微小RNA-149靶向调控FOXM1的表达及其对非小细胞肺癌细胞A549增殖和凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-149（miR-149）在非小细胞肺癌（NSCLC）中调控细胞增殖和凋亡的相关机制。方法 采用Lipofectamine脂质体法将miR-149模拟物（mimics）及其对照载体转染至A549细胞并分为miR-149转染组和miR-149对照组,同时以未转染的A549细胞作对照（未转染组）。采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测各组miR-149水平以评价转染的效果,采用MTT法和Annexin V-FITC／PI流式细胞术检测转染后各组细胞增殖和凋亡情况。QPCR检测各组FOXM1基因的表达情况,Western blotting检测FOXM1蛋白的表达情况。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-149与FOXM1之间靶向作用关系。结果 QPCR检测转染48 h后miR-149转染组的miR-149相对表达量为2.493±0.380,高于未转染组的1.077±0.321和miR-149对照组的1.283±0.273,差异均有统计学意义（P＜0.05）; miR-149 转染组转染24、48、72 h的增殖抑制率分别为（16.51±2.49）％、（22.90±3.65）％和（31.43±5.27）％,均高于其余两组,差异均有统计学意义（P＜0.05）; miR-149 转染组转染48 h的凋亡率为（29.17±4.48）％,高于未转染组的（5.34±1.72）％和miR 149对照组的（7.62±1.59）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;miR-149 转染组转染48 h后的FOXM1 mRNA和蛋白水平分别为0.624±0.102和0.349±0.065,均低于未转染组的0.976±0.076和0.654±0.074及miR-149对照组的0.920±0.117和0.718±0.077,差异均有统计学意义（P＜0.05）;双荧光素酶报告基因实验表明 miR-149可显著抑制野生型 FOXM1-3’UTR的荧光素酶活性,而对突变型质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论 miR-149可能是通过靶向FOXM1调控肺癌A549细胞的增殖和凋亡,可作为NSCLC分子治疗的有效靶点。     

miR-138靶向调控SIRT1表达及其对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-138（miRNA-138）在膀胱癌细胞中的表达情况,并研究其对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能的靶基因。方法 采用实时定量PCR（QPCR）法检测膀胱癌细胞T24和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中miR-138的表达水平。将T24细胞分为3组：未转染组、miR-138对照组（转染阴性对照片段）和miR-138转染组（转染miR-138 mimics）。采用MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Western blotting检测细胞中沉默信息调节因子1（SIRT1）蛋白的表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-138与SIRT1间的靶向关系。结果 膀胱癌T24细胞中miR-138的表达量为0.57±0.19,低于SV-HUC-1细胞的1.00±0.26（P＜0.05）。miR-138转染组的miR-138表达量为2.59±0.67,高于未转染组的1.00±0.36和miR-138对照组的1.08±0.49（P＜0.05）。miR-138转染组T24细胞的增殖率显著低于未转染组和miR-138对照组（P＜0.05）。 转染48 h后,miR-138转染组的细胞凋亡率为（29.8±1.9）％,高于未转染组的（5.8±1.2）％和miR-138对照组的（7.7±0.9）％（P＜0.05）。miR-138转染组SIRT1的相对表达量为0.59±0.22,低于未转染组的1.00±0.35和miR-138对照组的1.20±0.42（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验证明SIRT1是miR-138的直接作用靶点。结论 miR-138在膀胱癌细胞中低表达,可能通过靶向SIRT1调控膀胱癌细胞的增殖和凋亡。     

