467）。结论 HPV E6/E7mRNA检测对宫颈病变诊断准确性优于细胞学和HPV DNA分型,在宫颈病变及癌变的筛查中具有一定的临床价值,临床医生应给予关注。     

宫颈组织人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA ATG-12 Tie-1 表达情况及与鳞状上皮内病变病理分级的相关性

目的 分析宫颈组织人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA、自噬相关蛋白12(ATG12)、酪氨酸激酶受体1(Tie-1)表达情况,及与子宫颈鳞状上皮内病变(SIL)病理分级的相关性。方法 将2017年1月至2020年12月在南阳市中心医院保存宫颈活检组织或手术切除宫颈组织的228例患者按2014年WHO女性下生殖道肿瘤分类标准分组,分别纳入慢性宫颈炎组(n=34)、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组(n=20)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组(n=55)、宫颈鳞癌(CSCC)组(n=119)。通过分支DNA杂交实验(bDNA)法检测宫颈组织HPVE6/E7 mRNA表达情况,利用免疫组化法检测宫颈组织ATG12、Tie-1表达情况,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析HPV E6/E7mRNA、ATG-12、Tie-1表达情况对HSIL+(HSIL、CSCC)的筛查价值。结果 HSIL组、CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于慢性宫颈炎组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于慢性宫颈炎组,差异均有统计学意义(P<0.05);LSIL组与慢性宫颈炎组,差异无统计学意义(P<0.05);HSIL组、CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于LSIL组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于LSIL组(P<0.05),CSCC组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于HSIL组,ATG-12阳性率及Tie-1阳性率低于HSIL组(P<0.05);ROC曲线显示,单一HPV E6/E7 mRNA、ATG-12、Tie-1筛查HSIL+时,Tie-1阴性的曲线下面积(AUC)最大,筛查灵敏度为78.16%,特异度为83.33%,3者联合筛查HSIL+的AUC值上升至0.856,灵敏度、特异度分别为89.66%、81.48%,高于HPV-E6/E7 mRNA阳性、ATG-12阴性、Tie-1阴性筛查的AUC值(P<0.05)。结论 不同SIL病理分级的宫颈组织HPVE6/E7mRNA、ATG12、Tie-1阳性表达率存在差异,较单纯HPVE6/E7mRNA筛查HSIL+,联合ATG12或Tie-1检测可提升筛查特异度。     

高危型HPV E6/E7 mRNA检测在ASC-US分流中的诊断价值

目的 探讨高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papilloma virus,HR-HPV）E6/E7 mRNA检测在无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undetermined significance,ASC-US）分流中的诊断价值。方法 对320例ASC-US患者进行HR-HPV E6/E7 mRNA和HR-HPVDNA检测,同时行阴道镜检查和宫颈活检,结合病理学诊断资料进行统计学分析。结果 HR-HPV E6/E7 mRNA在宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宫颈癌中的阳性率与HR-HPV DNA比较,差异有统计学意义（P<0.05）;CINⅡ+级和CINⅢ+级的HR-HPV E6/E7 mRNA阳性率分别高于CINⅡ-级和CINⅢ-级,差异均有统计学意义（P均<0.05）。HR-HPV E6/E7 mRNA与HR-HPV DNA检测CINⅡ+级和CINⅢ+级的敏感度、阳性预测值、阴性预测值比较,差异无统计学意义（P均>0.05）;两者特异性比较,差异有统计学意义（P均<0.05）;利用受试者工作特征（ROC）曲线,HR-HPV E6/E7 mRNA检测诊断CINⅡ+级和CINⅢ+级的效能比HR-HPV DNA更佳,差异均有统计学意义（P均=0.000）。<30岁组的HR-HPV DNA阳性率明显高于≥30岁组,差异有统计学意义（P<0.01）;两个年龄组的HR-HPV E6/E7 mRNA阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。结论 HR-HPV E6/E7 mRNA检测可作为ASC-US患者是否需要阴道镜转诊的更确切有效的指标,其特异性和诊断价值更佳。     

