酵母双杂交技术筛选肺癌组织中MCM7蛋白结合蛋白

背景与目的 微小染色体维持蛋白(mini-chromosome maintenance proteins,MCM)MCM7为MCM复合体成员之一,在启动DNA复制、合成中起关键作用,但对能够与其结合的蛋白所知甚少.本研究应用酵母双杂交方法筛选肺癌组织中MCM7蛋白的结合蛋白.方法构建MCM7全长cDNA-pGBKT7质粒,与含肺癌组织cDNA文库-pACT2质粒转化酵母AH109,在涂有X-a-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长,挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌提取质粒DNA后测序,进行生物信息学分析.结果 筛选出11种与MCM7蛋白特异性相互作用的蛋白,其中细胞骨架蛋白5种,各种酶、激酶以及相关受体6种.结论 克隆到的基因对进一步研究MCM7蛋白的功能有一定提示作用.     

利用酵母双杂交系统筛选NKD1结合蛋白质

目的:酵母双杂交技术筛选结肠癌细胞中与裸角质层同源蛋白1(naked cuticle homolog 1,NKD1)相互结合的蛋白质,从而进一步了解NKD1.方法:以结肠癌细胞SW480的cDNA为模板,克隆NKD1基因,并将其成功构建在pGBKT7诱饵载体上.利用酵母双杂交技术从结肠癌SW480细胞文库进行筛选.结果...     

应用酵母双杂交筛选人胃癌耐药细胞SIVA-1基因相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交筛选人胃癌耐药细胞中与SIVA-1基因相互作用的蛋白。方法:构建人胃癌耐药细胞的cDNA文库,运用酵母双杂交及体外免疫共沉淀实验方法筛选SIVA-1相关作用蛋白,探讨其对胃癌耐药细胞耐药性的影响机制。结果:成功构建人胃癌耐药细胞cDNA文库,滴度为4.78×106 cfu/mL,重组率>95%,扩增后滴度达9.50×109 pfu/mL,成功构建诱饵表达载体pGBKT7-SIVA-1,且经自激活检测表明重组诱饵载体pGBKT7-SIVA-1不具有自激活性。经过初筛,我们获得能同时激活三个报告基因（Ade2、His3、LacZ）的阳性克隆21个,随后将21个阳性克隆进行质粒抽提、扩增并进行酵母回转实验,最终获得4个与SIVA-1截短体相互作用的阳性候选克隆。对这四个文库插入片段进行基因测序,最终得到2个不同的与SIVA-1相互作用的蛋白:UXT（泛表达转录子）和PCBP1（多聚胞嘧啶结合蛋白1）。经体外免疫共沉淀实验后,最终筛选出与胃癌耐药细胞SIVA-1相互作用的PCBP1。结论:PCBP1与SIVA-1之间存在蛋白相互作用关系。     

酵母双杂交筛选NGAL相互作用蛋白

目的：中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白（neutrophil gelatinase-assiociated lipocalin，NGAL）功能不明，籍筛选与之相互作用蛋白，构筑相互作用图谱，为揭示其功能提供新途径。方法：利用蛋白质相互作用原理，应用酵母双杂交技术，构建pGBKT7-NGAL载体，以NGAL为诱饵，在人类骨髓cDNA文库中筛选与之相互作用蛋白的基因。结果：通过酵母交配筛库、一对一验证和β-gal分析筛选出40个阳性克隆；测序．利用网上数据库（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov）对序列进行比对．初步确定了31种基因．其中11种为未知基因，20种为已知基因。已知基因中舍有编码区的有LGALS1、MT2A、COX1、RNP24、ATP1R3、IGL、IGH、VDJ、RARRES2、GYPA、NEB和NPC2。结论：筛选得到31种可能与NGAL相互作用蛋白的基因．这为研究NGAL功能及作用机制提供了新途径。     