婆罗双树样基因2干扰对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究婆罗双树样基因2（sal-like gene 2,SALL2）干扰对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法：设计针对SALL2基因的3条小干扰RNA（siRNA-1、2、3）,并设载体组及未转染对照组,使用脂质体转染HeLa细胞。采用逆转录RT-PCR和Western blot检测转染后HeLa细胞中SALL2 mRNA和蛋白的表达以筛选沉默效果最好的siRNA片段。将最适siRNA片段转染HeLa细胞后,采用CCK-8检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞周期和凋亡率。结果：对照组HeLa细胞高表达SALL2。载体组和转染siRNA-3组SALL2的mRNA和蛋白表达与对照组相比,差异均无统计学意义（P均>0.05）,而siRNA-1和siRNA-2转染48 h后,HeLa细胞SALL2的mRNA和蛋白表达均降低,差异均有统计学意义（P均<0.05）,其中siRNA-1的沉默效率更好,故后续选择siRNA-1作为干扰组。与对照组相比,转染siRNA-1 48和72 h后细胞的增殖率均升高,差异均有统计学意义（P<0.05）;转染48 h后siRNA-1组处于G0/G1期的细胞比例减少,凋亡率明显降低（P均<0.05）。结论：SALL2基因干扰可明显提高HeLa细胞的增殖率,并降低其凋亡率。提示SALL2基因对宫颈癌HeLa细胞的增殖有抑制作用。     

微小RNA-92a靶向PTEN／Akt信号通路对鼻咽癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-92a（miR-92a）通过靶向PTEN／Akt信号通路对鼻咽癌HONE1细胞增殖与凋亡的调控作用。方法 采用Lipofectamine脂质体法向HONE1细胞转染miR-92a抑制剂（miR-92a组）和阴性对照（NC组）,设不行转染的HONE1细胞为对照组。转染成功后用实时荧光定量PCR（QPCR）检测miR-92a在不同细胞组中的表达情况;MTT法检测各组细胞的增殖率;流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率;Western blotting实验检测PTEN／Akt信号通路中PTEN和p-Akt蛋白的表达量。结果 转染48 h miR-92a组与对照组和NC组相比,miR-92a的表达量明显降低（P＜0.05）,而对照组和NC组的差异无统计学意义（P＞0.05）。miR-92a组转染24、48、72、96 h的细胞增殖率分别为（84.51±2.74）％、（77.21±3.55）％、（62.07±3.57）％和（49.25±4.15）％,其中72、96 h的细胞增殖率低于对照组和NC组（P＜0.05）;miR-92a组转染48 h的细胞凋亡率为（46.12±1.79）％,高于对照组的（6.99±0.72）％和NC组的（8.42±0.81）％,差异有统计学意义（P＜0.05）;miR-92a组转染48 h PTEN和p-Akt蛋白的表达水平分别为0.61±0.12和0.37±0.09,对照组分别为0.41±0.11和0.73±0.14,NC组分别为0.39±0.08和0. 68±0.07,与对照组和NC相比,miR-92a组细胞的PTEN表达升高,p-Akt表达降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 通过抑制miR-92a的表达来抑制鼻咽癌细胞增殖且促进其凋亡,可能是通过负调控PTEN／Akt信号通路来实现的。     

微小RNA-148a-3p靶向调控MRAS表达及其对胃癌HGC-27细胞侵袭迁移的影响

目的 探讨微小RNA-148a-3p（miR-148a-3p）对胃癌HGC-27细胞侵袭迁移及肌 RAS癌基因同源基因（MRAS）表达的影响。方法 将冻存的胃癌细胞株HGC-27复苏并常规培养至对数生长期,将miR-148a-3p模拟物及其阴性对照（miR-NC）分别转染HGC-27细胞（miR-148a-3p转染组和miR-NC组）,以未行转染的HGC-27细胞为空白对照（未转染组）,采用实时定量PCR（QPCR）检测各组转染48 h后的miR-148a-3p水平,划痕实验和Transwell侵袭实验分别比较各组HGC-27细胞转染48 h后的迁移相对距离和穿膜细胞数目以评价迁移和侵袭情况,QPCR和Western blotting分别检测各组转染48 h后MRAS的mRNA和蛋白水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与MRAS之间的靶向调节作用。结果 QPCR检测显示转染48 h后miR-148a-3p转染组的miR-148a-3p水平为2.612±0.213,高于未转染组的0.954±0.098和miR-NC组的0.983±0.196,差异有统计学意义（P<0.05）;划痕实验结果显示,miR-148a-3p转染组的相对迁移距离为0.615±0.019,低于未转染组的1.021±0.019和miR-NC组的0.948±0.022,Transwell侵袭实验显示miR-148a-3p转染组的穿膜细胞数目为（83±17）个,少于未转染组的（124±17）个和miR-NC组的（136±26）个,差异有统计学意义（P<0.05）。QPCR和Western blotting结果显示,miR-148a-3p转染组MRAS mRNA和蛋白水平分别为0.614±0.057和0.553±0.049,均低于未转染组的1.106±0.024和0.824±0.091及miR-NC组的1.095±0.031和0.784±0.121,差异有统计学意义 （P<0.05）。miR-148a-3p显著降低野生型MRAS-3′非翻译区质粒转染细胞的荧光素酶活性,但对突变型质粒转染细胞的荧光素酶活性无明显影响。结论 MiR-148a-3p可能通过靶向调控MRAS来抑制胃癌HGC-27细胞的侵袭和迁移。     

