诱导多能干细胞的研究

干细胞（stem cell）不仅可用于细胞分化、基因表达调控、胚胎发育等生物发育机制的研究,而且可应用于药物研制、细胞替代治疗和基因治疗等研究。一直以来都是生命科学领域的研究热点。根据细胞来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）通常指源自囊胚内细胞团的细胞,具有体外高度自我更新的能力并可被诱导分化为体内各种细胞类型。它们多取自人工流产的早期胎儿或是体外受精中剩余的胚胎,材料的不易获得影响了研究的开展。     

诱导多能干细胞与神经退行性疾病

神经退行性疾病,包括帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症等的共同特征是在中枢神经系统的不同部位发生特发性神经元丢失.这些神经元的丢失给病人造成了一系列相应的功能障碍.应用人类胚胎干细胞进行细胞替代治疗曾引起人们很大的兴趣,但是一些伦理学问题阻碍了该研究的发展.通过导入特定的转录因子,体细胞能够被诱导为具有胚胎干细胞...     

诱导神经干细胞与诱导多能干细胞在同源宿主脑内的致瘤性及免疫原性研究

目的对比研究诱导神经干细胞（iNSCs）与诱导多能干细胞（iPSCs）在同源宿主脑内的致瘤性及免疫原性。 方法采用脑立体定向仪将1×10⁶个C57BL/6（B6）小鼠胚胎干细胞（ESCs）、iPSCs、神经干细胞（NSCs）及iNSCs分别移植到健康成年B6小鼠大脑运动皮层。于移植后14 d、28 d处死动物,取材进行形态学研究。 结果IPSCs和ESCs均可在小鼠脑内形成肿瘤导致组织坏死和免疫细胞浸润。然而,在iNSCs和NSCs移植组内,本研究未观察到肿瘤形成、脑损伤及免疫排斥反应。 结论INSCs移植物不具有致瘤性和免疫原性,因而较iPSCs移植物更安全。     

神经干细胞的研究进展

干细胞（stem cell，SC）是上世纪生物医学领域的重大发现，干细胞的概念是Evans在20世纪80年代提出，是指有多种分化潜能和自我更新能力的细胞。按分化潜能的大小，干细胞可分为三种类型：全能干细胞（胚胎干细胞）、单能干细胞、多能干细胞。神经干细胞即为多能干细胞，指可生成神经组织或起源于神经系统，具有自我更新能力并具有演化为不同成熟细胞潜能的细胞，90年代Roybholds等怛。从成年鼠脑纹状体中首次分离出神经干细胞（neural stem cell，NSC）。随着对神经干细胞的深入研究，突破了以往一直认为成年哺乳动物神经元不能再生的观念，而且通过基因修饰还可用于神经系统的基因治疗，表达外源性的神经递质、神经营养因子及代谢性酶，为许多难治性神经系统疾病开辟了一条全新的治疗途径。     

脑组织移植和神经干细胞研究进展

综述了近年来广泛开展的神经组织和细胞移植的各种主要方法及其进展。着重对神经干细胞这一神经科学的前沿课题进行了详细的复习。并对神经干细胞的研究方法,神经营养因子和神经干细胞的关系,神经干细胞的分化诱导及共临床方面的应用前景作了阐述。     

大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究

目的：探索大鼠神经干细胞在胚胎脑内的分布特点,并用三种不同的方法对干细胞进行克隆化培养。方法：对胚龄16天左右的大鼠胚胎脑组织做连续冠状位冰冻切片,特异的抗nestin免疫组化染色,以显示干细胞在胚胎的分布特点。我们还把胚龄16天左右的胎鼠室管膜下脑进行原代及传代培养,传代的神经干细胞用三种方法有限稀释法,饲细胞克隆培养法,软琼脂克隆培养法进行克隆培养。结果：1．神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位如：脑室、脑室下区,中脑导水管周围。神经干细胞多表现为复层上皮样排列,细胞突起呈放射状伸向脑的表层并之与保持密切联系。有的干细胞在离室管膜较远处呈簇状分布好似群状迁移的干细胞群也好似干细胞的发生中心。2．干细胞的原代及传代培养显示：神经细胞易呈聚集状生长的特点及神经细胞的迁移性的生长特点,各细胞群之间有密切的纤维联系。3．神经细胞生长的细胞密度依赖效应与细胞之间的接触在生长发育中的重要作用。结论：神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位,软琼脂克隆法是一种成功的干细胞克隆方法。     

