miR-17-5p与反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导转化的人支气管上皮细胞生物学特性的关系研究

目的探讨miR-17-5p对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导转化的人支气管上皮细胞(16HBE-T)的生物学特性方面的影响。方法运用逆转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-17-5p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞(16HBE-N)的相对表达水平。通过瞬时转染miRNA模拟物及抑制剂,改变16HBE-T中miR-17-5p的表达,分析转染后16HBE-T的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡和软琼脂集落形成率等。结果转染前,16HBE-T中miR-17-5p表达水平是16HBE-N的2.35倍;转染后,转染miR-17-5p抑制剂组和转染miR-17-5p模拟物组中的miR-17-5p表达水平分别是16HBE-T的0.45和1.71倍。与抑制剂阴性对照组相比,转染了miR-17-5p抑制剂的试验组出现增殖能力下降、细胞周期阻滞和凋亡上升、克隆形成率下降。相反,转染了miR-17-5p模拟物的试验组与模拟物阴性对照组相比出现了增殖能力上调、凋亡减少,克隆形成率升高。结论 anti-BPDE恶性转化细胞中miR-17-5p成熟体表达水平改变能够影响16HBE-T的增殖能力、细胞周期和凋亡、克隆形成率,推断miR-17-5p在anti-BPDE致癌过程中发挥类癌基因作用。     

反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导恶变细胞中miR-494和miR-22的功能及PTEN的表达

目的分析反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导转化人支气管上皮细胞第30代(16HBE-T30)及其前期第15代细胞(16HBE-T15)miR-494及miR-22的表达水平,探讨其在化学致癌过程中的作用及对靶基因PTEN抑癌基因的调控。方法以16HBE-T30和16HBE-T15细胞为实验组,溶剂处理组分别为其相应的对照组细胞(16HBE-N30和16HBE-N15),用茎环结构逆转录引物定量RT-PCR检测四组细胞miR-494及miR-22成熟体表达水平。运用定量RT-PCR和Western blotting分别检测四组细胞PTEN mRNA和蛋白表达水平。运用miRNA前体及抑制剂对miNRA表达进行调控后,再检测PTEN的表达改变,并进行报告基因信号改变、细胞凋亡、软琼脂集落形成率等分析。结果 16HBE-T30中miR-494和miR-22表达水平分别是16HBE-N30的12.6和2.3倍,而16HBE-T15中miR-494、miR-22表达水平较16HBE-N15下降。16HBE-T30中PTEN蛋白表达量低于16HBE-N30。与前体阴性对照组相比,上调的miR-494和miR-22分别将PTEN蛋白的表达量降低至0.8和0.5倍,而降低的miR-494和miR-22分别将PTEN蛋白的表达量上调至1.3和1.5倍。在16HBE-T30细胞中,miR-494和miR-22表达下调均增强caspase-3/7活力,miR-494和miR-22表达上调则减弱其活力。miR-494和miR-22下调能够降低转化细胞的恶性程度。结论 anti-BPDE恶性转化细胞中miR-494和miR-22在转录后水平反向调控靶基因PTEN的表达,这两种miRNA在anti-BPDE致癌过程中发挥类癌基因作用。     

叶绿酸对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘抗细胞转化活性的影响

目的研究叶绿酸对反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发的SV40 large T抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的抑制作用.方法在反式- BPDE诱导的细胞转化整个过程中,分别加入浓度为10、50和100 μmol/L的叶绿酸,应用刀豆凝集素(ConA)凝集实验、软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验进行细胞恶性度鉴定.结果细胞培养至25代,发现叶绿酸和反式-BPDE共处理组细胞与反式-BPDE单独处理组细胞相比,前者ConA凝集时间延长;叶绿酸和反式-BPDE共处理组细胞在软琼脂中集落形成率分别为7.4‰、11.4‰和14.4‰,明显低于反式-BPDE单独处理组(19.6‰),且有剂量反应关系;各处理组细胞均能在裸鼠体内成瘤,叶绿酸和BPDE共处理组在裸鼠体内生长的肿瘤体积分别为(0.43±0.13) cm3、(0.22±0.04) cm3、(0.10±0.06) cm3,明显小于BPDE单独处理组的(1.71±0.37)cm3,并有剂量依赖关系,肿瘤组织经病理学证实为低分化鳞状细胞癌.结论体外试验显示叶绿酸具有一定的抗细胞恶变能力.     

