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相似文献
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1.
目的构建人类8型疱疹病毒(HHV-8)基因开放读码框(ORF)73c重组原核表达质粒并诱导表达,获得HHV-8潜伏态相关核抗原重组蛋白,并对其免疫活性进行初步鉴定。方法软件设计引物,分别在引物两端添加特异的酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF73质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增ORF73C基因序列,克隆人原核表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET28a-ORF73c;转化E.coli DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21(DE3),并诱导表达,以多聚组氨酸亲合层析柱纯化,凝胶蛋白电泳、Western印迹方法行表达蛋白的分析和抗原特异性免疫鉴定。结果测序结果表明构建的pET28a-ORF73C原核表达质粒连接正确,插入的ORF73c基因片段为453bp。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)表明ORF73c基因成功表达,在相对分子质量20000处有表达条带;Western印迹分析显示重组蛋白能被卡波济肉瘤患者阳性血清识别,具有良好的抗原性。结论成功构建了pET28a-ORF73C原核表达质粒,获得的纯化HHV-8潜伏态相关核抗原蛋白与卡波济肉瘤患者血清具有特异性识别,显示其作为检测抗原的可能,但其敏感性和特异性则有待进一步的验证。  相似文献   

2.
目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况。结果PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达。结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8。  相似文献   

3.
郭建  石岩  普雄明 《山东医药》2013,53(15):1-3
目的构建人类疱疹病毒8型(HHV-8)基因质粒标准品,以便快速、灵敏、可靠地检测与HHV-8相关疾病患者的病毒载量。方法提取HHV-8基因组DNA,以HHV-8 ORF26为目的基因设计引物,进行PCR扩增;纯化目的片段与pMD19-T Vector连接并转化到大肠杆菌中;提取重组质粒DNA,并行PCR、测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)构建标准曲线。结果 HHV-8ORF26目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,外标准品阈值循环数(Ct)与其相应梯度稀释浓度呈良好的线性关系,扩增效率高。结论成功构建了HHV-8的Real-time FQ-PCR外标准品,可以快速检测样品中的HHV-8载量。  相似文献   

4.
目的表达肺炎支原体ORF6区基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用PCR方法,从肺炎支原体FH株基因组中扩增ORF6区基因,用TA克隆的方法克隆该片断,并以该重组质粒为模板,扩增ORF6区基因,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的蛋白的表达结果。结果获得肺炎支原体ORF6区基因长为1003bp的DNA片段,SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量56.8kDa处有阳性表达条带。免疫印迹显示,该蛋白带能与肺炎支原体阳性血清反应。结论ORF6区基因在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白具有免疫反应性。  相似文献   

5.
目的克隆并原核表达刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)Rhomboid-1(TgROMl)蛋白。方法收集、纯化弓形虫速殖子,用Trizol法提取总RNA,应用RTPCR技术扩增TgROMl基因,回收的PCR产物与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-TgROMl。将重组克隆质粒亚克隆至原核表达载体pGEX一4T—l中,构建重组表达质粒pGEX-4Tl-TgR()M1并转化至Rosetta感受态,用IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了643bp的TgROMl基因,双酶切鉴定重组表达质粒pGEX-4T-1-TgROMl构建正确。SDS-PAGE检测重组表达质粒表达的TgROMl蛋白分子质量约为48ku,Westernblot检测表明该蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论成功克隆了弓形虫ROMl基因并原核表达了具有反应原性的重组TgROMl蛋白,为该蛋白的功能研究奠定了基础。  相似文献   

6.
弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段,克隆至pMD18-T载体;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl,分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠,观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确,并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上,构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白;真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体,分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒  相似文献   

7.
目的克隆犬圆环病毒(Canine circovirus,CanineCV)ORF3基因,制备ORF3的抗体,为研究ORF3的功能奠定基础。方法以CanineCV基因组为模板,PCR扩增编码框ORF3全长序列。将ORF3基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET(28a)-ORF3。重组质粒转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白ORF3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 PCR扩增出CanineCV编码框ORF3片段长度为318bp。构建的重组质粒pET(28a)-ORF3转化DE3后经IPTG诱导5h,表达分子质量单位(Mr)约为15×103蛋白,与预期相符。Western blot显示重组蛋白能被Anti-His标签抗体识别。结论成功构建了pET(28a)-ORF3重组原核表达质粒,并能在大肠杆菌中表达具有免疫反应性的ORF3,为抗ORF3抗体的制备奠定了基础。  相似文献   

