HPV16E6基因树突状细胞疫苗的体内抗宫颈癌研究

目的：研究HPV16E6基因人脐带血CD34＋造血干细胞来源的树突状细胞（DC）疫苗在SCID小鼠体内对人宫颈癌细胞的免疫治疗和保护效应。方法：从人脐带血分离单个核细胞中提取CD34＋干细胞,并诱导其向DC分化;采用阳离子脂质体DMRIE-C将HPV16E6基因介导进入DC,制备其疫苗。在SCID小鼠体内观察DC疫苗的体内致瘤情况及经其致敏的淋巴细胞对人宫颈癌细胞的免疫治疗和保护作用。结果：人脐带血来源CD34＋干细胞能诱导出成熟及有功能的DC;体内抗肿瘤研究,经DC疫苗致敏的T淋巴细胞治疗荷瘤小鼠,肿瘤生长速度、瘤体积和重量明显小于未致敏T淋巴细胞治疗的荷瘤小鼠（P〈0.01）。用经DC疫苗致敏的人外周血T淋巴细胞预免疫SCID小鼠,受宫颈癌细胞攻击后,与未致敏的T淋巴细胞预免疫组比,肿瘤潜伏期延长（P〈0.01）,体积减小,重量减轻（P〈0.01）。结论：HPV16E6基因人脐带血CD34＋造血干细胞来源的DC疫苗在一定程度上能抑制宫颈癌细胞生长,对其攻击有一定抵御作用,对机体具有抗肿瘤免疫治疗和保护作用。     

人乳头瘤病毒16 E6转染冻融人外周血树突状细胞疫苗体外抗宫颈癌作用

目的：制备来源于人外周血并转染人乳头瘤病毒（HPV）16 E6基因的冻融树突状细胞（DC）疫苗，检测其细胞形态。转染情况及体外诱导的免疫效应。方法：细胞因子扩增人外周血DC，低温-70℃冻存；Lipofectamine转染HPV16 E6制备DC疫苗。动态形态学观察，免疫细胞化学检测E6分子表达，体外诱导并测定细胞毒性T淋巴细胞活性。结果：转染E6基因的人外周血冻融DC呈形态迥异的多突起状，免疫细胞化学染色显示E6蛋白表达阳性；MTT法检测人宫颈癌细胞株（CaSKIi细胞）的杀伤活性明显高于对照组（P〈0．01），与新鲜DC疫苗比无统计学意义（P〉0．05）。结论：转染历基因的人外周血冻融DC疫苗保持了功能成熟DC的形态特征，且内源性表达E6蛋白，并在体外诱导出高效特异性的抗宫颈癌免疫反应，为宫颈癌的主动特异性免疫治疗提供了理想的疫苗和实验依据。     

带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用

目的：探索带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用。方法：体外诱导培养C57BL/6小鼠骨髓的未成熟DC（immature DC,imDC）,将已经成功构建的携带人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）-16 E6/E7基因的重组腺病毒感染imDC,Western blot检测E7蛋白的表达;构建裸鼠的人宫颈癌CaSki细胞移植瘤模型,应用DC疫苗诱导的BALB/c小鼠脾脏的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）处理后,观察裸鼠肿瘤体积变化,肿瘤长出第28天后处死裸鼠,小心剥下肿瘤组织,石蜡包埋,HE染色观察各组肿瘤的细胞形态,免疫组织化学技术法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。结果：成功培养出DC并制备出DC疫苗;第28天各组裸鼠肿瘤体积pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组与pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组、CaSki组相比较,pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组裸鼠肿瘤体积最小（P<0.05）;免疫组化检测肿瘤组织中Bax蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最高,而CaSki组表达最低;免疫组化检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最低,而CaSki组表达最高。结论：带有HPV-16 E6/E7DC疫苗能够诱导CTL抑制裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的生长。     

脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗抗肿瘤免疫预防实验研究

目的用杂交瘤技术制备脐血树突状细胞（DC）和食管癌细胞的融合疫苗,观察其在体内诱导抗肿瘤免疫反应。方法分离脐血CD34^＋干细胞并诱导扩增为成熟DC,并与EC109细胞经聚乙二醇（PEG）法融合;免疫磁珠法筛选EC109-DC;重建SCID小鼠免疫功能;体内保护抗肿瘤免疫保护实验。结果①融合疫苗可体外生长,形状以不规则形为主,核仁大、细胞边缘可见突起;②重建SCID小鼠免疫功能实验中PBL组均检测到人IgG的存在,与PBS组相比较有显著意义（P〈0．05）;③在免疫保护中,经融合瘤苗免疫的小鼠,肿瘤潜伏期较对照组明显延长（P〈0．05）,肿瘤大小和肿瘤重量均明显小于对照组（P〈0．05）。结论①重建SCID小鼠免疫功能实验中PBL组均检测到人IgG的存在,提示免疫重建成功;②融合瘤苗对EC109细胞的攻击有明显的抵抗作用。     