二羟环氧苯并芘诱导16HBE细胞转化最佳实验方案

目的　采用客观又简单的软琼脂细胞集落形成率的指标来探索二羟环氧苯并芘诱导 16 HBE细胞转化的理想实验方案 ,构建恶性转化的细胞模型。方法　根据细胞存活率试验及克隆形成率试验确定诱导的剂量 ,以不同剂量二羟环氧苯并芘 1次或多次处理细胞 ,观察培养的不同阶段转化灶出现情况 ,用软琼脂培养鉴定其锚着依存性生长的恶性特征 ,比较各组转化细胞的集落形成率。结果　以 0 .1、0 .5、1.0、2 .0 μmol/ L的剂量 ,对细胞多次间断染毒 ,传代 15次 ,是二羟环氧苯并芘诱导 16 HBE细胞恶性转化的理想方案 ,其集落形成率分别为 2 .0‰、5 .5‰、7.0‰、10 .5‰ ,剂量 -反应关系呈现良好的直线相关 ,r=0 .9741,P<0 .0 5。结论　二羟环氧苯并芘能诱导人支气管上皮细胞 16 HBE转化 ,构建理想的恶性转化的细胞模型     

二羟环氧苯并芘恶性转化细胞的microRNA表达谱

目的 检测二羟环氧苯并芘(BPDE)恶性转化细胞的microRNA(miRNA)表达谱,寻找恶性转化细胞与对照细胞差异表达的miRNA.方法 以溶剂二甲亚砜助溶的终浓度为2.0 μmol/L的BPDE培养液培养人支气管上皮细胞株16HBE,获得BPDE恶性转化的细胞模型为实验组,同时,以含二甲亚砜的培养液培养正常16HBE作为对照组.通过微阵列技术检测实验组与对照组327个人类miRNA,并选择差异表达明显的miR-10a和miR-320用反转录荧光定量PCR方法对微阵列结果加以验证.结果 获得2组细胞327个miRNA表达谱,发现差异表达miRNA 55个,其中46个表达上调,9个表达下调,并得到反转录荧光定量PCR的验证.结论 获得BPDE恶性转化细胞与正常16HBE细胞差异表达的miRNA,为进一步寻找BPDE恶性转化细胞特征性miRNA提供了研究基础.     

二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响

目的 探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响.方法利用RT-PCR和Western blot方法,分别检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中mRNA和蛋白表达水平的变化.利用免疫细胞化学方法检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中定位和蛋白表达量的变化.结果 RT-PCR和Western blot实验表明,BPDE恶性转化细胞N-Ras基因的mRNA和蛋白水平分别是正常细胞的3.616和1.600倍.免疫细胞化学实验显示,在BPDE恶性转化细胞和正常细胞中,N-Ras基因在细胞膜和细胞浆中均有表达,且两者相比,前者中的N-Ras蛋白表达明显强于后者.结论 N-Ras基因可能在BPDE的致癌机制中起着重要作用.     

苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

二羟环氧苯并芘诱导转化与翻译延长因子的关系

目的探讨真核翻译延长因子1α1(eTEF1α1)基因在反式二羟环氧苯并芘致癌机制中所起的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增真核翻译延长因子1α1基因全长,插入pcDNATM3.1 D irectional TOPO表达载体,以脂质体转染介导的技术和G418细胞筛选法转染人支气管上皮细胞,构建转基因稳定表达的细胞株。用半定量RT-PCR方法分析转基因表达产物,对转基因细胞株,进行双层软琼脂试验以确定基因的恶性特性。结果成功扩增出eTEF1α1基因全长,构建出稳定表达真核翻译延长因子1α1基因的细胞株。稳定转染eTEF1α1基因的细胞株,能在双层软琼脂中形成克隆。结论真核翻译延长因子1α1基因与反式二羟环氧苯并芘的恶性转化有关。     

cDNA代表性差异分析法筛选二羟环氧苯并芘致癌相关基因片段

目的采用cDNA代表性差异分析法,分离二羟环氧苯并芘诱导恶性转化的细胞与对照组细胞之间的差异表达基因。方法先从细胞中提取mRNA并合成双链cDNA,双链DNA以Sau3AI内切酶消化,连接接头并经PCR扩增。以BPDE诱导恶变细胞的cDNA为“检测子”、以对照组细胞cDNA为“驱赶子”进行消减杂交。结果经3轮消减杂交后分离出5个cDNA片段,在琼脂糖凝胶上清晰显示210bp以下的5条条带,这些片段分别与总RNA作Northern印迹杂交证实它们均来自BPDE诱变的细胞。结论cDNA代表性差异分析法是筛选化学致癌相关基因的有效、灵敏的方法。     

