HSV-tk基因治疗靶向载体的构建及特异性表达分析

背景与目的:阻断肿瘤组织内血管生成和血管化是一个很有发展前景的灭瘤途径之一。胸苷激酶自杀基因系统(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk/GCV)能有效杀伤血管内皮细胞,目前多采用巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)作为启动子,但其杀伤缺乏特异性。KDR(kinasedomaininsertcontainingreceptor)是血管内皮生长因子的两种受体之一,它在肿瘤血管内皮细胞中高表达,而在正常组织中呈低表达。本研究是构建KDR启动子介导的HSV-tk重组腺病毒、并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法:采用pAdeasy系统,按定向克隆方法将KDR-tk片段正向插入表达载体的多克隆位点间,构建受KDR启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染人脐静脉血管内皮细胞系(humanumbilicalvenousendothelialcells,HUVEC)和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2。用更昔洛韦(ganciclovir,GCV)处理受染细胞,并以MTT法检测其细胞增殖情况。结果:经限制性酶切分析,RT-PCR及PCR方法鉴定,插入基因大小、位置、方向正确。病毒滴度为1×1010pfu/ml。在感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为100的条件下,GCV浓度由0增至50μg/ml时,感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率由100%分别下降至(28.94±5.67)%和(75.45±2.91)%(P<0.01)。结论:构建的含KDR-tk重组腺病毒可在血管内皮细胞中特异性地表达HSV-tk。     

pAdKDR-tk和pAdCMV-tk自杀基因系统杀伤性和特异性的体外实验

 目的 了解以血管内皮生长因子受体2（KDR）和巨细胞病毒（CMV）为启动子的自杀基因系统对靶细胞的杀伤性和特异性。方法 以腺病毒载体介导、分别受KDR和CMV为启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转载系统（pAdKDR-tk和pAdCMV-tk）转染到高表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）和不表达KDR的鼻咽癌细胞系CNE-2，加以丙氧鸟苷（GCV），进行体外杀伤性和特异性实验。结果 pAdCMV-tk转染的HUVEC和CNE-2 细胞对GCV显示出相似的敏感性，而pAdKDR-tk转染的这两个细胞系对GCV的敏感性不同。在感染指数（MOI）=100，GCV浓度增至50 μg／ml时，HUVEC细胞生存率下降为（23.12±4.90）%，CNE-2细胞生存率仍高达（70.46±3.27）%。结论 pAdCMV-tk自杀基因系统可杀伤CNE-2和HUVEC两个细胞系。而pAdKDR-tk自杀基因系统只能杀伤HUVEC细胞系，对CNE-2无明显作用。提示pAdKDR-tk自杀基因系统对表达KDR的细胞具有特异性杀伤作用。     

转录靶向性KDR启动子调控双自杀基因系统对人大细胞肺癌细胞L9981的杀伤作用

背景与目的 研究KDR启动子转录调控双自杀基因系统(CDglyTK)对人大细胞肺癌细胞L9981的杀伤作用.方法 应用分子生物学技术克隆KDR基因的启动子KDRP,构建KDR启动子调控的双自杀基因(CDglyTK)真核表达质粒pcDNA3-KDRp-CdglyTK.并将其导AL9981和人肝癌细胞HepG2中.给予不同的前药(GCV和/或5-FC)处理后,应用MTT法检测各组细胞的存活率.并应用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期和凋亡.结果 成功的克隆KDR启动子和构建pcDNA3-KDRp-CdglyTK质粒.pcDNA3-KDRp-CdglyTK转染后,L9981细胞中均可检测到CD和TK mRNA,而HepG2细胞中则无.联合应用5-FC+GCV处理对转双自杀基因细胞(L9981)的杀伤作用显著高于单独应用5-FC或GCV(P<0.05),且二者显示了良好的药物协同作用.结论 KDR基因启动子调控双自杀基因系统可以靶向性杀伤人肺癌细胞.     

缺氧对血管内皮生长因子启动子-胸苷激酶系统杀伤肝癌细胞系的增强作用

目的：探讨缺氧对腺病毒介导的血管内皮生长因子启动子－胸苷激酶系统（AdVEGF-tk)对肝癌细胞系HepG2选择性杀伤活性的增强作用。方法：采用AdEasy system构建重组腺病毒载体AdVEGF-tk和AdVEGF-GFP,在293细胞中包装,扩增后,分别感染L02（正常肝细胞系）和HepG2,A VEGF-GFP感染细胞经正常培养24h后,在荧光显微镜下观察其荧光蛋白表达情况;AdVEGF-tk感染细胞在缺氧或不缺氧条件下培养,并给予不同浓度的丙氧鸟苷（GCV）处理,用MTT法检测感染细胞的增殖情况,结果：AdVEGF-GFP感染的L02细胞仅见稀散的荧光,而AdVEGF-GFP感染的HepG2细胞则出现大量荧光,感染AdVEGF-tk后,当感染指数（MOI）为100目GCV浓度为10ug/ml时,L02细胞在不缺氧条件下对GCV几乎不敏感,但在缺氧条件下,70％以上的细胞被杀死,而HepG2细胞即便在不缺氧培养条件下也有60％以上的细胞被杀死,缺氧则使80％以上细胞被杀死,结论：缺氧可加强腺病毒介导的AdVEGF-tk系统对体外培养肝癌细胞的选择性杀伤作用。     