人肝癌细胞在免疫重建前后SCID小鼠中的生长特点

目的 探讨SCID小鼠免疫重建及免疫对人肝癌细胞成瘤的影响。方法 体外培养人肝癌细胞系，接种到SCID小鼠和用BALB／c,CBA/N小鼠外周血淋巴细胞重建的SCID（B－PBL－SCID和C－PBL－SCID）小鼠皮下；监测成瘤状态，测定鼠脾细胞毒杀伤力和免疫重建的免疫球蛋白量，作血清与靶细胞凝集实验。结果 免疫重建体现了所用小鼠免疫对肿瘤的排斥特点，免疫重建成功；SCID和C－PBL－SCID小鼠100％成瘤（两瘤体相比P＜0．01），B－PBL－SCID出现瘤体后逐渐消失；B－PBL－SCID和C－PBL－SCID脾细胞对靶细胞有一定的杀伤力，B－PBL－SCID的血清能与靶细胞产生凝集反应。结论 SCID是建立肿瘤模型和肿瘤免疫研究的良好动物；肝癌细胞在小鼠体内的成瘤率与T，B细胞免疫有关。     

树突状细胞/结肠转移癌细胞融合疫苗治疗转移性结肠癌的动物实验研究

目的通过建立人免疫重建荷人结肠癌皮下种植瘤严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠模型,研究DC/结肠癌融合疫苗对人转移性结肠癌的发展及预后的影响。方法应用腹腔注射法对严重联合免疫缺陷SCID小鼠注射人外周血淋巴细胞（hu_PBL）免疫重建后,皮下注射法建立荷人结肠癌皮下种植瘤模型。应用聚乙二醇（PEG）制备DC/SW620融合疫苗。将DC/SW620融合疫苗于左、右后足底、尾根部皮下三点注射在人免疫重建的SCID小鼠结肠癌皮下移植瘤模型。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中人IgG含量;通过直接测量法观察人结肠癌皮下种植瘤成瘤性和小鼠生存期。结果融合疫苗治疗组的皮下肿瘤体积生长速度慢于其他各对照组;融合疫苗治疗组生存期为（109.00±17.17）d,明显长于单纯制模组（55.67±12.03,P〈0.001）、免疫重建组（81.83±9.06,P〈0.001）、肿瘤细胞疫苗组（87.33±12.85,P〈0.01）。结论 DC/SW620融合疫苗可抑制肿瘤生长,改善预后,DC/SW620融合疫苗比肿瘤细胞冻融物免疫治疗效果更佳。     

HPV16 E6 DNA疫苗诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫

目的：探讨HPV16 E6 DNA疫苗能否在体内诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫应答。 方法：将HPV16 E6基因转染615小鼠宫颈癌U14,建立高表达E6的U14细胞株即E6+U14;制备HPV16 E6 DNA疫苗;随后分组进行体内预防和治疗E6+U14移植同系小鼠试验,设立对照组;观察各组小鼠肿瘤大小,计算抑瘤率、生存时间;计算淋巴和肺转移率;体外分别检测经HPV16 E6 DNA疫苗免疫后的小鼠T 淋巴细胞对E6+U14和U14的杀伤作用。结果：HPV16 E6 DNA疫苗预防和治疗组小鼠各时期瘤体大小均显著低于对照组（均P<0.001 ）,两组抑瘤率均大于70%;平均生存时间均大于对照组（均P<0.001）;预防组淋巴转移率低于对照组（P<0.05）;HPV16 E6 DNA疫苗免疫小鼠T淋巴细胞在不同效靶比,对E6+U14的杀伤效率均明显高于对U14者（均P<0.001）。结论：HPV16 E6 DNA疫苗能诱导机体产生针对HPV16 E6阳性的宫颈癌细胞主动免疫应答及特异性细胞毒淋巴细胞,提示该疫苗可能对临床治疗宫颈癌有效。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