miR-125a表达对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响分析

目的 探讨microRNA-125a（miR-125a）对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测人肝癌HepG2细胞及人正常肝细胞7702中的miR-125a水平,同时采用真核表达载体pGenesil-1质粒制备过表达miR-125a的重组质粒pGenesil-miR-125a及表达随机序列的阴性对照pGenesil-NC,根据实验设计将HepG2细胞分为3组：空白对照组、阴性对照组和过表达组,其中空白对照组未进行转染,阴性对照组和过表达组分别成功转染pGenesil-NC和pGenesil-miR-125a,待3组转染24、48、72及96 h后采用qPCR法检测各组的miR-125a水平,噻唑盐比色法检测各组转染24、48、72及96 h的细胞增殖率,分别采用Hoechst染色和流式细胞术检测转染24、48 h后的凋亡指数和caspase-3活化率来评价凋亡情况,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组转染48 h后的细胞周期,同时采用免疫印迹法检测转染48 h后对凋亡相关基因（Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3）表达的影响。结果 HepG2细胞中miR-125a水平为（0.24±0.06）,低于正常肝细胞7702细胞（P<0.05）;与阴性表达组相比,过表达组转染24、48、72及96 h的miR-125a水平升高,增殖率降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与其余两组相比,过表达组转染后的凋亡指数、caspase-3活化率、G0/G1期细胞比例及Bax和Cleaved caspase-3水平均升高,S和G2/M期细胞比例及Bcl-2水平均降低,以上差异有统计学意义（P<0.05）。     

微小RNA-199b-3p靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-199b-3p（miR-199b-3p）靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖及凋亡的影响。方法 采用Lipofectamine脂质体法将miR-199b-3p抑制剂及阴性对照（NC）转染至SW620细胞并分为抑制剂组和NC组,同时以未转染的SW620细胞作对照。采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测3组miR-199b-3p的表达以评价转染效果,MTT法和Annexin Ⅴ-FITC／PI流式细胞术检测转染后的增殖活性及凋亡率,QPCR和Western blotting检测各组凋亡相关基因（Bax和caspase-3）及SOX6的mRNA和蛋白水平,构建含有野生型及突变型SOX6-3’UTR的荧光报告基因质粒并采用双荧光素酶报告实验验证miR-199b-3p对SOX6的靶向调控作用。结果 QPCR检测显示,转染48 h后抑制剂组的miR-199b-3p的表达水平为0.526±0.034,低于未转染组的1.009±0.064和NC组的0.960±0.057,差异有统计学意义（P＜0.05）;与其余两组相比,抑制剂组转染24、48、72 h后的SW620细胞的增殖活性均降低（P＜0.05）;抑制剂组的凋亡率为（37.533±1.459）％,高于未转染组的（6.101±0.663）％和NC组的（8.753±1.061）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制剂组SW620细胞的SOX6、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均高于未转染组和NC组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验表明 miR-199b-3p可显著抑制野生型 SOX6-3’UTR的荧光荧光素酶活性,而对突变型质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论miR-199b-3p可靶向调控SOX6的表达,且下调miR-199b-3p表达可抑制SW620细胞的增殖并诱导凋亡,为结肠癌的治疗提供潜在的分子治疗靶点。     

