铜绿假单胞菌β-内酰胺类药物耐药相关基因(18种)研究

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌中β-内酰胺类药物耐药相关基因研究存在状况。方法自临床分离40株对铜绿假单胞菌，采用聚合酶链反应（PCR）检测耐药基因型（TEM、SHV、CTX—M-1群、CTX—M-9群、OXA-2群、OXA-10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2）。结果40株中CARB阳性18株（45．0％）、35株oprD2基因缺失（87．5％），其余基因均阴性。结论临床分离的铜绿假单胞菌CARB基因携带率高。     

中重度AECOPD感染铜绿假单胞菌的耐药表型及基因型分析

目的 探讨中重度慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)感染铜绿假单胞菌耐药现状.方法 AECOPD患者105例,经呼吸道分泌物分离出铜绿假单胞菌21株,体外采用K-B法测定对14种抗生素的药敏结果.用PCR法检测14种耐药基因,分析铜绿假单胞菌的耐药表型和基因型.结果 21株铜绿假单胞菌对抗生素的耐药率:头孢曲松80.9％,头孢他啶76.2％,头孢吡肟66.7％,亚胺培南14.4％.21株铜绿假单胞菌中,blaTEM、blaSHV、blaOXA-10、blaPER、blaDHA阳性率分别为28.6％、21.4％、14.2％、42.8％、7.1％,而blaVEB、blaCTX-M、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaSPM均为阴性,oprD2基因缺失率为7.2％,ant(3″)Ⅰ,aac(6′)-Ⅱ阳性率分别为35.7％,36.8％.结论 中重度AECOPD分离的铜绿假单胞菌携带多种耐药基因,耐药基因主要与β-内酰胺类基因blaTEM、blaSHV、blaPER、blaOXA-10有关.     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药相关基因的研究

目的分析我院2005年1~12月临床分离34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药相关基因存在状况,为临床抗感染治疗提供依据。方法应用PCR方法检测13种β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因,分别为blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaOXA-10、blaPER、blaVEB、blaGES、blaDHA、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaSPM、oprD2;3种氨基糖苷类修饰酶基因,分别为:aac(6′)-I、aac(6′)-II和ant(2")-I;整合酶基因I(intI1)。结果耐药相关基因blaTEM、blaCARB、blaDHA、blaIMP、oprD2、aac(6′)-I、aac(6′)-II和ant(2")-I、intI1阳性率分别为:5.9%、32.4%、14.7%、17.6%、97.1%、21.2%、33.3%、48.5%、3.0%;其余耐药基因均未检测到。结论携带多种耐药相关基因是耐亚胺培南的铜绿假单胞菌对多种抗生素耐药的重要原因之一,膜孔蛋白基因oprD2缺失不是本组铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。     

铜绿假单胞菌“泛耐株”耐药相关基因研究

目的 研究"泛耐"铜绿假单胞菌中多种耐药基因的存在情况及耐药机制.方法 采用聚合酶链反应(PCR)法检测22株"泛耐"铜绿假单胞菌的β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因、喹诺酮类耐药基因、耐消毒剂基因(qacE△l-sull)和整合酶基因.结果 PCR扩增结果显示22株菌中oprD2、blaCAEB、gyrA、aac(6')-Ⅰb、ant(2")-Ⅰ和qacE △ J-sull基因均阳性;blaSHV、blaSPM、blaGIM、blaDHA、blaOXA-10、blaGES、blaPER、aac(3')-Ⅰ和aac(6')-Ⅱ基因均阴性;blaIMP、blaTEM、blaVEB、aac(3')-Ⅱ、ant(3")-Ⅰ、int Ⅰ1和blaVIM阳性率分别为95.5%、77.3%、13.6%、4.5%、4.5%、4.5%和4.5%.结论 oprD2基因阳性说明这些泛耐菌株中外膜蛋白并未缺失,多种耐药基因同时存在是本研究中铜绿假单胞菌"泛耐"的根本原因.     