高危人乳头瘤病毒DNA及其E6／E7mRNA对宫颈病变的影响

目的：分析不同宫颈病变患者高危HPV DNA及其E6/E7mRNA在不同宫颈病变中的阳性率有无差异,评估mRNA拷贝数大小与病变等级的关系。方法采用聚合酶链反应-反向点杂交技术、原位杂交技术对101例宫颈脱落细胞标本（炎症组29例,低级别组29例,高级别组43例）进行HPV分型及高危 HPV E6/E7 mRNA拷贝数的检测。结果高危HPV DNA及其E6/E7mRNA在炎症组与低级别组、炎症组与高级别组中的阳性率均具有统计学差异（均P＜0.05）,其拷贝数的均值随着宫颈病变等级的上升而明显增加。结论高危HPV的感染及其E6/E7mRNA的表达与宫颈病变密切相关,E6/E7 mRNA拷贝数的大小影响宫颈病变的程度。两者结合将更有利于对宫颈病变的综合评估。     

高危HPVE6/E7mRNA对宫颈病变诊断价值的研究

目的 探讨高危HPV E6/E7 mRNA对宫颈病变的临床诊断价值。 方法 根据病理诊断结果的不同分为两组,其中慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级患者共48例为对照组,高级别宫颈病变(包括CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈浸润癌)共42例患者为观察组,分别对上述宫颈细胞标本进行HPV DNA分型检测和高危HPV E6/E7 mRNA检测。 结果 慢性宫颈炎、CINⅠ组中高危HPV DNA的检出率(29.1%)明显高于高危HPV E6/E7 mRNA(8.3%),高级别宫颈病变组中高危HPV E6/E7 mRNA的检出率(85.7%)明显高于高危HPV DNA(64.3%),差异有统计学意义(P<0.05);高危HPV E6/E7 mRNA检测的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值(85.7%、91.7%、90.0%、88.0%)均高于HPV DNA分型检测(64.3%、70.8%、65.9%、69.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 高危HPV E6/E7 mRNA检测在临床诊断过程中大大降低过度检查和治疗的机会,避免了高频率和重复感染给患者带来的经济负担和精神压力。     

宫颈组织HPV E6/E7 mRNA Atg-12 Tie-1表达情况与鳞状上皮内病变病理分级的相关性

目的 探讨宫颈组织人类乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA、自噬相关蛋白-12(Atg-12)、酪氨酸激酶受体-1(Tie-1)表达情况与鳞状上皮内病变(SIL)病理分级的相关性。方法 选取2020年5月至2021年10月新乡市中心医院病理科诊断为SIL的患者227例,根据宫颈病变分级分为低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组124例和高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组103例,另选取子宫肌瘤手术患者80例为对照组。所有患者均采用支链DNA信号扩增法检测HPV E6/E7 mRNA,采用免疫组化法及免疫印迹法检测Atg-12、Tie-1蛋白。分析E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1与病理分级的相关性,绘制受试者特征(ROC)曲线分析各指标对HSIL与LSIL的鉴别诊断价值。结果 HSIL组的HPV E6/E7 mRNA、Tie-1蛋白阳性检出率高于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的Atg-12蛋白阳性检出率低于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的HPV E6/E7 mRNA拷贝数、Tie-1蛋白表达量高于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的Atg-12蛋白表达量低于LSIL组和对照组(P<0.05)。HPV E6/E7 mRNA、Tie-1蛋白表达量与SIL病理分级呈正相关(r=0.514,0.488),Atg-12蛋白表达量与SIL病理分级呈负相关(r=-0.433)。HPV E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1鉴别诊断HSIL与LSIL的灵敏度为88.57%、74.29%、82.86%,特异度为57.14%、66.67%、64.29%。3项指标联合诊断的灵敏度为77.14%,特异度为85.71%(AUC=0.854)。结论 HSIL患者HPV E6/E7 mRNA、Tie-1表达较高,Atg-12表达较低。HPV E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1表达与SIL病理分级有一定相关性,联合诊断可为HSIL与LSIL的鉴别诊断提供参考。     