酵母双杂交筛选NGAL相互作用蛋白

目的:中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋 白(neutrophilgelatinase assiociatedlipocalin, NGAL)功能不明,籍筛选与之相互作用蛋白, 构筑相互作用图谱,为揭示其功能提供新途径。 方法:利用蛋白质相互作用原理,应用酵母双杂 交技术,构建pGBKT7 NGAL载体,以NGAL 为诱饵,在人类骨髓cDNA文库中筛选与之相 互作用蛋白的基因。结果:通过酵母交配筛库、 一对一验证和β gal分析筛选出40个阳性克 隆;测序,利用网上数据库(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)对序列进行比对,初步确定了31 种基因,其中11种为未知基因,20种为已知基 因。已知基因中含有编码区的有LGALS1、 MT2A、COX1、RNP24、ATP1B3、IGL、IGH VDJ、RARRES2、GYPA、NEB和NPC2。结论: 筛选得到31种可能与NGAL相互作用蛋白的 基因,这为研究NGAL功能及作用机制提供了 新途径。     

酵母双杂交法筛选与受翻译调节的肿瘤蛋白相互作用的蛋白

目的:采用酵母双杂技术筛选与受翻译调节的肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)相互作用的蛋白,以探讨TCTP的生物学功能。方法:采用PCR法扩增获得TCTP基因,并将其插入酵母双杂交诱饵载体中构建获得pDEST32-TCTP;检测pDEST32-TCTP在酵母菌中的表达和自激活情况,利用酵母双杂交系统筛选出带有靶蛋白基因的阳性克隆并测序鉴定;免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)法验证人肝癌细胞Huh7中TCTP与细胞S期激酶相关蛋白-2(S-phase kinase-associated protein2,Skp2)的相互作用。结果:成功构建获得酵母双杂交诱饵载体pDEST32-TCTP,pDEST32-TCTP在酵母菌中可以表达,且在3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3AT)浓度为20mmol/L时无自激活作用。采用酵母双杂交系统共筛选获得6个可与TCTP相互作用蛋白的基因,包括Smad4、人热休克蛋白60(heat shock protein60,HSP60)、TAKl、Bcl-xl、卵泡抑素(follistatin,FS)和Skp2。其中Skp2与TCTP蛋白的相互作用在Co-IP中得到验证。结论:应用酵母双杂交系统可筛选获得一组与TCTP相互作用的蛋白,为进一步研究TCTP的生物学功能提供了可靠的实验依据。     

酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活效应的检测

目的:构建并转化酵母双杂交体系中“诱饵”载体pGBKT7-cide-3以便用于人肝cDNA文库的筛选.方法:用RT-PCR方法从人肝细胞株QZG中扩增cide-3基因全外显子片段,并定向克隆入细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7中;用PEG/LiAC法将pGBKT7-cide-3转化感受态酵母菌AH109.提取转化酵母菌的质粒DNA和总蛋白进行鉴定.同时检测表达产物对报告基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性.结果:成功扩增出人cide-3 cDNA片段,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pGBKT7-cide-3;获得可在色氨酸缺陷培养基(SD/-Trp)上生长含pGBKT7-cide-3的酵母菌克隆.鉴定表明pG-BKT7-cide-3已转化入酵母菌AH109,无自主激活报告基因的能力及对酵母的生长无毒性.结论:酵母双杂交“诱饵”载体pGBKT7-cide-3构建获得成功,可应用于酵母双杂交体系.     

胃癌患者原癌基因和抑癌基因的表达谱研究

目的：用基因表达谱苡片对人正常胃和胃癌组织原癌和抑癌基因表达的差异进行研究比较。方法：利用胃和胃癌组织的mRNA通过逆转录方法，将Cy3和Cy52种荧光分别标记到2组cDNA上制成探针，然后和表达谱芯片进行杂交后扫描，通过计算机分析判定2种基因是否在上述组织中存在差异表达。结果：在195条原癌及抑癌基因中，存在差异表达的共13条，表达上调的6条（0.071%)。表达下调的7条（0.083%)。结论：认为应用这种方法识别出的2种基因对胃癌的诊断和治疗具有重要的潜在价值。     