腺病毒介导的VEGF启动子-胸苷激酶系统对骨肉瘤细胞的杀伤试验

目的探讨腺病毒介导的VEGF启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)系统(AdVEGF-tk)对体外培养的骨肉瘤细胞的选择性杀伤作用.方法采用2种重组腺病毒载体AdVEGF-tk和AdCMV-tk(CMV启动子调控tk基因表达)体外感染低表达VEGF的成骨细胞系MC3T3-E1和高表达VEGF的骨肉瘤细胞系LM8,并给予不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理,用MTT法检测感染细胞的增殖情况.结果未感染病毒或感染空病毒的MC3T3-E1细胞和LM8细胞对GCV不敏感,感染AdCMV-tk的MC3T3-E1细胞和LM8细胞对GCV敏感.与感染空病毒的MC3T3-E1细胞相比,感染AdVEGF-tk的MC3T3-E1细胞对GCV的敏感性轻度增加,用50 μg/ml GCV处理时,30% MC3T3-E1细胞被杀死;感染AdVEGF-tk的LM8细胞对GCV的敏感性明显增加,用50 μg/ml GCV处理时,95% LM8细胞被杀死,产生的细胞毒活性表现为剂量依赖性.结论腺病毒介导的VEGF启动子-tk/GCV系统对高表达VEGF的骨肉瘤细胞具有杀伤作用.     

转染外源HC56基因对Jurkat细胞足叶乙甙作用敏感性的研究

目的　探讨HC5 6基因与化疗敏感性的关系。方法　把HC5 6基因转染Jurkat细胞 ,经G418筛选 ,获得稳定表达外源HC5 6基因的细胞克隆后 ,应用MTT法 ,观察HC5 6基因产物对Jurkat细胞拓扑异构酶Ⅱ抑制剂足叶乙甙 (etoposide ,VP16)敏感性的影响。结果　HC5 6基因转染Jurkat细胞 ,在 1μg ml、10 μg ml、5 0 μg ml浓度的VP16作用下 ,对细胞生长的相对抑制率分别为 5 1.7%± 4.2 % ,45 .1%± 3 .7% ,79.6%± 6.2 % ,明显高于在相应的VP16浓度作用下的PBK CMV空载体转染的对照细胞(分别为 9.5 %± 0 .6% ,7.0 %± 0 .5 % ,10 .2 %± 0 .9% ) (P <0 .0 1)。结论　HC 5 6基因产物可增加Jurkat细胞对足叶乙甙的敏感性     

重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK载体的构建及抗肝癌实验研究

目的构建hTERT启动子调控的HSV—TK基因重组腺病毒载体系统,观察Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。方法将穿梭质粒pSU-Tp-TK与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转导至HEK293细胞,利用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK载体系统;将不同感染复数（MOI=1、10、100、1000）的重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK感染肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L-02,加入不同浓度的GCV（0、1、10、100、1000ug／ml）,MTT、法检测细胞活性。结果HEK293细胞出现病毒空斑,提取病毒DNA,经PCR鉴定正确后扩增、纯化,滴度为1．5×10^10pfu／ml;MTT法检测到Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV能靶向杀死肝癌细胞HepG2,且细胞存活率随着病毒滴度和GCV浓度的增加而降低。结论该实验构建的Ad—hTERTp—HSV—TK载体系统,可靶向抑制肝癌细胞HepG2,而对正常肝细胞L-02几乎无影响。     

人MUC4启动子驱动HSV-TK腺病毒靶向杀伤胃癌细胞的研究

目的：构建人MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒,研究其对胃癌细胞的靶向杀伤作用。方法：免疫荧光法检测MUC4在胃癌细胞系中的表达。克隆MUC4启动子区625bp活性序列,利用重组荧光素酶检测系统检测其在SGC-7901胃腺癌细胞及NUGC4胃印戒细胞癌细胞中的转录活性。以AdEasyTM腺病毒系统为载体,构建MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒,与前体药物GCV联合,检测其对上述两种胃癌细胞的细胞毒作用。结果：MUC4蛋白在两种胃癌细胞的胞浆和胞膜均有表达,而在成纤维细胞中无表达。克隆的MUC4启动子片段在SGC-7901和NUGC4细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV40,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性。MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒与GCV联合能够诱导SGC-7901和NUGC4胃癌细胞凋亡,产生特异性靶向细胞毒作用。结论：人MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒联合GCV对SGC-7901和NUGC4胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具。     