siRNA靶向抑制RPL6基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制核糖体蛋白L6（RPL6）基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响。方法 优化siRNA转染条件,将2条靶向抑制RPL6基因的siRNA载体片段（siRPL6-1、siRPL6-2）分别高效转染人宫颈癌HeLa细胞（抑制组）,同时设转染无义序列（siControl）的空转染组及不进行任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测RPL6表达水平以筛选抑制率高的siRPL6载体用于后续实验。噻唑蓝比色（MTT）法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡和细胞周期情况, Western blotting检测各组转染96 h后的cyclin A、CDK2和p21CIP1表达情况。结果 抑制组的RPL6 mRNA水平均低于空转染组和对照组（P＜0.05）,siRPL6-2片段的干扰效率高于siRPL6-1,故后续实验选择siRPL6-2片段;与其余两组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及caspase-3活化率均升高,且G0／G1期细胞比例升高,但S期和G2／M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制组转染后的p21CIP1水平升高,cyclin A和CDK2 水平降低,与空转染组和对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。空转染组和对照组以上指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过siRNA抑制RPL6基因表达可抑制增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对宫颈癌防治有一定价值。     

微小RNA 375通过靶向PAX6对宫颈癌HeLa细胞顺铂敏感性的影响#br# #br#

目的探讨微小RNA 375（miR 375）和人类配对盒基因6（PAX6）在宫颈癌顺铂耐药株HeLa cisR中的表达及耐药逆转作用并初步探讨可能机制。 方法采用实时定量PCR（QPCR）检测28例正常宫颈组织、30例宫颈癌组织（14例顺铂敏感和16例顺铂不敏感）和不同顺铂敏感性细胞HeLa、HeLa cisR中miR 375、PAX6 mRNA水平,采用脂质体法向HeLa和HeLa cisR细胞转染含miR 375模拟物（mimics）的寡核苷酸探针（过表达组）和阴性对照NC（阴性对照组）,以不行任何转染的为空白对照组。采用QPCR检测转染后HeLa和 HeLa cisR细胞中miR 375和PAX6 mRNA水平,采用MTT法检测不同浓度顺铂（1、3、10、30、100 μmol／L）处理后的增殖情况并计算半数抑制浓度（IC50）以评价顺铂敏感性,Western blotting检测PAX6蛋白水平,双荧光素酶报告基因试验评价miR 375对PAX6的靶向调控作用。 结果宫颈癌组织中的miR 375水平低于正常宫颈组织（0714±0341 vs. 1006±0299）,PAX6 mRNA水平高于正常宫颈组织（1855±0928 vs. 1011±0257）,miR 375水平与PAX6 mRNA水平呈负相关（r=-0416, P＜005）。与化疗敏感组相比,化疗不敏感组的miR 375水平降低,而PAX6 mRNA水平升高（P＜005）。HeLa cisR细胞的miR 375水平低于HeLa细胞（0365±0098 vs. 1032±0135）,而PAX6 mRNA水平高于HeLa 细胞（3154±0957 vs. 1067±0168）,差异均有统计学意义（P＜005）。与其余两组相比,过表达组转染后的miR 375水平升高,PAX6蛋白和mRNA水平均降低,差异有统计学意义（P＜005）。miR 375过表达可降低顺铂IC50（P＜005）,先转染 miR 375 mimics 24 h后再转染过表达PAX6的pCMV PAX6质粒后细胞的IC50与未转染细胞的差异无统计学意义（P＞005）。 结论miR 375通过靶向PAX6参与了宫颈癌细胞的顺铂耐药,miR 375有望成为逆转宫颈癌顺铂耐药的靶点。     