人多发性骨髓瘤荷瘤SCID小鼠模型的建立及其生长特性

为研究人多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)在SCID小鼠免疫重建前后体内生长的特性和免疫细胞对肿瘤的作用，建立人多发性骨髓瘤(MM)荷瘤SCID小鼠模型。体外培养IL-6依赖的人MM细胞株XG7，接种于SCID小鼠和用人淋巴细胞重建的SCID小鼠皮下；监测成瘤状态，通过免疫组化观察细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)杀伤。结果表明：成瘤后的肿瘤细胞CD28、CD138等分子的表达与接种前没有明显变化；免疫重建后的SCID小鼠成瘤潜伏期延长，瘤体积小；免疫重建后的SCID小鼠肿瘤组织中，有人CD3 T细胞的浸润。结果提示：SCID小鼠是建立肿瘤模型和肿瘤免疫研究的良好动物；免疫重建后的SCID小鼠体内肿瘤生长受抑制：人MM细胞在小鼠体内的生长状态与淋巴细胞免疫有关。     

HPV16 L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

目的：探讨嵌合性病毒样颗粒HPV16 L1－E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法：以本室构建的HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB／c小鼠，在初次免疫后，分别于第3，4，5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV16L1蛋白，检测特异性DHT反应，在末次免疫2周后，取小鼠脾细胞，用HPV 16 L1－E7蛋白刺激，检测T细胞增殖反应及血清IFN－γ水平。结果：HPV16 L1－E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV16 L1抗体及特异性DTH反应，加强免疫后，抗体水平升高，两者水平均高于对照组（P＜0．01），HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞，在特异性HPV16 L1－E7蛋白抗原刺激下，特异性T淋巴细胞明显增殖，被免疫小鼠血清中出现高水平IFN－γ。结论：嵌合母亲产颗粒HPV16 L1－E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体，HPV16L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子，这为研究预防HPV感染和治疗HPV相关性肿瘤的疫苗提供了实验资料。     

人成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的支持作用

目的观察人成纤维细胞对人胚胎干细胞（hESC）生长的支持作用，建立完全非动物源性培养系统。方法采用人包皮成纤维细胞为饲养层，以血清替代品取代动物血清，支持人胚胎干细胞生长，观察其增殖和分化情况。结果包皮成纤维细胞能很好地支持人胚胎干细胞生长增殖，并保持87％左右未分化表型：碱性磷酸酶（AKP）染色强阳性，阶段特异性胚胎抗原3（SSEA-3），肿瘤排斥抗原160（TRA-1-60）表达强阳性，可见转录因子OCT-4mRNA表达。核型正常，体外能形成拟胚体。结论人成纤维细胞完全可以支持人胚胎干细胞增殖，可望为胚胎干细胞定向诱导分化应用于临床打下基础。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外诱导分化为人汗腺细胞（hSGCs）。方法：体外分别分离培养hMSCs和hSGCs,原代培养hSGCs融合后,收集细胞,制备汗腺细胞匀浆,用含10%汗腺细胞匀浆的汗腺培养基来诱导培养hMSCs。1周后,检测诱导培养的hMSCs的抗原表达。结果：培养的hSGCs表达CK19和CEA;hMSCs表达CD44、105,不表达CK19、CD34和CEA。诱导培养1周,免疫细胞化学染色示诱导培养组少量细胞表达CEA和CK19,而对照组未见CEA和CK19阳性细胞;流式细胞仪检测CEA在诱导培养组的阳性表达率约为（6.2±1.2）%,对照组（0.9%±0.0）%（P〈0.05）。结论：在无完整汗腺细胞存在的情况下,hMSCs在体外也可诱导分化为hSGCs。     

重组人表皮生长因子促人角膜缘上皮细胞生长的研究

目的：探讨重组表皮生长因子（rhEGF)对人角膜缘上皮细胞生长的影响。方法：采用rhEGF作用于体外培养的人角膜缘上皮细胞，记录细胞生长曲线，并用四只氮盐（MTT）法测定细胞增殖状况。结果：rhEGF浓度为10ng/ml时对人角膜缘上皮铁促增殖作用最强（P＜0．05）。MTT法48h的吸光度值实验组均高于对照组（P＜0．01）。结论：rhEGF对体外培养人角膜上皮细胞有明显促增生作用。     

炎症信号受体Toll基因在人肺腺上皮细胞和血管内皮细胞的表达

目的　研究炎症信号受体 Toll m RNA在人单核吞噬细胞系 (THP- 1)、脐静脉血管内皮细胞(UVECs)和肺腺上皮细胞系 (SPC- A- 1)的表达情况。方法　分别设计人 TL R2 和 TL R4两对特异引物 ,从 THP- 1、UVECs和 SPC- A- 1提取总 RNA,采用一步法 RT- PCR和地高辛标记的 Northern杂交技术检测 TL R2 和 TL R4在 3种细胞的表达。结果　 RT- PCR和 Northern杂交显示 ,3种细胞均表达 TL R4受体 ,但仅 THP- 1和人 U VECs表达 TL R2 受体。结论　本实验结果表明除单核吞噬细胞外 ,大血管内皮细胞和肺腺上皮细胞亦表达 Toll受体基因 ,提示在炎症反应中 Toll信号受体可能介导这些细胞效应分子基因转录激活的信号传导。     