E6/E7 mRNA检测在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者中的临床价值

【摘要】目的 探讨人类乳头瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA检测在宫颈上皮内瘤变（CIN）及宫颈癌患者中的临床价值。方法 收集2015年6月~2017年6月于我院诊断的224例高危型人乳头瘤病毒（HR HPV）感染者,按病理检查结果分为CINⅠ级组（75例）、CIN Ⅱ级组（24例）、CIN Ⅲ级组（21例）、宫颈癌组（14例）,选取同期病理诊断结果显示正常或炎症者90例为正常组,采用b DNA技术检测宫颈脱落细胞HPVE6/E7mRNA表达的阳性率及表达量。比较不同液基薄层细胞检测（TCT）级别HPVE6/E7mRNA表达的阳性率及表达量。结果 各组HPVE6/E7mRNA阳性率逐渐降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;各组HPVE6/E7mRNA表达量逐渐降低,其中宫颈癌组显著高于其他组,差异具有统计学意义（P＜0.05）,CINⅠ、Ⅱ级比较,CINⅠ级、正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;宫颈癌组、高级别（HSIL）、低级别（LSIL）、非典型（ASC）鳞状上皮内瘤变、无上皮内病变（NSIL）HPVE6/E7mRNA阳性率逐渐降低,HPVE6/E7mRNA表达量逐渐降低;宫颈癌组HPVE6/E7mRNA阳性率显著高于其他TCT级别,宫颈癌组HPVE6/E7mRNA表达量显著高于其他TCT级别,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 HPV E6/E7mRNA检测有助于宫颈癌以及高级别CIN的筛查,可作为癌前病变与宫颈癌筛查的分子标志物。     

宫颈脱落细胞HPVE6/E7 mRNA检测在宫颈癌早期筛查与 HPV分型诊断中的应用

目的 研究宫颈脱落细胞E6/E7 mRNA检测在宫颈癌早期筛查与HPV分型诊断中的应用价值。方法 选取2018年3月至2020年3月安康市妇幼保健院收治的268例宫颈癌疑似病变患者作为研究对象,取宫颈脱落细胞作为实验标本,检测E6/E7mRNA阳性率及拷贝数,并行HPV分型检查。以病理诊断为金标准,其中140例纳入宫颈癌组,128例为非宫颈癌组。并对268例患者进行HPV分型,高危型HPV组212例,低危型HPV组15例,低危混合型HPV组41例,记录宫颈癌发生率。采用多因素回归分析宫颈癌与高危型HPV的影响因素,利用受试者工作曲线（ROC）分析各影响因素单项和联合对检测宫颈癌与HPV分型的准确性。结果 宫颈癌组患者E6/E7 mRNA阳性率和拷贝数均高于非宫颈癌组,高危型HPV组患者E6/E7 mRNA阳性率和拷贝数均高于低危型及低危混合型HPV组,差异均有统计学意义（P<0.05）。多因素分析结果显示受教育程度初中及以下（95% CI： 0.187~0.836）、孕次≥3次（95%CI： 1.079~1.625）、初次性生活时间<18岁（95% CI： 1.075~1.611）、鳞状细胞癌抗原（SCC）（95% CI： 1.058~1.782）及HPVE6/E7mRNA阳性（95%CI： 1.251~2.049）是宫颈癌的高危因素（P<0.05）。年龄（35~65岁）（95%CI： 1.134~1.436）、孕次≥3次（95% CI： 1.346~2.472）、性伴侣≥3个（95% CI： 1.526~2.386）、阴道分泌物异常（95%CI： 1.021~1.778）及HPVE6/E7 mRNA阳性（95% CI： 1.216~1.920）是高危型HPV的危险因素（P<0.05）。ROC分析显示孕次、初次性生活时间、SCC及HPVE6/E7 mRNA多项联合检测宫颈癌的AUC为0.826,高于单项检测（P<0.05）。年龄、孕次、性伴侣、阴道分泌物及HPVE6/E7 mRNA联合检测高危型HPV的AUC为0.880,高于单项检测（P<0.05）。结论 HPVE6/E7 mRNA阳性是宫颈癌和高危型HPV共同的独立影响因素,基于HPVE6/E7 mRNA的多项联合检测较单项检测能显著提高检测宫颈癌与HPV分型的准确性。     

高危型人乳头瘤病毒E6、E7mRNA检测筛检宫颈癌的临床评价

目的:探究高危型人乳头瘤病毒(HPV) E6、E7mRNA检测筛检宫颈癌的临床应用价值。方法:选取2016年3月—2017年3月因宫颈疾病于我院就诊的83例患者为观察对象,采集其宫颈样本后,对宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)常规筛检异常的患者阴道镜下取活检组织送病理学检查,以病理学检查结果为金标准,比较高危型HPV E6、E7mRNA与HPV-DNA分型检出率、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及检测费用、患者满意度。结果:高危型HPV E6、E7mRNA检出率57. 83%与HPV-DNA分型检出率62. 65%比较,差异无统计学意义(P> 0. 05),且慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的检出率比较,差异无统计学意义(P> 0. 05);高危型HPV E6、E7mRNA与HPV-DNA分型检测敏感性、阳性预测值、阴性预测值比较,差异无统计学意义(P> 0. 05);高危型HPV E6、E7mRNA检测特异性显著高于HPV-DNA分型(P <0. 05);与HPV-DNA分型检测比较,高危型HPV E6、E7mRNA检测费用显著较低,患者满意度显著较高,差异具统计学意义(P <0. 05)。结论:高危型HPV E6、E7mRNA筛检宫颈癌特异性更高,能减少因误诊造成的过度检测及治疗,提高患者满意度,减轻其经济负担。     