神经干细胞分化与bHLH转录调控因子

近年来,许多bHLH转录调控因子被克隆。研究揭示,bHLH转录调控因子参与了中枢神经系统神经干细胞的分化。根据bHLH转录调控因子在神经分化过程中的作用,它们可分为决定因子和分化因子。此外,有负调控因子调控bHLH蛋白参与神经干细胞分化。     

小鼠胚胎干细胞体外向神经干细胞的分化研究

目的观察无血清培养法诱导小鼠胚胎干细胞(Embryome stem cell,ESCs)ESCs体外分化为神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)的诱导效率.方法采用无血清培养法诱导小鼠ESCs体外分化为NSCs,对诱导不同时间点的细胞行免疫荧光,RT-PCR检测nestin的表达.结果诱导48 h开始出现nestinmRNA的表达,诱导72 h出现nestin蛋白表达.诱导120 h nestin的表达达高峰,阳性细胞率为(70.3±8.02)%.Nestin阳性细胞呈球形生长,可不断增殖.结论本诱导方法可获得较高纯度的NSCs,所获得的神经干细胞与脑内来源的NSCs有相似的生物学特性.     

脊髓小脑性共济失调干细胞移植治疗进展

脊髓小脑性共济失调(SCA)是一组常染色体显性遗传的,以进行性神经退行性变为特征的遗传异质性疾病,主要表现为进行性小脑共济失调,可严重影响患者生活质量,目前缺乏足够有效的治疗方案。干细胞具多项分化潜能,研究表明移植干细胞可分化并替代相应受损细胞,重建神经元回路,并发挥非特异性营养作用,以此达到抑制神经变性,促进神经再生的目的。本篇综述旨在系统阐述SCA干细胞治疗的进展及仍需面临的挑战。     

Neural grafting for Parkinson's disease: challenges and prospects

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative condition which causes a characteristic movement disorder secondary to loss of dopaminergic neurons in the substanitia nigra. The motor disorder responds well to dopamine-replacement therapies, though these result in significant adverse effects due to non-physiolog-ical release of dopamine in the striatum, and off-target effects. Cell-based regenerative treatments offer a potential means for targeted replacement of dopamine, in a physiological manner. Dopaminergic neurons for cell-based therapies can be obtained from several sources. Fetal ventral mesencephalon tissue contains dopaminergic neuron progenitors, and has been transplanted into the striatum of PD patients with good results in a number of cases. However, the ethical implications and logistical challenges of using fetal tissue mean that fetal ventral mesencephalon is unlikely to be used in a widespread clinical setting. Induced plu-ripotent stem cells can be used to generate dopaminergic neurons for transplantation, providing a source of autologous tissue for grafting. This approach means that challenges associated with allografts, such as the potential for immune rejection, can be circumvented. However, the associated cost and difficulty in producing a standardized product from different cell lines means that, at present, this approach is not com-mercially viable as a cell-based therapy. Dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells offer the most promising basis for a cell-based therapy for Parkinson's disease, with trials due to commence in the next few years. Though there are ethical considerations to take into account when using embryonic tissue, the possibility of producing a standardized, optimized cell product means that this approach can be both effective, and commercially viable.     

神经干细胞移植治疗暂时性脑缺血的实验研究

目的:探讨神经干细胞移植治疗暂时性脑缺血的价值。方法:从孕14 d SD胎鼠海马组织中分离培养出神经干细胞,将BrdU标记的神经干细胞经立体定向移植到SD大鼠暂时性大脑中动脉梗死模型(tMCAO)纹状体缺血半暗区。移植后2～12周以神经损害严重程度评分(NSS)评价各组动物神经功能状况。移植后12周,免疫荧光染色观察移植后神经干细胞的分化、迁徙和整合情况。结果:分离和纯化出大鼠胚胎神经干细胞,呈nestin阳性,并具有自我更新及多向分化潜能。移植后的神经干细胞在宿主脑内迁徙,部分分化并表达神经元特异性标记Neurofilament。移植后8周起,神经干细胞移植组大鼠NSS评分明显低于其他2组。结论:神经干细胞移植能改善缺血后大鼠的神经功能状况。     