反式二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞中HER2/neu基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞HER2/neu基因表达的影响。方法利用半定量RT-PCR、SYBR GreenI实时定量RT-PCR(QRT-PCR)、Western blot及免疫细胞化学方法分别检测经2.0μmol/L反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化细胞(16HBE-T)与对照DMSO溶剂组未恶性转化细胞(16HBE-N)之间HER2/neu基因mRNA和蛋白表达水平的差异,及两组细胞内HER2/neu蛋白表达定位分析。结果经几种不同方法检测反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白水平都比对照溶剂组细胞(16HBE-N)表达显著升高(P<0.05)。HER2/neu蛋白定位在胞膜。结论反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在HER2/neu表达增高,其可能与原癌基因HER2/neu被激活作用有关。     

miR-486-3p通过调控血小板衍生生长因子相关蛋白1抑制卵巢癌细胞增殖的研究

目的探讨miR-486-3p和血小板衍生生长因子相关蛋白1(platelet-derived growth factor-associated protein 1, PDAP 1)基因在卵巢癌中的表达情况以及它们的相互调控关系。方法回顾性分析2015～2017年在广东医科大学第一附属医院住院并经临床和病理证实为卵巢癌的8例患者临床卵巢癌肿瘤组织标本,收集同期4例卵巢非恶性病变者(阴性对照组)的标本,通过荧光实时定量PCR和免疫印迹技术,分析miR-486-3p和PDAP 1在卵巢癌的表达情况。采用生物信息学和双荧光素酶实验证实它们之间的调控关系,并研究它们对卵巢癌细胞增殖的影响。结果 miR-486-3p在卵巢癌细胞和肿瘤组织中均出现显著下调(P0.05),而PDAP 1则过表达(P0.05)。它们的表达量间呈负相关关系(r=-0.82,P0.05),进一步研究证实PDAP 1是miR-486-3p的靶点。上调miR-486-3p或抑制PDAP 1的表达均可导致卵巢癌细胞增殖受抑。结论以miR-486-3p和PDAP 1为靶点的基因治疗有望应用于卵巢癌治疗。     

miR-338-3p和miR-518b在绒毛膜羊膜炎患者胎盘组织的表达及IL-6基因多态性

目的探讨miR-338-3p、miR-518b在绒毛膜羊膜炎患者胎盘组织中的表达及白细胞介素-6(IL-6)基因多态性。方法选择襄阳市中心医院2017年12月-2019年12月收治的胎膜早破并绒毛膜羊膜炎产妇50例为研究组,选择同期医院收治的胎膜早破未合并绒毛膜羊膜炎产妇50例为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测两组患者胎盘组织中miR-338-3p、miR-518b相对表达水平;采用SNaPshot技术对IL-6基因rs1800796位点单核苷酸多态性(SNP)进行检测。结果研究组胎膜组织中miR-338-3p、miR-518b在mRNA相对表达水平高于对照组(均P<0.001);随着绒毛膜羊膜炎炎症严重程度的增加miR-338-3p、miR-518b在mRNA相对表达水平逐渐升高(P<0.05);两组患者基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡;研究组基因型、等位基因频率与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);以CC基因型为参照,经Logistic回归分析校正混杂因素后,IL-6基因rs1800796位点携带GC+GG基因型者绒毛膜羊膜炎发病风险为CC基因型的2.154倍(P<0.05);IL-6基因rs1800796不同基因型miR-518b mRNA相对表达水平差异具有统计学意义(P<0.05),miR-338-3p无此趋势。结论miR-338-3p和miR-518b参与了胎膜早破产妇发生绒毛膜羊膜炎的病理过程,其中miR-518b可能通过调节IL-6基因rs1800796位点的方式参与此过程,其机制有待进一步探究。     