8.
目的:构建表达Ⅰ型HEV ORF3-pEGFPN1融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的LO2细胞系.方法:从猕猴胆汁提取RNA,利用RT-PCR及PCR技术从HEV基因组中扩增出ORF3基因片断,EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFPN1真核表达载体,转化DH5a菌株感受细胞,获得阳性重组质粒ORF3-pEGFPN1.将阳性克隆用脂质体法转染LO2细胞系,G418筛选抗性克隆,SDS-PAGE、Western blot 分析鉴定ORF3-pEGFPN1融合蛋白的表达.结果:真核表达质粒转染LO2细胞,SDS-PAGE显示在39.8kD左右蛋白表达量明显高于对照组,Western blot在39.8kD左右有一条强的棕色条带.结论:成功构建ORF3-pEGFPN1真核表达质粒,能在LO2细胞表达融合蛋白,为进一步研究该蛋白生物学功能奠定基础.  相似文献   

9.
目的构建表达戊型肝炎病毒(HEV)ORF3-pXF2RH融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的L02细胞系。方法利用PCR技术从HEV基因组中扩增出ORF3基因片断,HindⅢ/EcolⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pXF2RH真核表达载体,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒ORF3-pXF2RH。将阳性克隆用脂质体法转染L02细胞系,G418筛选抗性克隆,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定ORF3-pXF2RH融合蛋白的表达。结果真核表达质粒转染L02细胞,SDS-PAGE显示在28.5kD左右蛋白表达量明显高于对照组,Western blot在28.5kD左右有一条强的棕色条带。结论成功构建ORF3-pXF2RH真核表达质粒,在L02细胞表达融合蛋白,为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础。  相似文献   

10.
目的克隆家兔C型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建奠定基础。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆C型利钠肽基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD18-T中,用Pst Ⅰ单酶切筛选出负向插入片段,对重组质粒进行鉴定。结果PCR、酶切及测序鉴定证实,家兔C型利钠肽基因全长编码区被准确插入到载体pMD18-T的TA克隆位点中。结论成功克隆家兔c型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建及开展糖尿病足C型利钠肽基因治疗奠定了基础。  相似文献   

11.
目的 构建戊型肝炎病毒(HEV) ORF3真核表达载体pcHEV3并进行初步鉴定.方法 从实验感染HEV新疆株的猕猴胆汁中提取HEV RNA,逆转录法合成HEV cDNA,采用RT-PCR方法扩增HEV ORF3 cDNA片段,将其克隆至载体质粒pcDNA3,构建HEV ORF3真核表达载体,经抗生素初步筛选后,重组阳性载体进行酶切和测序鉴定.结果 从实验感染HEV新疆株的猕猴胆汁中克隆出HEV ORF3全长cDNA片段,经酶切鉴定及DNA测序鉴定,成功构建HEV ORF3蛋白真核表达载体pcHEV3.结论 成功构建HEV ORF3蛋白真核表达载体,为进一步研究HEV ORF3蛋白的功能提供了条件.  相似文献   

12.
目的克隆并原核表达柔嫩艾美尔球虫(Eimeriatenella)微线蛋白4(EtMIc4)的EGF-like结构域。方法收集并纯化柔嫩艾美尔球虫子孢子,用Trizol法提取总RNA,并反转录成cDNA,利用RT-PCR技术扩增EtMIC4EGF-like基因;回收PCR产物,与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-EGF-like,然后亚克隆至原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-EGF-like并转化至Transetta感受态,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了EtMIC4EGF-like(390bp)基因,双酶切鉴定重组表达质粒pET-30a-EGF-like构建正确。SDS-PAGE分析重组EGF-like蛋白的分子质量单位约为30ku,Westernblot显示该蛋白能被鸡抗柔嫩艾美尔球虫血清识别。结论成功构建了pET-30a-EGFlike原核表达质粒,并证明其原核表达产物EGF-like蛋白具有反应原性,为该蛋白的功能研究奠定了基础。  相似文献   