亚胺培南耐药铜绿假单胞菌消毒剂及β内酰胺类抗生素耐药相关基因研究

目的 了解临床分离的对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌消毒剂及G内酰胺类抗生素耐药相关基因存在状况。方法 自临床分离28株对亚胺培南耐药铜绿假单胞菌,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法检测耐药基因。结果28株中,qacE△1、TEM、OXA基因阳性株数(％)分别为24株(85．7％)、20株(71．4％)、1株(3．6％),此株0XA基因经序列分析确认为OXA-10型超广谱β内酰胺酶(GenBank注册号：AY841859)。25株(89．3％)oprD基因缺失,IMP、V1M、SHV、PER、VEB、GES、MIR、DHA基因均阴性。结论临床分离的对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌耐消毒剂基因qacEA1及TEM基因携带率均很高,至少存在TEM、OXA-10两种β内酰胺酶基因,oprD基因缺失突变是对亚胺培南耐药的重要原因。     

一株铜绿假单胞菌携带多种耐药基因的研究

目的：了解分离自烧伤患者的铜绿假单胞菌携带的耐药基因情况。方法：应用聚合酶链反应对多重耐药的铜绿假单胞菌进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、oprD2基因和消毒剂-磺胺耐药相关基因以及Ⅰ类整合酶基因检测和分析。结果：PCR结果显示TEM、GES型β-内酰胺酶基因，aac（6’）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ氨基糖苷类修饰酶基因扩增阳性。oprD2基因扩增检测呈缺失型。qacEΔ1-sulⅠ、intⅠ1基因扩增阳性。结论：铜绿假单胞菌携带多种抗生素灭活酶及耐消毒剂和Ⅰ类整合酶基因。多重耐药铜绿假单胞菌的逐渐增多，严重威胁烧伤抗感染治疗。     

浙江丽水铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因研究

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌中氨基糖苷类修饰酶编码基因存在状况。方法对临床分离的40株铜绿假单胞菌采用聚合酶链反应（PcR）检测基因[aac（3）-Ⅱ、aac（6）-Ⅰ,aac（6＇）-Ⅱ、ant（3＂）-Ⅰ、ant（2＂）-Ⅰ]。结果40株菌中aac（6＇）-Ⅰ阳性18株（45.0％）、ant（2＂）-Ⅰ阳性21株（52.5％），其余基因均阴性。结论丽水临床分离的铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因携带率高。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌抗菌药物耐药基因研究

目的分析浙江省湖州解放军第98医院自临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IRPa）和嗜麦芽寡养单胞菌（Sm）中抗菌药物相关耐药基因存在状况。方法2003年9月至2004年10月间从临床分离28株IRPa和19株Sm，采用聚合酶链反应及序列分析的方法分析8种B一内酰胺酶基因（blaIMP、blaVIM、blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaPER、blaVEB和blaGES）、9种氨基糖苷类修饰酶基因（AMEs基因）Eaac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（3）-Ⅲ、aac（3）-Ⅳ、aac（6’）-Ⅰ、aac（6’）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ和aph（3’）-Ⅵ]、外膜孔蛋白D2基因（oprD）、消毒剂-磺胺耐药相关基因（qacE△1-sul1）、氯霉素乙酰转移酶基因（catB）、氯霉素外排蛋白基因（cml1）。结果28株IRPa中bLatEM、blaOXA、aac（3）-Ⅱ、aac（6’）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ和qacE△1-sul1基因的阳性株数（％）分别为20株（71．4％）、1株（3．6％）、23株（82．1％）、10株（35．7％）、15株（53．6％）、8株（28．6％）和24株（85．7％），AMEs基因总阳性率为89．3％，blaOXA基因经序列分析确认为blaOXA-10型超广谱β-内酰胺酶，25株（89．3％）发生oprD基因缺失突变。19株Sm中aac（6’）-Ⅱ、ant（2″）-Ⅰ及qacE△1-sul1基因的阳性株数（％）均为2株（10．5％）；其余基因均阴性。结论临床分离的IRPa中存在blaTEM、blaOXA-10、aac（3）-Ⅱ、aac（6’）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ和qacE△1-sul1基因，oprD基因缺失突变率很高。Sm中存在aac（6’）-Ⅱ、ant（2″）-Ⅰ及qacE△1-sul1基因。     

烧伤病房铜绿假单胞菌耐药基因聚类分析

目的 通过对烧伤病房铜绿假单胞菌耐药基因进行聚类分析,了解烧伤病房铜绿假单胞菌的亲缘性.方法 对20株从烧伤患者分离到的铜绿假单胞菌的β-内酰胺类、氨基糖苷类和磺胺等常见耐药基因进行检测,并以这些基因作为分子标记,作耐药基因聚类分析.结果 20株中,blaTEM、blaCARB、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ和sull等耐药基因检出率高,亲缘性分析显示有3株克隆在烧伤病房流行,并发现同一患者被同种细菌不同株同时感染.结论 以耐药基因作为分子标记作聚类分析对于烧伤病房临床分离株亲缘性及传播分析有着重要的意义.     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药特征及耐消毒剂基因的检测分析

