基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的建立基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型,筛选调节免疫系统、造血系统和抗肿瘤药物。方法构建以串连的多个STAT的DNA结合序列为调控序列,以荧光酶基因作为报告基因的表达载体。通过将该载体分别转入体外培养的不同细胞系中使之稳定表达,建立具有激活STAT活性的药物筛选模型,并利用多个抗过敏和抗肿瘤药物样品进行检测。结果建立多株药物筛选细胞模型,筛选方法简便,操作容易,灵敏度高,结果稳定。结论本细胞株可以用于大规模高通量药物筛选。     

JAK2/STAT3信号通路在胃癌发病机制中的作用及AG490干预研究

目的以重组人白介素-2(IL-2)作用于胃癌细胞系AGS,观察其对胃癌细胞生长增殖的影响;利用蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)特异性抑制剂AG490阻断JAK2/STAT3(信号传导子与激活子3)的异常激活,研究JAK2/STAT3信号传导通路在胃癌发病中的作用。方法以重组人IL-2干预、四唑鎓盐(XTT)法检测胃癌细胞系AGS增殖活性;以特异性抑制剂AG490抑制JAK通路,XTT法检测细胞增殖活性,并检测干预前后JAK蛋白、STAT3蛋白、p-STAT3蛋白表达水平。结果重组人IL-2可呈浓度依赖性抑制AGS细胞增殖,JAK特异性抑制剂AG490可呈浓度依赖性抑制AGS细胞增殖,各组间比较,差异有统计学意义(P<0.05),AG490可显著抑制JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达。结论 JAK2-STAT3信号传导通路可能参与了早期胃癌的生物学行为。     

以人载脂蛋白B为靶点的基因表达下调剂筛选模型的建立与应用

摘要：目的 构建以人ApoB为靶点的基因表达调节剂的高通量筛选模型,筛选apoB基因表达下调剂。方法 以人基因组 DNA为模板,通过PCR扩增apoB基因上游的启动子序列,将扩增的DNA片段克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17,采用脂质 体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞株。应用槲皮素对筛选模型进行评价, 进而基于检测荧光素酶的表达活性变化筛选人apoB基因表达下调剂。结果 PCR扩增得到人apoB基因上游的启动子序列,构建 完成相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-apoB-P,建立了稳定转染细胞株ApoB-Luc HepG2。以槲皮素为阳性化合物进行模 型评价,Z'因子为0.77,符合高通量筛选的要求。应用该模型对5688个微生物发酵液粗提物进行筛选,获得了2株阳性菌株。 结 论 建立了人apoB基因表达下调剂筛选模型,并应用于微生物来源样品的筛选。     

JAK抑制剂在类风湿性关节炎治疗中的研究进展

目的:了解Janus激酶/信号传导及转录激活因子(JAK-STAT)信号通路在类风湿性关节炎(RA)中的作用及JAK抑制剂的研究进展。方法:查阅近年来国内外相关文献,对JAK-STAT信号通路的发现、组成、对RA的调控作用,以及JAK抑制剂的研究进展进行归纳和总结。结果与结论:JAK-STAT信号通路是治疗RA的潜在靶点,JAK家族包括JAK1、JAK2、TYK2和JAK3,STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。JAK和STAT家族成员在调控RA等各种免疫反应中有高度特异性,可以通过多种信号因子被激活。处于研究中的JAK抑制剂有Roxolitinib、Tofacitinib、VX-509、R-348、INCB18424、INCB28050等。研究JAK-STAT信号传导途径在RA所致滑膜细胞增殖、炎性介质分泌及关节破坏中的作用,有助于明确RA的发病机制,为研制RA治疗新药提供理论依据。     

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法　五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果　293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论　马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。     

毒蕈胆碱M_1受体激动剂的高通量筛选模型

目的　建立毒蕈碱样胆碱M1 受体激动剂的高通量筛选模型 ,以此模型进行M1 受体激动剂筛选。方法　将M1 受体基因质粒 (M1 /pCDNA3 1 )与报告基因质粒 (3×CRE/ 3×MRE/SRE LUC)按 1∶5的比例共转染HEK2 93 ,建立了一个稳定的M1 受体激动剂报告基因筛选细胞株。配体与细胞表面M1 受体结合后 ,激活相应的信号通路 ,调节报告基因的表达 ,通过测定荧光酶素报告基因表达水平的变化 ,评估配体激活M1 受体的生物活性。结果　通过对筛选条件 ,如细胞数目、荧光素酶表达时间、底物浓度的优化 ,建立了可靠的筛选方法 ,并对多种抗衰老中药水提物进行了筛选 ,找到 3种对M1 受体有活性的中药。结论　该系统能准确、稳定、有效地应用于M1 受体激动剂的高通量筛选     