宫颈癌组织中微小RNA 155水平及其对细胞增殖和侵袭的影响#br# #br#

目的探讨微小RNA 155（miR 155）在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响。 方法收集本院2014年5月至2016年12月经手术切除的宫颈癌组织76例、正常宫颈组织63例及宫颈上皮内瘤样病变（CIN）组织84例（CINⅠ级22例、CIN Ⅱ级29例和CIN Ⅲ级33例）,采用实时定量PCR（QPCR）检测以上组织中的miR 155水平,分析miR 155水平与宫颈癌临床病理特征（年龄、FIGO分期、肿瘤大小、组织学分级、病理类型、血管侵犯和淋巴结转移）的关系;向宫颈癌HeLa细胞分别转染miR 155抑制物（转染组）和阴性对照（对照组）,采用QPCR检测转染48 h后各组的miR 155水平,分别采用MTT法和Transwell侵袭实验检测增殖率和穿膜细胞数目。 结果QPCR检测发现宫颈癌组织中的miR 155水平为4270±1901,高于正常宫颈组织和CIN组织（P＜005）;miR 155水平与宫颈癌患者的年龄、组织学分级和病理类型均无关（P＞005）,但与FIGO分期、肿瘤大小、血管侵犯和淋巴结转移有关（P＜005）。转染miR 155抑制物48 h后,转染组HeLa细胞的miR 155水平为0265±0034,低于对照组的1027±0158,差异有统计学意义（P＜005）;与对照组相比,转染组的增殖率和穿膜细胞数均降低,差异有统计学意义（P＜005）。 结论miR 155在宫颈癌组织中呈高表达,且与临床分期、血管侵犯和淋巴结转移有关,参与宫颈癌的发生发展。降低miR 155水平可抑制增殖和侵袭过程,在宫颈癌的防治中有一定价值。     

miR-224对宫颈癌SiHa和HeLa细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的:探讨miR-224对宫颈癌SiHa和HeLa细胞增殖、凋亡及迁移的影响。方法:对宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中miR-224进行过表达或沉默,采用qRT-PCR法检测miR-224的转染效果,转染成功后采用CCK-8法、FCM检验、Transwell试验检测各组细胞增殖、凋亡及迁移情况。结果:与正常293T细胞相比,宫颈癌细胞SiHa、HeLa中miR-224表达量均升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;转染成功后CCK-8法检测SiHa和HeLa细胞增殖情况,与阴性对照组和空白组比较,miR-224 mimic组细胞增殖能力增强,miR-224 inhibitor组细胞增殖能力减弱,差异具有统计学意义（P<0.01）;流式细胞仪检测SiHa和HeLa细胞凋亡情况,miR-224 mimic组细胞凋亡百分比明显低于阴性对照组（P<0.01）,miR-224 inhibitor组细胞凋亡百分比明显高于阴性对照组（P<0.01）;划痕试验检测SiHa和HeLa细胞迁移能力,48 h时miR-224 mimic组细胞愈合速率明显较阴性对照组和空白组快,差异有统计学意义（P<0.01）,miR-224 inhibitor组细胞愈合速率明显较阴性对照组慢,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:宫颈癌细胞中miR-224过表达可促进细胞增殖和迁移并抑制凋亡,沉默miR-224可抑制细胞增殖和迁移并促进凋亡。     

微小RNA-3651对结肠癌细胞增殖凋亡及PTEN表达的影响

目的 探讨微小RNA-3651（miR-3651）对结肠癌细胞SW620增殖凋亡及10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）表达的影响。方法 采用Lipofectamine® 2000脂质体法将miR-3651抑制剂（Inhibitor组）及阴性对照片段（NC组）分别转染至SW620细胞,转染24 h后采用实时定量PCR（QPCR）法检测两组细胞的miR-3651水平,采用MTT法检测转染0、12、24、48 h后两组的吸光度以评价增殖活力情况,采用流式细胞术和Western blotting检测两组转染后的凋亡率及凋亡相关蛋白（PTEN和caspase-3）的表达情况;双荧光素酶报告实验检测荧光素酶活性以验证miR-3651对PTEN的靶向调控作用。结果 转染24 h后Inhibitor组的miR-3651水平为0.482±0.159,低于NC组的1.015±0.241,差异有统计学意义（P<0.05）。与NC组相比,Inhibitor组SW620细胞的增殖活力明显减弱（P<0.01）。Inhibitor组SW620细胞的凋亡率为（20.46±3.72）%,明显高于NC组的（4.73±0.85）%,差异有统计学意义（P<0.01）。Inhibitor组的PTEN和caspase-3水平分别为1.457±0.369和1.862±0.247,高于NC组的0.547±0.127和0.665±0.154,差异有统计学意义（P<0.05）。miR-3651显著抑制野生型PTEN-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性,而对突变型PTEN-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性无影响。 结论 MiR-3651可以抑制结肠癌细胞SW620的增殖并诱导其凋亡,可能与其靶向调控PTEN表达有关,可作为结肠癌潜在的分子治疗靶点。     