13.
结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。  相似文献   

14.
目的 构建登革病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达。方法 将prM基因亚克隆入真核表达载体 pEGFP -N3,转化大肠杆菌JM 10 9,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定 ,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6 / 36细胞并使其表达 ,利用RT -PCR法检测目的基因的转录 ,Western -blot检测融合蛋白的表达。结果 成功构建了 pEGFP -prM重组质粒 ,RT -PCR证明 prM基因在蚊细胞内的转录 ,Western -blot检测到 prM -GFP融合蛋白的表达。结论 成功构建登革了病毒 prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达 ,为进一步研究细胞内免疫的分子机制及构建转基因蚊虫奠定了基础  相似文献   

15.
目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMDl8-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞,RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA2经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确;转染GRA2基因的细胞,RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA2,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。  相似文献   

16.
目的构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒。方法根据HSP70基因序列,设计合成HSP70基因的引物,PCR扩增HSP70基因片段,克隆入pMD18-T载体,再经酶切、连接等,亚克隆至pcDNA3-ROP2-p30表达重组质粒中,并进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 PCR扩增出长度为916bp的HSP70基因片段,将其克隆到pMD18-T中,成功亚克隆获得pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒。测序结果显示,pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒包含了HSP70蛋白基因完整序列。结论成功构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒,为下一步核酸疫苗的研究奠定了基础。  相似文献   

17.
恙虫病东方体sta56部分基因的克隆和表达   总被引:2,自引:1,他引:2  
目的 构建恙虫病东方体sta56基因的重组表达质粒,并在E.coli中表达Sta56重组抗原。方法 从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段,用TA克隆技术将此大片段克隆,并以重组质粒为模板,扩增编码Sta56抗原亲水氨基酸区的一段长342bp的DNA,插入pProEX HTb载体,转化大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot进行分析。结果 从恙虫病东方体基因组中扩增出sta56基因的ORF,以截短片段构建了重组表达质粒pHTbOt342,SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为15.4kDa,Western blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别。结论 在大肠杆菌中表达的Sta56重组蛋白具有免疫反应性。  相似文献   

18.
目的构建狂犬病毒载体,为新型疫苗研究提供依据。方法将狂犬病毒减毒株SAE基因组分段扩增,然后经逐步拼接得到全基因组克隆,并在其中引入转录终止-起始元件和多克隆位点获得重组质粒pSAETOPO。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和西尼罗病毒prME基因分别克隆至pSAETOPO,然后将带有这两个基因的狂犬病毒全长cDNA切下并克隆至pcDNA3.1(+)载体。将获得的重组质粒pcSAE-GFP和pcSAE-ME转染细胞,分别观察辅助病毒对外源基因表达的影响。结果获得狂犬病毒载体质粒pcSAE-GFP和pcSAE-ME,经酶切分析和序列测定表明所构建克隆是正确的。pcSAE-GFP及pcSAE-ME转染细胞后,在辅助病毒存在下可表达相应外源基因。结论构建的狂犬病毒载体质粒可表达外源基因,为进一步获得表达外源基因的重组狂犬病毒奠定了基础。  相似文献   

19.
目的研究日本血吸虫翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的生物学功能.方法根据已公布的日本血吸虫TCTP(SjTCTP)基因序列设计引物,从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出TCTP基因ORF序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.O中.结果通过PCR扩增、双酶切及测序鉴定证实重组质粒pcDNA3.O-TCTP已正确插入SjTCTP基因ORF序列,该序列具有TCTP特征性TCTP1和TCTP2结构.结论 SjTCTP基因真核表达质粒构建成功,为研究SjTCTP基因的生物学功能打下基础.  相似文献   

20.
目的 构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒,分析其表达状况。 方法 采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列,经克隆后,亚克隆至原核表达载体中,构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒,分析GRA8的表达;将各重组菌进行诱导,将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白,免疫印迹法(Western blotting)分析纯化蛋白的活性。 结果 GRA8基因被正确插入原核表达质粒中,原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低,几乎无完整GRA8的表达,截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。 结论 GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低,纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。  相似文献   

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