红景天苷和脑源性神经营养因子与神经干细胞共移植对致鼠神经干细胞定向分化的研究

目的：探讨红景天苷和脑源性神经营养因子（BDNF）、神经干细胞（NSCs）共移植对致鼠NSCs定向分化影响。方法：将戊四氮致大鼠分为模型组、NSCs组、NSCs＋BDNF组和NSCs＋BDNF＋红景天苷组。取新生大鼠海马组织,将培养的NSCs与BDNF＋红景天苷＋BDNF和基础培养基分别移植至致鼠海马组织中,苏木精-伊红染色及免疫组化检测不同时间点5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）、谷氨酸脱羧酶（GAD65）阳性细胞数,并观察大鼠行为学改变。结果：NSCs＋BDNF＋红景天苷共移植组与其他组比较,各时间点BrdU、GAD65阳性细胞数均增多（P〈0.05）。第3周开始,大鼠癫发作次数最少（P〈0.05）。结论：BDNF与红景天苷联合有利于神经干细胞向γ-氨基丁酸能神经元分化。两者联合移植至致鼠后能减少大鼠的癫发作次数。     

不同冻存液对人诱导性多能干细胞冻存与复苏效果的影响

目的:探讨不同冻存液对人诱导性多能干细胞(iPSC)冻存复苏后的存活率及诱导分化的影响,筛选出简单有效的冻存与复苏方法。方法:人iPSC培养至第3代后分组冻存:①含有不同配比胎牛血清(FBS)的细胞冻存液分组:A组[80%培养基(DMEM/F12)+10%FBS+10%二甲亚砜(DMSO)];B组(70%DMEM/F12+20%FBS+10%DMSO);C组(40%DMEM/F12+50%FBS+10%DMSO);D组(90%FBS+10%DMSO)。②含有不同配比DMSO的细胞冻存液分组:E组(45%DMEM/F12+50%FBS+5%DMSO);F组(40%DMEM/F12+50%FBS+10%DMSO);G组(35%DMEM/F12+50%FBS+15%DMSO);H组(30%DMEM/F12+50%FBS+20%DMSO)。以相同方法冻存并复苏人iPSC,观察比较不同组细胞在复苏14 d后重新形成典型干细胞集落的数量,并在相同诱导分化体系下,记录复苏人iPSC向神经元和胶质细胞分化的效率。结果:C和F组细胞复苏后形成典型干细胞集落的数量多于其他组(P<0.05),A和B组细胞复苏后分化为神经元的效率略高于其他实验组。结论:以40%DMEM/F12+50%FBS+10%DMSO配比组合成的细胞冻存液作为人iPSC的冻存保护剂,可使人iPSC的冻存复苏效率最优并保持较好的生物学特性。     

VEGF在人胚胎干细胞向神经元分化中作用的研究

目的观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在人胚胎干细胞分化为神经元过程中是否发挥作用及相关机制。方法人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,分为3组：A组为常规诱导组,B组为常规诱导＋VEGF（10ng／mL）作用组,C组为常规诱导＋VEGF（10ng／mL）＋VEGFR2／Fc嵌合体（10ng／mL）作用组;用RT-PCR、免疫荧光法检测各阶段细胞标志物,计算并用流式细胞仪检测各组不同阶段细胞阳性率。结果用RT-PCR分别检测到OCT4、Nestin、MAP2表达;免疫荧光法检测显示B组产生神经干细胞、分化为神经元的阳性率明显高于A、C两组,差异有统计学意义（P〈0．01）,A、C两组之间无显著性差异（P〉0．05）;流式细胞仪检测与免疫荧光法相似。结论人胚胎干细胞体外分化过程中血管内皮生长因子通过血管内皮生长因子受体2来促进神经干细胞增殖及向神经元分化。     

神经干细胞移植促进脑出血大鼠功能恢复

目的:观察胎鼠神经干细胞体外的生长、分化及移植到脑出血大鼠后的存活、迁徙、分化情况。研究神经干细胞对脑出血后神经功能损害的可能修复作用。方法:通过尾状核内注射自体动脉血制作大鼠脑出血模型。分离、培养大鼠胎鼠神经干细胞并移植于成年大鼠尾状核,对大鼠脑出血后的神经恢复情况进行功能评价。结果:神经干细胞可以在宿主脑内存活、迁徙和分化,神经干细胞移植组大鼠运动功能较对照组明显改善。结论:神经干细胞移植能促进改善大鼠脑出血的神经功能恢复。     