miR-143对肾癌GRC-1细胞增殖与凋亡及其靶点HIF-1α的影响

目的 探讨miR-143对肾癌GRC-1细胞增殖凋亡及其靶点缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的影响。方法 转染miR-143的模拟物于肾癌细胞株GRC-1细胞,采用实时定量PCR（qPCR）法检测转染的效果,根据实验将GRC-1细胞分为3组：未转染组、miR-143对照组和miR-143转染组,采用MTT法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;qPCR及Western blotting检测各组细胞的HIF-1α mRNA和蛋白水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-143与HIF-1α基因间的靶向关系。结果 miR-143转染组的miR-143水平高于未转染组和miR-143对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;与其余两组比较,miR-143转染组的增殖率降低而凋亡率升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;瞬时过表达miR-143可降低GRC-1细胞的HIF-1α mRNA和蛋白水平（P＜0.01）,双荧光素酶报告基因实验证明HIF-1α是miR-143的直接作用靶点。结论 miR-143可以调控肾癌GRC-1细胞的增殖凋亡,而HIF-1α是miR-143的直接靶点。     

沉默NDRG1基因与三氧化二砷对宫颈癌抑制作用的研究

目的 观察沉默细胞分化相关基因NDRG1在三氧化二砷（As2O3）抑制宫颈癌HeLa细胞生长过程中的作用,探讨As2O3对宫颈癌的抑制作用与NDRG1基因的相关性。方法 构建NDRG1基因的miRNA干扰载体,稳定转染人宫颈癌HeLa细胞,半定量RT-PCR检测转染后HeLa细胞中NDRG1 mRNA的表达;不同浓度As2O3分别作用于转染及未转染HeLa细胞,MTT比色法检测细胞的生长和凋亡情况。结果 半定量RT PCR检测表明,构建NDRG1基因的miRNA干扰载体成功地转染HeLa细胞,并能够有效抑制NDRG1 mRNA表达。As2O3能够抑制转染及未转染HeLa细胞的生长,其抑制作用均呈浓度依赖性（P＜0.05）,且随时间延长,抑制作用亦增强。12.0μmol／L As2O3 作用HeLa细胞72h的细胞抑制率最大,未转染HeLa细胞组为（49.9±0.6）％,转染HeLa细胞组为（43.1±0.8）％;任一浓度As2O3对转染HeLa细胞的抑制作用较未转染HeLa细胞明显减弱（P＜0.05）。结论 沉默NDRG1基因后,As2O3对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用减弱,表明As2O3对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用与NDRG1基因相关。     

miR-147靶向MDM2调控卵巢癌细胞Skov3增殖与凋亡的机制研究

目的 探讨微小RNA-147（miR-147）靶向调控鼠双微粒体2蛋白（MDM2）的表达及其对卵巢癌细胞株Skov3增殖与凋亡的影响。方法 采用Lipo2000脂质体法将miR-147 模拟物（mimics）及阴性对照（NC）转染至Skov3细胞并分为miR-147 mimics组和NC组,采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测转染48 h后Skov3细胞的miR-147水平以评价转染效果,分别采用MTT法及流式细胞术检测两组转染后的增殖及细胞凋亡情况,Western blotting检测两组MDM2、p53和caspase-3表达水平,采用双荧光素酶报告实验验证miR-147与靶标MDM2之间的靶向关系及结合位点。结果 QPCR检测显示,miR-147 mimics组miR-147的表达水平高于NC组,差异有统计学意义（P<0.05）,提示在Skov3细胞中过表达miR-147成功。与NC组相比,miR-147 mimics组的增殖率和MDM2水平均降低,但凋亡率及p53和caspase-3水平均升高,差异有统计学意义（P<0.05）;双荧光素酶报告实验检测发现miR-147可显著抑制野生型MDM2-3’端非翻译区（UTR）质粒转染细胞的荧光素酶活性,而对突变型MDM2-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论 miR-147可靶向MDM2的表达,且过表达miR-147表达可抑制Skov3细胞的增殖并诱导凋亡,在卵巢癌防治上有一定参考价值。     