目的 分析和调查我院2005年1月～12月临床分离34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药特点以及耐消毒剂相关基因携带状况。方法 应用BD Phoenix100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和17种药物敏感试验，头孢哌酮／舒巴坦采用KB法。用PCR方法检测季胺类（如苯扎溴铵）、双胍类（如氯己定）耐药相关基因qac EΔ1-sull。结果 亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星100％敏感外，对哌拉西林、哌拉西林／三唑巴坦敏感率为48％～54％，对第三代及第四代头孢菌素、氨曲南和喹诺酮类等抗菌活性差，敏感率为3％～29％，对美罗培南敏感率为29％，对氨苄西林／舒巴坦、氯霉素、四环素、复方磺胺甲噁唑全部耐药。34株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌有14株EΔl-sull基因阳性，携带率为41．2％。结论 本组亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星敏感外，对其它常用抗生素耐药严重，且耐消毒剂相关基因阳性携带率较高，应引起临床微生物和消毒界的重视。     

1株携带多种抗生素灭活酶基因的铜绿假单胞菌临床分离株

目的了解铜绿假单胞菌携带多种抗生素灭活酶基因的情况和有关机制。方法应用聚合酶链式反应（PCR）法对多重耐药的铜绿假单胞菌进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因和oprD2基因检测与分析。结果PCR结果显示CARB和TEM型β-内酰胺酶基因。aac（6′）-Ⅰ、aac（6′）-Ⅱ、ant（2′）-Ⅰ、ant（3″）-Ⅰ氨基糖苷类修饰酶基因扩增阳性。oprD2基因扩增检测呈缺失型。CARB和TEM型β-内酰胺酶基因扩增产物经测序、BLASTn比对分析为blacARB-3和blaTEM-1。结论铜绿假单胞菌可携带多种抗生索灭活酶基因，多重耐药铜绿假单胞菌（MDRP）的逐渐增多，严重威胁临床的抗感染治疗。     

多重耐药铜绿假单胞菌β-内酰胺类相关耐药基因研究

目的 调查我院2005年临床分离多重耐药铜绿假单胞菌（PA）的耐药性分析并探讨其耐药基因的存在状况。方法对31株临床分离的铜绿假单胞菌用纸片扩散法检测其药敏表型,采用聚合酶链反应（PCR）法检测β-内酰胺酶编码基因和外膜通道蛋白OprD2基因,并与相关药敏表型比较。结果31株铜绿假单胞菌对16种抗菌药物的耐药率为48．4％～100％;β-内酰胺酶编码基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的检出率分别为6．4％、3．2％、3．2％、3．2％、3．2％、3．2％,未检出GES、SHV、VER基因,31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失,检出率为100％。结论本院多重耐药铜绿假单胞菌对β-内酰胺酶类抗生素的耐药主要与外膜通道蛋白OprD2基因缺失有关。     

耐亚胺培南的铜绿假单胞菌整合子基因研究

目的通过分析耐亚胺培南的铜绿假单胞菌的整合子所携带的耐药基因的种类及特点，探讨其耐药机制，为指导临床用药，预防院内感染和流行病学调查、新药的研发提供参考。方法根据美国国家临床标准化研究所（CLSI／NCCLS）2004年标准，应用纸片扩散法（KB）进行药敏试验，采用多重PCR方法对临床分离的23株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌进行整合酶（IntI）检测，并分析整合酶阳性菌株的耐药基因盒。结果药敏试验显示23株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌全部为泛耐株，5株为Ⅰ类整合酶阳性，其中3株为缺失型，无耐药基因盒，其余2株耐药基因为blaVIM4和blaPSE-1；14株为Ⅱ类整合酶阳性，其耐药基因盒均为dfr1-sat1-aadA1；3株Ⅰ、Ⅱ类整合酶均为阳性；7株不含Ⅰ、Ⅱ类整合酶。结论耐亚胺培南的铜绿假单胞菌大多都具备Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因和基因盒，这是造成它们成为泛耐株的重要耐药机制。     