高危型人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA在宫颈CIN2+病变筛查中的应用价值

目的探讨高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV) E6/E7 mRNA在子宫颈上皮内瘤变中度及以上(CIN2+级)病变筛查中的临床应用价值。方法选取2016年6月至2017年6月在北京市垂杨柳医院因接触性阴道出血或疑似宫颈病变妇科门诊就诊的患者307例,均行液基薄层细胞检查(TCT)、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA的检测,并行阴道镜检查及活检。以病理结果为金标准,将病检结果为高级别鳞状上皮内病变(HSIL,包括CIN2和CIN3)或宫颈鳞癌或宫颈腺癌的71例患者作为观察组,记为CIN2+;将病检结果正常和低级别鳞状上皮内病变(LSIL,包括CIN1)的236例患者作为对照组,记为CIN2-。分析TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA的灵敏度和特异度差异。结果 HPV E6/E7mRNA及HPV DNA对CIN2+诊断的特异度分别为79. 66%及19. 49%,差异有统计学意义(P <0. 05)。HPV E6/E7mRNA联合TCT及HPV DNA联合TCT检测对CIN2+诊断的特异度分别为82. 63%及35. 17%,差异有统计学意义(P <0. 05)。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA在筛查CIN2+的ROC曲线下面积分别为0. 8420和0. 5693,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 HPV E6/E7 mRNA较HPV DNA检测筛查宫颈CIN2+的病变效果更好,HPVE6/E-7mRNA联合TCT检测能够提高对CIN2+的病变筛查的特异性。     

高危型HPVE6E7mRNA检测在HPV-DNA阳性患者中临床意义的研究*

目的 探讨高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)E6/E7 mRNA 检测对于HPV病毒感染患者中的临床价值和意义。方法 选取2017年1月-2017年8月在宫颈疾病诊治中心进行宫颈机会性筛查, 且HPVDNA检测阳性病例200例,分别行HPVE6E7mRNA检测和阴道镜下的宫颈活组织检查,分析病毒阳性患者中E6/E7mRNA的检出率,不同病理诊断中E6/E7mRNA的表达情况。结果 200例HPV-DNA阳性患者中,HPV E6/E7mRNA检出率为60.0%,病理学诊断HSIL(高级上皮内瘤样病变)以上, E6/E7 mRNA阳性表达最高,与正常组或LSIL(低级宫颈上皮内瘤样病变)组均有明显差异,并且E6/E7mRNA检测的敏感度和阴性预测值较高,分别为(97.9%和98.8%)。病理学诊断≤LSIL,E6/E7 mRNA阳性率较低,敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值都不高。结论 HPVE6/E7mRNA基因检测可用于HPVDNA阳性患者的分流,避免过度治疗,减轻患者心理负担。HPVE6/E7mRNA阳性表达在宫颈筛查中对高级别病变的诊断具有临床价值。     

HPVE6/E7mRNA和高危型HPVDNA检测在ASC-US患者中的临床应用研究

目的 分析并比较人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7mRNA和高危型HPV（HR-HPV）DNA检测在无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（ASC-US）患者中的临床应用价值。方法 对160例薄层液基细胞学检查（TCT）诊断为ASC-US的患者进行HPVE6/E7mRNA和HR-HPVDNA的检测,并进行阴道镜检查和宫颈活检,结合病理学诊断结果进行统计学分析。结果（1）21～29岁年龄组HR-HPVDNA阳性率明显高于其他年龄组,差异有统计学意义（P＜0.05）;各年龄组HPVE6/E7mRNA的阳性率无统计学差异（P＞0.05）。（2）宫颈上皮内瘤变（CIN）II+级和CINIII+级的HPVE6/E7mRNA阳性率明显高于CINII－级,差异有统计学意义（P＜0.05）;CINII+级和CINIII+级的HR-HPVDNA阳性率亦明显高于CINII-级,差异有统计学意义（P＜0.05）;CINII+级和CINIII+级的HPVE6/E7mRNA阳性率和HR-HPVDNA阳性率均无统计学差异（均P＞0.05）。（3）HPVE6/E7mRNA检测诊断CINII+级的灵敏度为69.2%,低于HR-HPVDNA检测的80.8%,但差异无统计学意义（P＞0.05）;特异度为73.9%,明显高于HR-HPVDNA检测的61.9%,差异有统计学意义（P＜0.05）;根据ROC曲线可见HPVE6/E7mRNA检测诊断CINII+级的效能高于HR-HPVDNA检测。结论与HR-HPVDNA检测相比,HPVE6/E7mRNA检测用于ASC-US患者分流时是否需要进一步作阴道镜检查的判断更为确切。     