表达嵌合性T细胞受体的肿瘤浸润淋巴细胞对KDR表达阳性细胞的选择性杀伤作用

目的 研究表达嵌合性T细胞受体VEGF 121-hinger-FcRγ的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR(kinase-domain insert containing receptor)表达阳性细胞的选择性杀伤作用。方法 应用分子克隆技术重组VEGF 121-hinger-FcRy(Vhγ),构建重组逆转录病毒质粒pMSCVneo-Vhγ,经PT67包装后筛选高滴度的病毒,体外感染分离于肝癌组织的TIL,获得MSCVneo-Vhγ-TIL。以空病毒感染TIL获得的MSCVneo-TIL作为对照。以MTT比色法分析不同的TIL细胞对4种靶细胞(不表达VEGF受体KDR的成纤维细胞系NIH3T3和肝癌细胞系HepG2,以及表达VEGF、受体KDR的人脐静脉血管内皮细胞系ECV304和恶性黑色素瘤细胞系A375)的杀伤活性。结果 未转染的TIL和MSCVneo-TIL对NIH3T3和ECV304无明显的杀伤作用,对HepG2和A375有一定杀伤作用,对4种靶细胞杀伤活性的差异无显著性;MSCVneo-Vhγ-TIL对NIH3T3无明显杀伤活性,对ECV304有明显杀伤活性,对HepG2的杀伤与TIL、MSCVneo-TIL相比差异无显著性,而对A375的杀伤明显增强。结论 嵌合性T细胞受体Vhγ经逆转录病毒载体介导,可在TIL细胞表面稳定表达,并获得选择性识别和溶解KDR阳性血管内皮细胞和肿瘤细胞的新效应功能。     

Ad-hTERTp-单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷系统联合奥沙利铂对人类肝癌细胞的影响

目的研究腺病毒介导的Ad—hTERTp一单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷（Ad-hTERTp—HSV—TK／GCV）自杀基因系统联合奥沙利铂对人类肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用。方法将带有hTERT启动子驱动HSV—TK基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK作为载体。感染复数（MOI）为100转染HepG2细胞,观察不同浓度的Ad-hTERTp—HSV-TK／GCV、奥沙利铂及二者联合对HepG2细胞生长的影响。用锥虫蓝活细胞拒染法、四甲基偶氮唑盐比色（MTF）法检测各干预组肝癌细胞生长的抑制率。结果3组HepG2细胞的生长均不同程度被抑制,且随药物浓度的增加抑制作用显著增强。Ad—hTERTp—HSV。TK／GCV联合奥沙利铂组抑制率最高（86．63％）,与Ad—hTERTp—HSV．TK／GCV组抑制率（72．12％）及奥沙利铂组抑制率（59．41％）相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论Ad—hTRTq：Tp—HSV—TK／GCV联合奥沙利铂可显著增强对HepG2细胞的杀伤作用,增加靶向性的同时可以降低药物浓度,对临床用药有指导意义。     