基于报告基因检测的β3肾上腺素受体激动剂筛选模型的建立与应用

目的：建立基于双荧光素酶报告基因检测的β3肾上腺素受体（β3-AR）激动剂筛选模型,并用于β3-AR激动剂的筛选。方法：应用免疫细胞化学法鉴定β3-AR在β3-CHO细胞上的稳定表达,并将pCRE-luc质粒与pRL-TK质粒共同瞬时转染β3-CHO细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型。通过检测报告基因萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值,来间接反映配体对β3-AR的激动活性。并以β-AR激动剂异丙肾上腺素刺激对模型的有效性进行验证,在此基础上以此模型对20种新化合物的β3-AR激动活性进行筛选。结果：β3-CHO细胞经免疫细胞化学法鉴定有特异性受体蛋白表达。通过将两个报告基因质粒转染该细胞后,与加入溶剂对照相比,加入异丙肾上腺素可显著促进荧光素酶报告基因的表达,表明该模型有效、可靠。以此模型从20个化合物中初筛出8个活性较强的β3-AR激动剂。结论：本研究建立了基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以此模型筛选发现了几个活性较强的β3-AR激动剂。     

Ascofuranone增加HepG2细胞LDLR报告基因表达的生物活性的研究

以控制LDLR基因表达的调控元件SRE为靶位点 ,使用含有荧光素酶报告基因的转染人肝细胞系HepG2筛选模型高通量筛选微生物来源的能够增加低密度脂蛋白受体 (LDLR)基因表达的具有潜在的降胆固醇作用的生物活性物质。在筛选过程中 ,通过对一株真菌产生的化合物ascofuranone的研究发现该化合物对测活用细胞株的LDLR荧光素酶报告基因的表达有中等强度的激活作用 ,其SC150 为 40 .4μmol/L。Ascofuranone激活LDLR基因表达这一新的生物活性的发现为深入研究该化合物的降血脂作用提供了新的重要启示     

小分子 Janus 激酶抑制剂的研究与开发

近年来的研究发现．Janus激酶（JAK）可通过JAK—STAT信号通路对细胞增殖、分化、凋亡以及血管生成、免疫调节等起重要作用,其抑制剂可用于骨髓纤维化、恶性肿瘤以及自身免疫性疾病的防治。简介JAK—STAT通路与JAK2V617F突变,分类综述用于治疗恶性血液病和肿瘤以及自身免疫性疾病与移植排斥反应的小分子JAK抑制剂的研究与开发。     

JAK／STAT和激酶抑制剂：一组可能的新药

JAK／STAT通过蛋白质酪氨酸位点特异性磷酸化作用传递细胞因子信号。近几年，在癌细胞和转染癌基因的细胞中发现，JAK／STAT的表达增高，并且发现它们与同种异体移植物的免疫排斥反应及自身免疫疾病的炎症形成过程有关。本文探讨了JAK／STAT和激酶抑制剂的筛选和理论设计策略。这些抑制剂有天然的也有合成的，同时也包括其他一些特殊的抑制剂或类似物，可用于不同的适应证。     

HBx蛋白对α干扰素诱导的MxA蛋白表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)HBx蛋白(HepatitisB virus X protein)对α干扰素(IFN-α)诱导的抗病毒蛋白的影响及相关机制。方法以表达HBx蛋白的重组质粒FL1-145HBx转染人肝胚瘤细胞株HepG2细胞,经IFN-α处理后,RT-PCR法分析细胞内抗病毒蛋白MxA和JAK-STAT信号转导途径分子STAT1 mRNA表达水平,同时运用免疫印迹检测细胞内HBx、p-ERK、p-STAT1和t-STAT1等蛋白的表达。结果转染细胞内MxA、STAT1的mRNA和p-STAT1、t-STAT1的蛋白表达水平明显减少(P<0.05);而ERK抑制剂PD98059预处理后,转染细胞内MxA、STAT1 mRNA水平能够恢复至转染前的表达水平。结论 HBx蛋白很可能通过影响IFN-αJAK-STAT信号转导途径分子而抑制抗病毒蛋白MxA的表达;ERK信号转导途径的活化可能参与这一抑制过程。     

Inhibition of cytokine-induced JAK-STAT signalling pathways by an endonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid

1. Inducible nitric oxide (iNOS) is thought to involve in host defence and tissue damage in inflammatory loci. In previous study, we have found that the endonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid (ATA) can protect macrophages from cell death induced by bacterial lipopolysaccharide. This action is through the interruption with signalling pathways for NF-kappa B and AP-1 activation, and thus iNOS expression. In this study we have addressed the effects of ATA on JAK-STAT signalling pathways. 2. In murine RAW 264.7 macrophages, IFN-gamma-mediated NO production and iNOS expression were concentration-dependently reduced by the presence of 3-100 micro M ATA. 3. IFN-gamma-induced STAT1 activation, as assessed from its tyrosine phosphorylation, nuclear translocation, binding to specific DNA response element and evoked IRF-1 reporter gene assay, were concomitantly inhibited by ATA. However, ATA did not alter IFN-gamma binding to RAW 264.7 cells. 4. The activities of JAK1 and JAK2, the upstream kinases essential for STAT1 signalling in response to IFN-gamma, were also reduced by ATA. 5. Moreover, IL-4, IL-10, GM-CSF and M-CSF elicited tyrosine phosphorylation of STAT3, STAT5 and/or STAT6 in macrophages were diminished by the presence of ATA. 6. Taken together, we conclude that ATA can interfere JAK-STAT signalling pathways in response to cytokines. This action contributes to the inhibition of IFN-gamma-induced iNOS expression.