甲氨蝶呤对映体诱导肺癌细胞耐药后引起血管内皮细胞分化差异的研究

目的 研究甲氨蝶呤(MTX)对映体大剂量冲击作用肺癌A549细胞后,MTX对映体耐药细胞血管分化是否具有手性选择性.方法 用大剂量冲击法诱导获得A549对映体耐药肺癌细胞,流式细胞双色分析细胞CD44/CD31以及P-170表达;皮下接种裸鼠,成瘤后取瘤体切片,进行CD34组化染色,计数新生微血管密度(MVD).以A549亲本细胞(未获得耐药)作为对照组.结果 分别建立耐药浓度为15 μmol/L的L-MTX和D-MTX的A549耐药细胞株;它们与各自对映体的耐药指数分别为12.4±1.2和20.1±2.3;A549亲本细胞、L-MTX耐药细胞和D-MTX耐药细胞中:CD31+阳性率分别为55.5%±9.7%、32.9%±8.0%和91.9%±3.2%,差异有统计学意义(F=511.92,P=0.000);P-170阳性率分别为85.5%±4.6%、71.5%±8.2%和87.0%±8.9%,L-MTX耐药细胞P-170的阳性率低于D-MTX耐药细胞(t=6.13,P=0.002);3种细胞植入裸鼠成瘤后切片免疫标记CD34统计新生MVD,A549亲本细胞为3.6±1.2,L-MTX耐药细胞为7.2±1.7,D-MTX耐药细胞为55.9±11.9,D-MTX耐药细胞显著高于L-MTX耐药细胞(t=13.37,P=0.000).结论 MTX对映体诱导肺癌A549耐药细胞向血管内皮细胞分化能力不同,D-MTX耐药细胞经血管转移高于L-MTX耐药细胞,这提示MTX制剂中D型组分不能简单当成污染物而忽视,应尽量选用单一对映体的L-MTX药物制剂,减少D-MTX带来的副作用.     

氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞株中叶酰聚谷氨酸合成酶mRNA和蛋白表达

目的 探讨叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)在氨甲蝶呤(MTX)对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药A549细胞株中的表达.方法 通过FQ-PCR和Western blot法分别测定肺癌A549细胞株和15μmol/L L-(+)-MTX和D-(-)-MTX两种耐药A549细胞株中FPGS mRNA和蛋白表...     

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和多药耐药相关蛋白基因在膀胱癌中的表达及相关性分析

为探讨γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)及多药耐药相关蛋白(MRPs)与膀胱癌化疗耐药的关系,应用逆转录多聚酶链式反应(Rt-PCR)技术检测了32例膀胱癌及其癌周正常膀胱粘膜上γ-GCS亚单位γ-GCSh、γ-GCS1以及MRPs家族成员MRP1和MRP2的mRNA的表达,并以β-actin mRNA为内对照半定量进行相关分析.结果显示:γ-GCSh、γ-GCSl、MRP1和MRP2mRNA在癌组织的平均相对表达水平均高于其在正常粘膜的表达;γ-GCSh和MRP1在化疗复发病例的癌组织的平均表达水平明显高于在未接受过任何化疗的初发病例,同时显示两者在癌组织的表达具有较强的相关性(r=0.786,P＜0.01).提示:正常细胞的恶性化可上调γ-GCS和MRPs的表达;膀胱癌临床化疗耐药的形成与γ-GCSh和MRP1的过表达密切相关,两者的相关性表达提示两者之间可能存在共同的调节机制.     

BTG2基因重组慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达与功能

目的 构建重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并检测其转染肺癌A549细胞后的表达与功能. 方法 通过PCR技术以含B细胞转位基因(BTG2)的cDNA克隆质粒(HsCD00330081)为模板获得BTG2基因片段,将此片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,形成pCDH-BTG2,转染PC3细胞检测BTG2的表达;将重组慢病毒载体质粒pCDH-BTG2包装成重组慢病毒颗粒,感染肺癌A549细胞后,通过蛋白免疫印迹法检测BTG2的表达,细胞计数法检测BTG2对A549细胞生长的影响. 结果 pCDH-BTG2重组质粒构建成功,转染PC3细胞后可检测BTG2蛋白的表达,pCDH-BTG2包装成慢病毒感染A549细胞后,显著抑制A549细胞的生长. 结论 成功构建了重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并发现BTG2抑制A549细胞的生长,为研究BTG2的功能奠定了基础,同时为肺癌的药物研究提供了靶点.     