miR-198靶向MAPK1调控宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和侵袭

目的 探究miR-198对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及其机制。方法 用miR-198 mimic转染HeLa细胞,qRT-PCR检测miR-198和丝裂原活化蛋白激酶1 （Mitogen-activated protein kinase1, MAPK1）的mRNA水平;荧光素酶实验检测miR-198和MAPK1的靶向关系;用pcDNA3.0-MAPK1（pc-MAPK1）和miR-198 mimic转染细胞,CCK-8检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell法检测细胞侵袭能力,Western blot检测蛋白的表达。结果 miR-198 mimic转染细胞后,miR-198表达水平明显升高,MAPK1 mRNA表达水平明显降低;荧光素酶报告实验表明miR-198序列上存在MAPK1结合位点;miR-198过表达能显著降低宫颈癌细胞增殖倍数、诱导细胞凋亡,同时还能明显降低HeLa细胞侵袭能力;此外,miR-198 mimic能显著抑制MAPK1下游基因核糖体S6激酶2（Ribosomal S6 kinase 2, RSK2）、c-Myc和c-fos的蛋白表达;pc-MAPK1能明显减弱miR-198 mimic对HeLa细胞增殖、凋亡、侵袭及对MAPK1下游蛋白表达的调控作用。结论 miR-198过表达能通过靶向MAPK1抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力并诱导细胞凋亡。     

shRNA靶向沉默P2X7R表达对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及PI3K／Akt和Wnt／β-catenin通路的影响

目的 探讨靶向P2X7受体（P2X7R）的小发夹RNA（shRNA）对人鼻咽癌HONE1细胞增殖、凋亡及信号通路的影响。方法 根据预实验结果优化shRNA转染条件,将2条靶向抑制P2X7R基因的shRNA载体片段（shRNA-1、shRNA-2）分别高效转染HONE1细胞,同时设转染无义序列（Blank）的空转染组及不进行任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测P2X7R表达水平以筛选抑制率高的转染载体用于后续试验。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡率,QPCR法检测各组凋亡相关基因的mRNA水平,Western blotting检测各组转染96 h后磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）通路和Wnt／β-连接素（β-catenin）通路中的蛋白变化。结果 转染组的P2X7R mRNA水平均低于空转染组和对照组（P＜0.05）,且选择干扰效率高的shRNA-1载体进行功能学研究;与空转染组和对照组比较,shRNA-1转染组的HONE1细胞增殖抑制率、凋亡率及促凋亡基因Bid、Bax的mRNA水平均升高,而抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1的mRNA水平均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;与对照组比较,shRNA-1转染组处理后PI3K／Akt通路中PTEN蛋白水平均升高,而p-Akt水平均降低（P＜0.05）,Wnt／β-catenin通路中p-β-catenin、Cyclin D1和C-myc水平均降低（P＜0.05）。结论 通过shRNA抑制P2X7R基因表达可抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导凋亡,可能与抑制PI3K／Akt、Wnt／β-catenin通路有关,对鼻咽癌的防治有一定价值。     

siRNA靶向抑制CDCA5基因表达对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制细胞分裂周期相关蛋白5（CDCA5）基因表达对人肝癌HepG2细胞株增殖及凋亡的影响。方法 优化siRNA转染条件,将3条靶向抑制CDCA5基因的siRNA载体片段（序列1、2和3）分别高效转染人肝癌HepG2细胞（A、B和C组）,并设阴性对照组（NC组）及空白组。免疫印迹法检测转染72h各组CDCA5蛋白的表达水平。CCK-8法检测转染24、48、72、96、120h各组细胞的增殖能力,Annexin V-FITC／PI 双标记流式细胞术检测各组转染48h的凋亡情况。结果 A、B和C组的CDCA5蛋白水平均低于NC组和空白组（P＜0.05）,其中B组的表达率最低,抑制率最高,达89.3％,故选择序列2进行后续实验。自转染48h起,B组的相对增殖率均低于NC组和空白组（P＜0.05）;B组转染72h的相对增殖率为（66.58±2.58）％,均低于其他观察时间点（P＜0.05）。B组转染48h的早期和晚期凋亡率分别为（17.43±2.31）％和（22.37±2.21）％,均高于NC组和空白组（P＜0.05）。 结论 通过siRNA能够降低HepG2细胞的CDCA5表达水平,有效抑制HepG2细胞的增殖并促进其凋亡。     