Enrichment of Neurons and Neural Precursors from Human Embryonic Stem Cells

Human embryonic stem (hES) cells proliferate and maintain their pluripotency for over a year in vitro (M. Amit, M. K. Carpenter, M. S. Inokuma, C. P. Chiu, C. P., Harris, M. A. Waknitz, J. Itskovitz-Eldor, and J. A. Thomson. 2000. Dev. Biol. 227: 271-278) and may therefore provide a cell source for cell therapies. hES cells were maintained for over 6 months in vitro (over 100 population doublings) before their ability to differentiate into the neural lineage was evaluated. Differentiation was induced by the formation of embryoid bodies that were subsequently plated onto appropriate substrates in defined medium containing mitogens. These populations contained cells that showed positive immunoreactivity to nestin, polysialylated neural cell adhesion molecule (PS-NCAM) and A2B5. After further maturation, these cells expressed additional neuron-specific antigens (such as MAP-2, synaptophysin, and various neurotransmitters). Calcium imaging demonstrated that these cells responded to neurotransmitter application. Electrophysiological analyses showed that cell membranes contained voltage-dependent channels and that action potentials were triggered by current injection. PS-NCAM and A2B5 immunoselection or culture conditions could be used to produce enriched populations (60-90%) which could be further differentiated into mature neurons. The properties of the hES-derived progenitors and neurons were found to be similar to those of cells derived from primary tissue. These data indicate that hES cells could provide a cell source for the neural progenitor cells and mature neurons for therapeutic and toxicological uses.     

发育期癫大鼠移植骨髓源性神经干细胞对海马BDNF和bFGF表达的影响

目的将骨髓源性神经干细胞(BMSCs)移植到发育期癫大鼠海马区,观察大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)表达的变化。方法选择21日龄发育期大鼠,分离大鼠骨髓基质细胞,在特定条件下培养使其诱导分化为神经干细胞(NSC)。建立戊四氮(PTZ)点燃癫大鼠模型,将BMSCs经侧脑室注射移植至癫大鼠海马区;侧脑室注射磷酸缓冲液(PBS)作为对照。分为4组(均n=8):对照组(无癫发作),PTZ致组(癫造模,无治疗),假手术组(癫+PBS侧脑室注射),治疗组(癫+NSC侧脑室注射)。于3、7和14 d处理后用免疫组化法检测大鼠海马区BDNF和bFGF表达。结果致组大鼠海马区(齿状回、CA1区)BDNF和bFGF表达较对照组增加(P0.05),治疗组海马区(齿状回、CA1区)BDNF和bFGF表达较假手术组也有所增加(P0.05)。结论 BMSCs移植可以增加PTZ致大鼠海马BDNF和bFGF表达,从而发挥对癫后脑损伤的保护作用。     

人胚胎干细胞神经分化过程中VEGF作用机制的研究

目的观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对人胚胎干细胞分化为神经元的促进作用是否与Notch信号通路有关。方法人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,并分为3组:A组为常规诱导组;B组为常规诱导+VEGF(10ng/ml)作用组;C组为常规诱导+γ-分泌酶抑制剂预处理+VEGF(10ng/ml)作用组。用免疫荧光法检测及计算各组不同阶段细胞阳性率,半定量RT-PCR观察各组神经干细胞Hes1 mRNA表达,MTT法检测3组神经干细胞增殖速率。结果免疫荧光法检测显示,B组产生神经干细胞的阳性率明显高于A、C两组,差异有统计学意义(P0.01),A、C两组之间无显著性差异(P0.05);B、C两组进一步分化为神经元的阳性率均明显高于A组,差异有统计学意义(P0.01),B、C两组之间无显著性差异(P0.05);半定量RT-PCR观察显示B组神经干细胞Hes1 mRNA表达明显高于A、C两组;MTT法检测与半定量RT-PCR结果相似。结论人胚胎干细胞体外分化过程中血管内皮生长因子通过激活Notch信号通路,促进神经干细胞增殖,而VEGF在神经干细胞向神经元分化中的作用与Notch通路无关。     

神经生长因子对神经干细胞发育的调节

神经生长因子作为神经营养因子家族的成员之一，在神经系统中分布广泛。其除具备营养神经元、保护和修复受损神经等生物学效应外，对神经干细胞的增殖、存活、迁移和分化等过程也具有一定的影响。