抑制ERCC1基因对肺癌细胞顺铂敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰切除修复交叉互补基因(ERCC)1对肺腺癌细胞A549顺铂敏感性的影响.方法 体外设计合成针对ERCC1基因的小干扰RNA(siRNA).转染肺腺癌细胞A549,应用RT-PCR、Western印迹和免疫细胞化学方法检测转染后ERCC1基因mRNA和蛋白的改变,应用四唑盐比色(MTT)法检测干扰ERCC1基因后A549细胞对顺铂敏感性的变化.结果 转染针对ERCC1基因的siRNA后24、48、72 h,A549细胞ERCC1基因mRNA和蛋白水平显著下降;关闭ERCC1基因后,A549细胞对顺铂的敏感性增加3.07倍.结论 RNA干扰ERCC1基因能增加肺腺癌A549细胞对顺铂的敏感性.     

人耐药肺腺癌A549/DDP细胞株的差异蛋白质组学

目的：建立A549与A549/DDP两组细胞株的双向凝胶电泳图谱,识别并鉴定其差异表达的蛋白质,筛选肺腺癌耐药相关蛋白质。方法：收集A549与A549/DDP两组细胞株的总蛋白质,应用二维凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）进行分离应用,图像分析识别差异表达的蛋白质点,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白质点。使用Western免疫印迹对其中4个蛋白质进行验证。结果：建立了A549与A549/DDP细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了40个差异表达的蛋白质点,鉴定了23个差异表达蛋白质。Western免疫印迹证实了差异蛋白质热休克蛋白β1,膜联蛋白A4,丝切蛋白l和波形蛋白在A549与A549/DDP细胞中的差异表达水平。结论：23个差异表达蛋白质为研究肺腺癌耐药机制提供了实验依据。     

采用基因芯片技术筛选人小细胞肺癌SH77/CDDP多药耐药相关基因表达谱的研究

目的 获得人小细胞肺癌(SCLC)SH77/CDDP 多药耐药(MDR)相关基因表达谱,为进一步阐明顺铂(CDDP)所致SCLC MDR的机制奠定基础.方法 在成功建立CDDP诱导的人SCLC MDR细胞系SH77/CDDP的基础上,分别提取SH77/CDDP 和其亲代SH77细胞的总RNA,反转录合成双链cDNA,通过反转录合成生物素标记的cRNA探针,片段化处理后分别与Affymetrix GeneChip人类U133系列芯片(U133A、U133B,共包含3.9万个转录本,其中有3.3万个已知基因,0.6万个未知的cDNA序列表达标签) 杂交,杂交信号经扫描等处理并用生物信息学对检测结果进行分析.结果 与SH77亲代细胞相比,在SH77/CDDP细胞中有2 389个(6.13%)基因表达增高,其中增高1倍以上的有464个(1.19%),增高2倍以上的有89个(0.23%),增高3倍以上的有26个(0.07%),增高4倍以上的有7个(0.02%).其中差异最显著的36个基因包括 ABCC3、HSP70、CYP26B1、CYP4A11、IGF1R、LOX2、CAP2、LRP2BP、AKNA、ELTD1等,上调幅度2.5～5.1倍,根据Gene Ontology分类和Tree View分析,这36个基因的功能主要为运输、细胞黏附、信号转导、转录和离子结合等.结论 高通量的基因芯片技术筛选出大量CDDP所致SCLC MDR相关基因,对这些耐药相关基因功能的验证有助于揭示CDDP所致人SCLC MDR的发生机制.     

吉非替尼联合用药对肺癌敏感A549、耐药A549/GR细胞株的实验研究

目的：研究吉非替尼联合用药对肺癌敏感A549、耐药A549/GR细胞株的影响。方法用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测和培养肺癌敏感A549和耐药A549/GR细胞株,待24 h、48 h、72 h后采用不同浓度的吉非替尼、奥曲肽、顺铂、5-FU进行单用和联用处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,分析药物的增效效果。结果联合用药对肺癌敏感A549和耐药A549/GR细胞株可起到协同抑制作用,与单独用药组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。联合用药组的肺癌敏感 A549、耐药A549/GR 细胞株培育48 h 后的IC50=（5.3±0.5）、（5.4±0.8） mg/L,单药组IC50=（20.1±1.2）、（20.3±1.4） mg/L,差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组、单药组、联合用药组诱导肺癌敏感A549和耐药A549/GR细胞株后凋亡率差异明显,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论吉非替尼联合用药对细胞的增生具有协同抑制作用,对其他肺癌的治疗也具有一定的效果。     