人羊膜基底膜侵袭模型观察人舌鳞癌体外侵袭行为

目的：观察舌鳞癌细胞侵袭基底膜的过程及形态学特征。方法：细胞培养装置充满培养液,并被预制的人羊膜基底膜分为上、下两室,将人舌鳞癌细胞置于上室。经48－72h后,利用免疫组化染色、冷冻断裂技术,在光镜和电镜下观察癌细胞的改变及对基底膜的侵袭行为。结果：生长在基底膜上的癌细胞表现丝状伪足明显增多,癌细胞周围有基底膜的溶解破坏,癌细胞显示活跃的侵袭能力,侵袭进入或穿过基底膜。结论：人舌鳞癌侵袭人羊膜基底膜时,与体内侵袭行为较一致,这是一种较理想的体外观察研究癌细胞侵袭行为的实验模型。     

由人淋巴结建立的—株人淋巴母细胞样细胞系

本文报告由人淋巴结建立一株人淋巴母细胞样细胞系,命名为“昆明总医院淋巴细胞株KGHLY(Kunming General Hospital Lymphoblastoid Cell line KGHLY)。KGHLY细胞悬浮生长,易形成团块,生长旺盛,第30代细胞倍增时间为26h,光镜和电镜下培养细胞的形态和结构与淋巴母细胞样细胞的相似。细胞分泌IgM,表面标志研究显示,无绵羊红细胞受体,这些提示细胞来自B淋巴细胞。核型是非整倍体,染色体众数为44—46条,在体外已维持一年,传代70代,细胞保存液氮复苏良好,此细胞系的建立将是淋巴母细胞样细胞和人一人杂交瘤有用的研究材料。     

人胚细胞的体外培养

目的：为医学研究长期提供培养的人胚细胞。方法：体外培养人胚细胞，观察其生长特性、染色体数目以及冻存和复苏的条件。结果：培养的人胚肺、皮肤、肾、脾及脑组织中，肺和皮肤细胞在冻存前后增长速度较快而稳定，染色体数目为２ｎ＝４６，占８７％￣９１％；肾、脾细胞扩增缓慢；脑组织几乎不能扩增。结论：人胚肺和皮肤细胞可长期培养，可为医学研究提供二倍体细胞实验对象。     

链球菌蛋白对人肝癌Bel-7402细胞及人正常肝细胞生长的影响

目的观察链球菌蛋白对人肝癌Bel-7402细胞及人Chang氏正常肝细胞生长增生的影响。方法常规培养链球菌,提取细菌全蛋白并通过阴离子交换层析获得蛋白分离组分SpⅠ和SpⅡ。不同浓度链球菌蛋白(10、50、100mg/L)作用于人肝癌Bel-7402细胞及人Chang氏正常肝细胞24～72h后,采用MTT法检测两种细胞的增生活性。倒置显微镜下观察50mg/L链球菌全蛋白和SpⅡ对两种细胞的形态学变化。结果MTT结果显示,链球菌全蛋白及SpⅡ能显著抑制Bel-7402细胞的生长,与蛋白剂量和作用时间呈负相关关系;SpⅠ对Bel-7402细胞未显示出明显增生抑制作用。链球菌全蛋白及SpⅡ对人Chang氏正常肝细胞显示出不同程度的刺激生长作用。倒置显微镜下观察,链球菌全蛋白及SpⅡ作用后的Bel-7402细胞,细胞稀疏、脱落、排列紊乱,失去正常形态,而人Chang氏细胞未发现明显的形态学变化。结论链球菌全蛋白及SpⅡ能抑制人肝癌Bel-7402细胞的增生,并且能在一定程度上促进人Chang氏正常肝细胞增生。     

人脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存的技术

目的 研究分离、培养、扩增人脐静脉内皮细胞及进行冷冻保存技术，探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性。方法 新鲜脐带42条，脐静脉内灌注消化酶消化，获得内皮细胞：以含20％的胎牛血清M199液进行培养。采用Ⅷ因子免疫荧光染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度：内皮细胞加入含10％DMSO冷冻保存液，置于液氮进行保存，复苏后进行锥虫蓝试验，四氮唑盐(MTT)试验以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果 血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在95％以上。复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异。冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高，但无统计学意义。结论 脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力，可作为制备组织工程学血管的种子细胞来源。