食管癌相关基因1编码蛋白的相互作用蛋白筛选

目的　筛选与食管癌相关基因 1(ECRG 1)编码蛋白相互作用的蛋白 ,为其功能研究奠定基础。方法　将编码ECRG 1羧基端 378个氨基酸的DNA序列插入到pGBKT7 DNA BD载体 ,与编码Gal4DNA结合结构域的DNA序列拼接做融合基因 ,将此重组质粒与已克隆到pACT2载体上的人肝脏cDNA文库 (与编码Gal4激活结构域的DNA序列融合 )共转化酵母细胞AH10 9。ECRG 1与相应的人肝脏cDNA片段编码的蛋白发生相互作用后 ,可激活报告基因的表达。排除假阳性后 ,阳性克隆中的文库cDNA进行测序分析。同源性检索搜寻GenBank中与之相同或相似的序列。结果　共转化得到约 3× 10 6个转化子 ,2 3个克隆有报告基因的表达。排除假阳性后 ,得到 2个阳性克隆 ,它们分别编码Miz 1(myc interactingznfingerprotein 1)和FLNA(actin bindingprotein 2 80 )。结论　ECRG 1基因编码蛋白在酵母中可特异性的结合Miz 1和FLNA ,提示ECRG 1可能通过与MIZ 1、FLNA相互作用参与调控细胞周期的运行。     

三种癌基因蛋白的表达在宫颈癌放疗中的预后价值研究

 目的 研究P53、c-myc、bcl-2三种癌基因蛋白的表达在宫颈癌放疗中的预后价值。方法 采用免疫组化ABC法检测叙例放疗未控以及与之配对的40例放疗治愈的宫颈癌患者中三种癌基因蛋白的表达。结果 未控组和治愈组产表达无明显差异（52．5％VS42.5％,P＞0．05）,未控组中C－myc表达明显高于治愈组（72．5％VS42．5％,P＜0．01）bcl－2表达却明显低于治愈组（20．0％VS45．0％,P＜0．05）。结论 放疗前检测宫颈癌活检标本中心c-myc、bcl-2蛋白的表达可作为判断预后的参考指标。     

鸟苷酸交换因子ARHGEF 10功能鉴定及其与肿瘤恶性表型间的关系研究

目的 Dbl家族鸟苷交换因子(GEFs)是Rho家族蛋白发生恶性转化的主要调控单位,它通过使Rho蛋白从无活性的GDP形式转换为GTP形式的Rho蛋白而发挥作用。本研究对一个GEF分子-ARHGEF 10进行了结构和功能上的初步探究,对该分子在肿瘤发展过程中扮演的角色进行讨论。方法 Realtime PCR对ARHGEF 10在人体42种正常组织中的表达情况进行了测定;GST-pulldown技术对ARHGEF 10的体内GEF活性进行了检测;双荧光素酶报告基因检测技术对下游小分子进行转录因子活性检测;应用免疫荧光双染标记法完成了高表达ARHGEF 10对正常细胞骨架形态的影响;在细胞表型实验中分别使用CCK8法、Transwell法及软琼脂克隆形成实验检测了高表达ARHGEF 10对细胞增殖侵袭迁移及体外成瘤能力的影响。结果 生物信息学分析结果显示ARHGEF10分子量为156kD,具有典型的Dbl家族分子结构域,在肺组织中表达量最高,能够促使正常成纤维细胞中的应力纤维(Stress fiber)增多,同时促进细胞增殖、侵袭及克隆形成,体外转录因子活性检测发现该基因可能与JAK/STAT通路有关。结论 ARHGEF 10是一个典型的鸟苷交换因子家族分子,能激活Rho家族分子RhoA,具有明显的癌基因特征。     