Rab25在非小细胞肺癌厄洛替尼获得性耐药中的作用

目的 探讨Rab25在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)厄洛替尼获得性耐药中的作用.方法 传代培养PC9及其厄洛替尼耐药PC9/ER细胞,采用CCK-8法检测PC9/ER细胞的耐药指数.应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time,qPCR)及Western blot检测对比同等厄洛替尼浓度(0.1、0.2、0.3 μmol/L)处理条件下,Rab25在两种细胞中的mRNA及蛋白表达差异,并以免疫荧光法定位Rab25在细胞中的分布.用小干扰RNA(siRab25)转染PC9/ER细胞,并以流式细胞仪及CCK-8法分别检测Rab25敲减后PC9/ER细胞的增殖指数(proliferation index,PI)及厄洛替尼IC50值的变化.结果 PC9/ER细胞的耐药指数是68.82 ±21.42.相同厄洛替尼浓度处理48 h后,PC9/ER细胞Rab25 mRNA及蛋白水平均高于PC9细胞(P＜0.05),增高的Rab25蛋白主要表达于细胞膜.而且PC9/ER细胞Rab25蛋白水平随厄洛替尼处理浓度(0.1、0.2、0.3 μmol/L)递增而增高.siRab25在PC9/ER细胞中成功转染后,转染组的厄洛替尼IC50值及PI均明显低于对照组(P＜0.05).结论 Rab25在NSCLC厄洛替尼获得性耐药细胞中高表达,起着促进耐药的作用.     

核糖体蛋白L39-L在肺癌1549细胞耐药机制中的作用

目的探讨核糖体蛋白L39-L在肺癌A549细胞对阿霉素类药物耐药机制中的作用。方法以体外培养的阿霉素耐药和敏感人肺癌A549细胞株，啊z01法提取总RNA，LightCyclerRNA扩增法进行荧光定量RT-PCR，检测阿霉素耐药A549细胞株、敏感细胞株之间的RPL39--L基因表达差异。经对人肺癌A549敏感细胞株体外培养、稳定转染RPL39-L基因后，3H—TdR掺人法进行生存率检测分析核糖体蛋白L39-L转染A549细胞、载体转染A549细胞和空细胞株对阿霉素的耐药性差异。结果荧光定量RT-PCR结果显示，耐药性人肺癌A549细胞株比敏感的A549细胞核糖体蛋白L39-L转录水平高7．3倍。1H1TdR掺入测定生存率显示，与质粒载体转染细胞或空细胞相比，转染核糖体蛋白L39-L的细胞表现出增强的阿霉素耐药性。结论核糖体蛋白L39-L基因可育旨在肺癌A549细胞的耐药机制形成机制中有作用。     

miR-194对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨microRNA-194(miR-194)对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其可能的作用机制?方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测非小细胞肺癌耐药细胞A549/DDP及其亲本细胞株A549中miR-194的表达差异,并在A549/DDP细胞中转染miR-194-inhibitor后检测miR-194的表达变化;应用MTT法?克隆形成实验?流式细胞术检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性?细胞增殖能力及凋亡变化;Western blot检测转染后A549/DDP细胞中Bax和Bcl-2的表达变化?结果:miR-194在耐药细胞A549/DDP中的表达量显著高于其亲本细胞株A549(P < 0.05),A549/DDP在转染miR-194-inhibitor 24 h后miR-194的表达水平较对照组显著下降(P < 0.05)?抑制miR-194表达后,相对于对照组,DDP对转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)减低(P < 0.05),转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞增殖能力减弱,经DDP处理后凋亡细胞增多(P < 0.05)?Western blot结果显示,与对照组相比,转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平降低?结论:miR-194可能通过抑制细胞凋亡,上调Bcl-2蛋白及下调Bax蛋白表达而增加A549/DDP细胞对DDP的耐药性,抑制miR-194的表达可逆转A549/DDP细胞的耐药性?     

沉默人肺癌A 549细胞中期因子基因表达对细胞凋亡的影响

目的：研究RNA干扰（RNAi）人肺癌A549细胞中期因子（MK）基因表达及对肿瘤细胞凋亡的影响。方法构建含MK siRNA真核表达载体,将其转染到人肺癌A549细胞株中（实验组）,另有阴性对照组（转染阴性对照质粒）和空白对照组。应用RT‐PCR的方法检测各组细胞中MK mRNA的表达情况;采用Western blot法检测MK蛋白的表达情况;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果实验组MK蛋白和mRNA表达都下降,分别下降了89．3％和83．3％。转染实验组A549细胞有自发性凋亡的发生,早期凋亡比阴性对照组和空白组分别提高了15．5倍和9．34倍。实验组caspase‐3活性明显高于阴性对照组和空白对照组（P＜0．05）。结论 RNAi下调人肺癌A549细胞株MK的表达,可诱导肿瘤细胞的自身凋亡。