HPV致宫颈癌机制研究进展

人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是一类无包膜的具有嗜上皮特性的双链DNA病毒,由核酸及衣壳蛋白构成,其基因组可分为早期编码区（E区）、晚期编码区（L区）和长控制区（LCR）,研究表明高危型HPV的持续感染与宫颈癌的发生密切相关,当HPV病毒感染机体后,其基因组可随机整合到宿主细胞DNA中,随后沉默E2基因的表达,削弱E2蛋白对E6、E7基因的抑制,使E6、E7蛋白过表达,辅以E5蛋白的表达,促使感染细胞永生化甚至癌变。因此研究HPV的病毒结构及其致病机制对防治HPV感染及预防HPV相关恶性肿瘤,尤其是宫颈癌的发生、发展尤为重要。本文拟就HPV的病毒结构、致病机制研究进展进行综述。     

肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及其与HPV感染的关系

目的探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中的蛋白表达以及人乳头瘤病毒(HPV)16E6、E7和HPV18E6/E7感染对其表达的影响。方法采用免疫组化SP法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织中KAI1蛋白的表达,采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳法检测浸润性宫颈癌组织中HPV16E6、E7和HPV18E6/E7的DNA状况。结果宫颈浸润癌及原位癌组织中的KAI1蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义;HPV16E6、E7和HPV18E6/E7在浸润性宫颈癌中的阳性率分别为67.1%、54.3%和12.9%,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染与宫颈癌中的KAI1蛋白表达无相关性。结论肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中呈下调表达,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染不影响其表达。     

构建人乳头瘤病毒关键基因的原核重组载体

目的构建HPV16 E6／E7关键基因的原核载体pET-32（＋）-E6／E7并将其转到大肠杆菌BL-21（DE3）中诱导表达，最后获得E6／E7基因表达产物。方法用PCR方法从含有HPV16全基因序列的质粒中扩增E6／E7基因，将E6／E7基因连接到pET-32a（＋）质粒上，并转到大肠杆菌BL21（DE3）中。最后检测E6／E7基因。结果获得重组后的载体pET-32（＋）-E6／E7。结论成功构建表达了含有E6E7的原核重组载体，并在大肠杆菌中表达。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

HPVE6/E7mRNA和HPVDNA作为宫颈癌筛查分子标记物的比较研究

目的：探讨人乳头瘤病毒(HPV) DNA和HPV E6/E7 mRNA的两种检测标记物在宫颈癌筛查中的应用价值。方法选取2014年1月至2016年1月湛江廉江市人民医院妇产科收治的406例宫颈癌患者为研究对象,采用超薄液基细胞学检查(TCT)作为金标准。采用PCR法检测所有患者的HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA,并评价两种标记物对宫颈癌诊断的敏感性和特异性。结果406例患者中HPV DNA阳性率为47%(191/406),而HPV E6/E7 mRNA检测阳性率为31.2%(127/406),两者比较差异有统计学意义(P<0.05);两种检测标记物所得结果的符合率为85.5%;在CIN1标本中,HPV DNA检测的敏感度和特异度分别为88.6%、75.8%,与HPV E6/E7 mRNA检测的86.9%、73.4%比较差异均无统计学意义(P>0.05);在CIN2标本中,HPV E6/E7 mRNA检测的特异性为90.5%,高于HPV DNA的79.8%,差异有统计学意义(P<0.05),但是敏感性为83.9%,明显低于HPV DNA的93.7%,差异有统计学意义(P<0.05);在CIN3标本中,HPV mRNA检测的敏感度和特异性分别为98.7%、85.9%,均高于HPV DNA的89.1%、78.8%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论检测HPV mRNA在宫颈癌患者的诊断方面比检测HPV DNA更具有优势。     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。