On the Incidence of Yeast Species from Human Sources in Finland

Summary: A survey from Finland of 2003 positive yeast isolates, obtained from vaginal discharge during a 17-year-period 1960—1976 is presented. The total number of different species is 36, 25 of which are only occasionally seen. Candida albicans is by far the commonest species, 1274 isolates out of 2003 (63.6 %). Among other yeasts there are Torulopsis glabrata in 187, Saccharomyces cerevisiae in 105, C. krusei in 87, C. guilliermondii in 67, C. parapsilosis in 51, T. Candida in 32, C. tropicalis in 15, and Trichosporon cutaneum in 6 isolates. Pityrosporum orbiculare and P. ovale were frequently present but often overlooked. Some 35 yeast strains remained unidentified. The vaginal flora is on the whole rather poor in species, and more than two or three different species are seldom seen simultaneously on the scene. Zusammenfassung: Innerhalb eines Zeitraumes von 17 Jahren (1960—1976) wurden im Mykologischen Labor der Universitäts-Hautklinik in Turku, Finnland, 2003 positive Hefeproben aus vaginalem Fluor analysiert. Insgesamt wurden 36 verschiedene Arten gefunden, die Mehrzahl (25) derselben zwar nur ganz sporadisch als Einzelbefunde. In 1274 Proben (63,6%) konnte Candida albicans kulturell nachgewiesen werden. Von anderen Arten sind zu nennen Torulopsis glabrata in 187 Proben (9 %), Saccharomyces cerevisiae in 105 (5 %), C. krusei in 87 (4 %), C. guilliermondii in 67, C. parapsilosis in 51, T. Candida in 32 und C. tropicalis in 15 Proben. Pityrosporum orbiculare und P. ovale wurden während mehrerer Jahre ganz übersehen. Sie kommen in der Vulva und Vagina recht häufig vor. Die Mykoflora der Vagina scheint nicht sehr artreich zu sein. Das gleichzeitige Zusammentreffen von mehr als zwei oder drei verschiedenen Hefearten sieht man wohl nur selten.     

酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X 蛋白是一个广义反式作用因子,同原发性肝癌的发生发展密切相关,由于其功能同蛋白-蛋白间相互作用有关,故本研究利用酵母双杂合体系筛选并鉴定HBV X 蛋白结合蛋白。     

A Simple and Useful Method for Simultaneous Screening of Elevated Levels of Expression of a Variety of Oncogenes in Malignant Cells

Abnormal expression of various oncogenes has been implicated in the development of many malignant tumors. Although RNA blotting methods have been used to measure abnormal expression, they involve the time-consuming process of individually labeling the oncogene probes. To simplify this process we have attempted to develop a new method, termed simultaneous screening, which is based on the synthesis of radiolabeled cDNA corresponding to the mRNA population of malignant cells and on hybridization with various oncogene probes, immobilized on a membrane filter. This method circumvents the time-consuming process of the prevailing RNA blotting methods and is also sensitive enough to detect accurately a five- to ten-fold level of expression of rare mRNA (∼10 copies per cell). Overexpression of ten oncogenes was detected in a variety of malignant cells and mitogen-stimulated cells with this method. These results suggest that our simultaneous screening method can be used to examine the overexpression of oncogenes.     

卵巢癌差异表达基因2氨基端PID结构域相互作用蛋白的筛选

目的〖HT5"SS〗： 筛选人卵巢癌差异表达基因2(differentially expressed in ovarian cancer 2, DOC2)氨基端磷酸酪氨酸作用结构域PID (nDOC2)的相互作用蛋白质,为研究DOC2作用的信号通路提供线索。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 将含有人DOC2氨基端PID结构域cDNA的片段插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母菌AH109并在其内表达,然后转化人胎脑cDNA文库,在营养缺陷培养基和Xα半乳糖苷酶（X     

Molecular Landscape and Computational Screening of the Natural inhibitors against HPV16 E6 Oncoprotein

Background: Human Papillomavirus (HPV) is a small, non-enveloped, icosahedral and double-stranded DNA virus with a genome of 8 kb, belonging to the papillomaviridae family. HPV has been associated with 99.7% cases of cervical squamous cell carcinoma worldwide. The HPV E6 protein is known as a potent oncogene and is closely allied with the events that result in the malignant transformation of virally infected cells. Objective: The present study aims to target plant derived anticancer molecules for HPV driven cancer using a computational approach. Methods: In this study, E6 oncoprotein was targeted by 101 plant-derived nutraceuticals using the molecular docking method. The multiple sequence analysis and phylogenetic analysis of low risk and high risk 28 HPV E6 proteins were performed. Results: Withanolide D, Ginkgetin, Theaflavin, Hesperidin, and Quercetin-3-gluconide were identified as the potential inhibitors of HPV 16 E6 protein. The zinc finger domain was identified on all variants of HPV E6 oncoprotein while high-risk HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV58, HPV68 and HPV73: probable risk HPV53 and low-risk HPV43 and HPV70 contain PDZ domain. Conclusion: The current study using bioinformatics analysis approaches reveals a promising platform for developing anti-cancerous competitive inhibitors targeting HPV.