铜绿假单胞菌耐亚胺培南相关基因OprD2研究

目的研究铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。 方法取临床分离的铜绿假单胞菌18株，经K-B法检测耐药性，根据耐药性分为耐亚胺培南菌组12株和敏感菌组6株。另设1标准菌株ATCC27853。采用PCR法检测各菌株的OprD2基因，探讨OprD2基因突变与细菌对亚胺培南耐药之间的关系。结果12株耐药菌经OprD2基因扩增，8株阴性，4株阳性；6株敏感菌株及标准菌株扩增全部为阳性。统计学检验结果表明，对亚胺培南耐药菌组和敏感菌组OprD2基因阳性率的差异有极显著性（P＜0.01），且在耐药菌中发现了新的OprD2基因突变方式。 结论OprD2突变是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制，突变的方式有缺失突变与插入失活。     

不同地区铜绿假单胞菌第一类整合子和整合子相关基因盒的分布

目的对石家庄、昆明两地分离的铜绿假单胞菌临床菌株进行第一类整合子的分布及整合子相关基因盒携带率的比较分析，探讨第一类整合子在两地菌株分布的差别。方法采用PCR方法筛选检测64株石家庄、昆明两地临床分离的铜绿假单胞菌第一类整合子和及其所携带的整合子相关基因盒。结果64株铜绿假单胞菌临床菌中共有43株为第一类整合子阳性菌（阳性率67．2％）；其中石家庄菌株和昆明菌株阳性率分别为71．4％和64．3％，两地铜绿假单胞菌第一类整合子阳性率无显著性差异。第一类整合子阳性铜绿假单胞菌中，石家庄菌株和昆明菌株携带一类整合子相关基因盒的阳性率分别为80．0％和38．％，两地第一类整合子阳性菌中整合子相关基因盒的携带率具有显著性差异（P〈0．01）；两地菌株携带的基因盒大小不同。结论第一类整合子在铜绿假单胞菌临床菌株中广泛分布，环境的选择压力影响细菌整合子相关基因盒的分布。     

国内9家医院铜绿假单胞菌消毒剂-磺胺耐药基因的研究

目的调查临床分离铜绿假单胞菌消毒剂-磺胺耐药基因qacE△1-sulI的存在情况。方法收集国内9家医院临床分离的311株铜绿假单胞菌,采用PCR法检测qacE△1-sulI基因。结果311株铜绿假单胞菌196株检出qacE△1-sulI基因,总检出率为63.0%。9家医院铜绿假单胞菌qacE△1-sulI基因检出率有较大差异。结论9家医院临床分离铜绿假单胞消毒剂-磺胺耐药基因qacE△1-sulI携带率高。     

铜绿假单胞菌环丙沙星耐药株Ⅱ类拓扑异构酶基因突变的研究

用PCR方法，扩增26株临床分离铜绿假单力环丙沙星耐药株、4株环丙沙星敏感菌株和PA01菌株的Ⅱ类拓扑异构酶gyrA、gyrB、parC和parE基因的喹诺酮类药物耐药决定区（QRDR）基因片断；并对铜绿假单胞菌Ⅱ类拓扑异构酶基因突变与耐药性关系进行研究。结果表明90％以上的铜绿假单胞菌耐药株表现出Ⅱ类拓扑异构酶基因突变（26株中有24株）。突变主要发生在gyrA基因（22株）和parC基因（14株）上，其中gyrA基因的第83位氨基酸密码子表现出高频突变（22株中有21株，ACC→ATC，占90％），parC基因第80位氨基酸密码子也表现出较高的突变率（14株中有12株，TCG→TTG，占60％），4株耐药株的gyrB和3株耐药株的parE基因发生单点突变，2株耐药株Ⅱ类拓扑异构酶基因朱检测到突变。用二倍稀释法，测定部分喹诺酮和β→内酰胺类药物对耐药突变株的体外抗菌活性。表明铜绿假单胞菌Ⅱ类拓扑异构酶基因突变株对诺氟沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、头孢他啶和亚胺培南表现出不同的敏感性。试验所用24株突变株对诺氟沙星呈现100％的耐药；对左氧氟沙星65％的耐药；40％的菌株对哌拉西林表现出耐药；30％的菌株对头孢他啶耐药；75％的菌株对亚胺培南敏感。     