卵巢透明细胞癌临床治疗效果研究

背景与目的:卵巢透明细胞癌相比于其他卵巢上皮性癌,其预后较差,本文对本院卵巢透明细胞癌患者生存率作分析比较,探讨CAP[表柔比星(E-ADM)、顺铂(DDP)加环磷酰胺(CTX)]方案加用丝裂霉素(MMC)后的治疗效果。方法:对本院于1999年1月1日至2002年12月31日接受治疗的卵巢透明细胞癌共33例(A组),同时随机取37例卵巢其他上皮性癌的患者作对照(B组)。Ⅰ期患者行全子宫 双附件 大网膜切除 阑尾切除 淋巴结分期术),2例患者需要生育的卵巢癌患者行患侧附件切除 对侧卵巢活检 大网膜切除 阑尾切除术术。Ⅱ期以上的患者行肿瘤减灭术(tumor reductive surgery,TRS)尽可能使残余灶<1cm,2组患者均在术后化疗均采用CAP方案(静脉应用),但A组患者CAP方案中加用了丝裂霉素。A组患者与仅用CAP方案的透明细胞癌患者(C组)Ⅰ/Ⅱ期15例及Ⅲ/Ⅳ期9例相比较。结果:术前A组与B组Ⅰ/Ⅱ血清CA125差异有显著性,卵巢透明细胞癌血清CA125水平值较低,Ⅲ/Ⅳ期血清CA125差异无显著性。在3次及6次化疗后与化疗前Ⅰ/Ⅱ期A组及B组血清CA125差异有显著性,而Ⅲ/Ⅳ期血清CA125下降水平差异无显著性。A组卵巢透明细胞癌患者中有11例有子宫内膜异位症(33.33%),有7例患者出现深静脉血栓(21.21%),有深静脉血栓的患者与生存率无直接关系(P=0.26)。Ⅰ/Ⅱ期患者的平均生存时间分别为:A组38.3±2.4个月,B组38.3±2.7个月,Ⅰ/Ⅱ期患者A组与B组用Log Rank检验相比较4年生存率差异无显著性(P=0.471),Ⅲ/Ⅳ期患者的平均生存时间分别为:A组20±3个月,B组34±4个月,Ⅲ/Ⅳ期患者A组与B组相比较用Log Rank检验4年生存率差异有显著性(P<0.05)。C组患者Ⅰ/Ⅱ期15例,平均生存时间为:30±3个月,与A组用MMC的透明细胞癌患者Ⅰ/Ⅱ期23例比较生存率差异有显著性(P<0.05)。C组患者Ⅲ/Ⅳ期9例,均死亡。平均生存时间为18±3个月。与A组用MMC的透明细胞癌患者Ⅲ/Ⅳ期10例比较生存率差异无显著性(P=0.430)。结论:卵巢透明细胞癌术前及化疗后血清CA125水平值较低,用CAP加丝裂霉素的规则化疗治疗透明细胞癌对Ⅰ/Ⅱ期患者有一定的治疗效果,对Ⅲ/Ⅳ期患者治疗效果不佳。卵巢透明细胞癌疾病的复发率及死亡率仍然较高。     

胰腺实性-假乳头状肿瘤研究进展

胰腺实性-假乳头状肿瘤(solidpseudopapillarytumor,SPT)是一种胰腺少见的肿瘤,主要发生在年轻女性,13~15岁的年龄段发病率最高,临床症状不明显,部分患者症状为腹痛、呕吐、腹胀和消化不良等,超声和CT上一般可见到有囊性和实性部分组成的异质性的包块,缺乏其他特征性的结构。大体为囊壁厚薄不一内含血性液体的囊肿,其中可有破棉絮状的坏死组织,组织学特点是细胞形态单一,有纤细的假乳头结构,实性区域有蜕变坏死。SPT的超微结构研究显示,细胞内有直径50~2640nm的膜包围的颗粒;免疫组化Vimentin、α1-AT、α1-ACT阳性而腺癌的标记为阴性;DNA分析发现有染色体丢失和移位。较成熟的诊断方式是影像学和病理学,实验室检查对诊断帮助不大。最佳治疗措施是手术切除,但应注意随访,因为该肿瘤有恶性潜能和复发倾向。     

Possibility of predicting the results of the surgical treatment of cancer of the thoracic portion of the esophagus

Within a 18-year period in the clinic 273 patients were subjected to radical surgery for cancer of the thoracic esophagus. 206 patients were discharged from the clinic. The survival rate for 5 years and longer was noted in 58 patients. The data and results of the treatment depending on a sum of clinical signs were treated mathematically. It is noted that the patients' survival is influenced by such factors as sex, the stage of the disease, the morphological structure of tumor, the character of course, tumor size and spread, the type of surgical intervention. An advanced course, changes in blood presence of metastases do not seem to be the reason for cancellation of the operation.     

Angiosarcoma of the breast: the experience of the European Institute of Oncology and a review of the literature

Angiosarcoma of the breast (AB) is a rare entity: its overall incidence is estimated at between 0.002% and 0.005% per year. Some potential risk factors have been described, mainly previous irradiation of the breast. We report the experience of the European Institute of Oncology with this unusual disease from January 1996 to January 2006: sixteen patients with angiosarcoma, 9 (56%) of whom had primary AB and 7 (44%), secondary AB, are discussed.     

Cardiac tolerance of the combination paclitaxel-anthracyclines in the context of the management of cancer of the breast

Within the past decades there has been major interest in associating the paclitaxel into the management of breast cancer patients with a strong improvement of clinical results. Moreover, doxorubicin is historically one of the major chemotherapeutic agents in breast cancer treatment. So, investigations of the combination of the paclitaxel with doxorubicin have logically taken place in the strategy of breast cancer management. Also, this association became a standard of care neoadjuvantly in locally advanced breast cancer. The aim of this review of literature consists to make a special focus on cardiac toxicity occurring after doxorubicin and paclitaxel association and to give adequate directions for the next future in this promising combination.