微小RNA 216影响胰腺癌细胞增殖凋亡及#br# 对吉西他滨耐药的实验研究#br#

目的 探讨微小RNA 216（miR-216）是否影响胰腺癌细胞增殖凋亡及对吉西他滨耐药。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测胰腺癌吉西他滨耐药细胞株BxPC-3和非耐药株CFPAC-1中的miR-216表达水平;采用Lipofectamine 2000脂质体法将miR 216模拟物（mimics组）及抑制剂（inhibitor组）分别转染BxPC 3细胞,以进行脂质体转染的BxPC 3细胞为对照组,采用QPCR检测转染48 h后各组miR 216表达水平,CCK-8法检测转染24、48、72 h后各组吸光值以评价增殖率,采用AnnexinⅤ FITC／PI双染流式细胞术检测各组转染48 h后的细胞凋亡率,CCK 8法检测各组对吉西他滨的半数抑制浓度（IC50）。利用生物信息学数据库miRBase预测miR 216的靶基因,利用cytoscape 351及其插件CluGO将其进行Gene Oncology（GO）功能注释。 结果BxPC 3细胞中miR 216表达量为3.010±0.901,高于CFPAC 1细胞的1.049±0.074（P＜0.05）;对照组、mimics组和inhibitor组的miR-216表达量依次为1.130±0.145、4.843±0.782和0256±0.145,差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较,mimics组的细胞增殖水平升高而凋亡率降低,inhibitor组的增殖水平降低而凋亡率升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组、mimics组和inhibitor组的IC50值为（2.134±0.591）μg／ml、（4.518±0.862）μg／ml和（0.481±0.073）μg／ml,BxPC-3细胞转染inhibitor 后对吉西他滨的耐药性降低,转染mimics后对吉西他滨的耐药性增强（P＜0.05）。miR 216的预测靶基因共有138个,GO功能主要富集于与肿瘤发生发展相关的细胞增殖、凋亡与侵袭迁移过程。结论 miR-216在胰腺癌耐药细胞株中表达上调且可以诱导胰腺癌细胞增殖,暗示其可以发挥类似促癌基因的作用且参与吉西他滨耐药过程,有可能成为胰腺癌早期诊断和新型生物治疗的靶点。     

miRNA-223对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨microRNA-223（miR-223）在非小细胞肺癌（NSCLC）A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DDP耐药肺腺癌细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549中miR-223的水平,将A549／DDP细胞分为3组：对照组、空转染组（转染无关序列）和抑制组（转染miR-223 inhibitor）,于转染24、48、72及96 h后分别采用qRT-PCR和CCK-8法检测转染效果及细胞增殖情况,CCK-8法评价转染后A549/DDP细胞对DDP的药物敏感性变化,采用流式细胞术检测转染48 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,Western blotting检测转染48 h后耐药基因蛋白P 糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及肺耐药相关蛋白（LRP）的表达。结果 A549／DDP细胞中的miR-223水平较高,为A549细胞的（7.14±0.26）倍（P＜0.05）;抑制组转染后的miR-223水平降低,转染96 h后的miR-223水平分别降至对照组的（67.15±2.84）％和空转染组的（65.80±3.47）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及G0／G1期细胞比例均升高,而S和G2／M期细胞比例及3种耐药基因蛋白水平均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。DDP对抑制组细胞的半数抑制浓度（IC50）值为（15.67±1.30） μg／ml,低于对照组的（33.71±2.61） μg／ml（P＜0.05）。结论 miR-223可增加A549／DDP细胞对DDP的耐药性,可能与耐药基因蛋白表达上调有关;降低miR-223水平可抑制A549／DDP细胞增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞,并下调耐药蛋白的表达,从而增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性。