抗生素压力下铜绿假单胞菌耐药机制变化的动态研究

目的 探索抗生素压力下铜绿假单胞菌在患者呼吸道内耐药性的动态改变.方法 以同一患者不同时期下呼吸道分离铜绿假单胞菌为对象,E-test检测细菌对常用抗菌药物的敏感性;三维水解实验检测目标菌的β-内酰胺酶表型特征;普通PCR检测ESBL、AmpC、碳青霉烯水解酶、膜孔蛋白OprD2等耐药基因;荧光定量RT-PCR检测细菌的AmpC和OprD2的表达情况.结果 筛查到1例因慢性阻塞性肺病急性发作(AECOPD)患者3次入院、下呼吸道分离的属同一克隆的9株铜绿假单胞菌,药敏试验提示细菌的药敏谱存在由单一耐药逐渐转化为泛耐药的模式.三维水解实验显示,5株多重耐药株和泛耐药株高产AmpC酶.所有9株菌的ampC和oprD2基因都为阳性,碳青霉烯水解酶均为阴性.荧光定量RT-PCR检测,多重耐药株和泛耐药株的ampC基因表达量是单一耐药株的1.7～18.7倍;亚胺培南耐药株的oprD2表达量则是敏感株的1/10～1/2000.结论 铜绿假单胞菌在治疗过程中可获得耐药性,其中ampC高表达和oprD2表达下降是导致细菌对亚胺培南、广谱头孢菌素(含酶抑制剂)耐药的主要原因.     

社区与医院获得性感染铜绿假单胞菌药物敏感性对比研究

目的：了解社区与医院感染中铜绿假单胞菌的耐药性及其主要耐药基因,为临床合理用药提供依据。方法：收集2013年1月-2015年1月间在军区门诊部和华西医院分离到的597株铜绿假单胞菌,其中医院感染339株,社区感染258株。MIC 法检测其药敏结果。对105株细菌利用PCR法扩增耐药相关基因,采用SPSS16.0统计软件进行分析。结果：社区感染铜绿假单胞菌耐药率普遍低于医院感染铜绿假单胞菌,如哌拉西林（20.4%,10.1%）、头孢他啶（21.5%,11.6%）;医院感染组 OPRD2, VIM, OXA-10基因检出率为60.0%、44.3%、88.6%,社区感染组基因检出率分别为34.3%、14.3%、71.4%,两组基因检出率比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：医院感染铜绿假单胞菌耐药率高于社区感染铜绿假单胞菌,而金属β－内酰胺酶、碳青霉烯水解酶的产生和OPRD2缺失是医院感染铜绿假单胞菌的耐亚胺培南的主要机制,所以合理选择用药,加强医院的感染监测是控制细菌耐药性产生的有效措施。     

铜绿假单胞菌MexAB-OprM主动外排表型筛选和外排基因检测

目的 研究解放军总医院临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的主动外排系统，为指导临床合理选择抗生素提供依据。方法 采用外排泵抑制剂（苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺）与喹诺酮类抗生素，以微量肉汤稀释法测定加与不加外排泵抑制剂时环丙沙星与左氧氟沙星的最低抑菌浓度（MIC）值，并计算MIC值的变化，根据加与不加外排泵抑制剂MIC值降低3个稀释度及以上筛选主动外排表型阳性菌株；PCR扩增外排表型阳性菌的耐药基因oprM、mexB和mexR，并对3株菌进行mexR基因测序分析；RT-PCR检测oprM基因的mRNA水平，分析耐药基因的表达情况。结果 苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺能极大的降低左氧氟沙星和环丙沙星的MIC值，70株多重耐药铜绿假单胞菌中46株表型阳性（65．7％），其中PCR检测oprM、mexB和mexR基因同时阳性菌株42株（91．3％），仅oprM基因阳性2株（4．3％），oprM、mexB和mexR基因均阴性2株（4．3％）。RT-PCR产物测定A值（A260／A280）与PAO1对照阳性菌株13株，以PAO1的oprM／rpoD的A值为对照阳性菌株4株，同时满足A值（A260／A280）和oprM／rpoD比值均高于PA01的菌株3株。测序结果与GenBank中已知的mexR基因比对，其中2株同源性为100％，1株第434位核苷酸插入2bp（AT）。结论 中国人民解放军总医院多重耐药铜绿假单胞菌大多存在主动外排的耐药机制，其耐药与外排泵过度表达相关。