p53对低剂量UVB诱导的MEF细胞辐射损伤中miR-365表达的影响

目的探讨低剂量中波紫外线UVB造成MEF损伤过程中,p53对MEF细胞miR-365表达的影响。方法以MEF细胞为研究对象,分为野生型小鼠胚胎成纤维细胞组(MEFP53+/+组),p53缺失的小鼠胚胎成纤维细胞组(MEFP53-/-组),CCK-8法检测低剂量UVB(30 J/m2)照射后3、6、12、18、24 h细胞增殖情况,流式细胞术分析细胞周期G2/M期比例变化,蛋白质印迹法检测两种细胞p53蛋白表达量,实时荧光定量PCR检测miR-365的表达。结果 UVB照射后两组细胞存活率存下降;而两组细胞在12、18、24、36 h的存活率相比差异有统计学意义(t值分别为2.4、3.1、3.2、2.8,P值均0.05);MEFP53+/+细胞在照射后6、12、18、24 h的G2/M期细胞比例上升,与0 h组相比差异均有统计学意义(t值分别为2.1、2.3、2.5、2.8,P值均0.05);p53在MEFP53-/-细胞中几乎不表达;UVB照射后,MEFP53-/-细胞中miR-365的mRNA在6、12、18、24、36 h显著下降(t值分别为2.0、3.2、3.3、2.9、2.8, P值均0.05),而MEFP53+/+细胞中只有18 h显著下降(t=4.2,P0.05)。12、18、24、36 h四个时间点,两组细胞之间miR-365差异有统计学意义(t值分别为2.2、2.6、2.4、2.3,P值均0.05)。结论 p53可能通过调控miR-365参与低剂量UVB引起的MEF细胞G2/M期阻滞。     

脓毒症患者外周血miR-326与miR-370-3p表达及其意义

目的探究脓毒症患者外周血miR-326、miR-370-3p的表达及其意义。方法选取2018年9月-2020年9月唐山市工人医院收治的94例脓毒症患者为研究组,同时募集同期体检健康者45名为对照组,脓毒症患者根据病情严重程度分为无休克组(n=62)和休克组(n=32),根据治疗28 d转归情况分为存活患者(n=70)和死亡患者(n=24);采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测外周血miR-326、miR-370-3p的表达,比较各组患者miR-326、miR-370-3p表达。结果脓毒症患者心率(HR)、外周血miR-326、miR-370-3p分别为(116.52±10.48)次/min、3.41±0.59、2.45±0.47高于对照组(P<0.001),miR-326、miR-370-3p单独及联合诊断脓毒症的AUC分别为0.822(95%CI:0.746~0.899)、0.784(95%CI:0.694~0.875)、0.881(95%CI:0.822~0.940)。无休克组HR、外周血miR-326、miR-370-3p、PCT、急性生理学与慢性健康评分系统(APACHE)Ⅱ评分、序贯器官衰竭评分(SOFA)分别为(114.26±12.52)次/min、3.19±0.47、2.23±0.54、(21.45±4.89)ng/L、(17.84±2.45)分及(6.71±0.84)分低于休克组(P<0.001),存活患者外周血miR-326、miR-370-3p、PCT、APACHEⅡ评分及SOFA评分分别为2.95±0.42、2.11±0.38、(24.58±3.76)ng/L、(16.27±3.68)分及(6.23±0.95)分低于死亡组(P<0.001);脓毒症患者外周血miR-326、miR-370-3p分别与APACHEⅡ评分、SOFA评分呈正相关(P<0.001)。结论 miR-326、miR-370-3p在脓毒症患者异常升高,可能作为脓毒症的早期诊断标志物,并与患者病情及预后密切相关。     

miR-548c-3p通过调控TRIM59表达对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的研究miR-548c-3p对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响和潜在的分子机制。方法 qRT-PCR检测TRIM59 mRNA和miR-548c-3p的表达,Western blot检测TRIM59、增殖相关蛋白CyclinD1和p21,及迁移侵袭相关蛋白MMP2和MMP9的表达水平,MTT法测定HepG2细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告系统验证miR-548c-3p与TRIM59的调控关系。结果与正常肝细胞L02相比,在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7402组中TRIM59的mRNA和蛋白表达量均显著升高(P<0.05),miR-548c-3p的表达量则均显著降低(P<0.05);过表达miR-548c-3p和抑制TRIM59表达均可抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭;双荧光素酶报告系统结果表明,miR-548c-3p靶向负调控TRIM59的表达;过表达TRIM59逆转了过表达miR-548c-3p对HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论 miR-548c-3p通过靶向TRIM59基因抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭,miR-548c-3p是肝癌的潜在治疗靶点。     

N-Ras基因靶向的shRNA抑制二羟环氧苯并芘诱导的恶变细胞增殖

目的用小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默N-Ras基因表达,探讨N-Ras基因表达对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化人支气管上皮细胞(16HBE-T)恶性性状的影响。方法将已建立的针对N-Ras基因的shRNA干扰表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo-NRas-566转染16HBE-T细胞,经G418筛选,建立稳定沉默N-Ras基因转化细胞系。采用Western blot筛选最佳N-Ras基因沉默细胞系,用流式检测N-Ras沉默细胞周期变化,用软琼脂实验和裸鼠成瘤实验进行细胞表型分析。结果成功培养出稳定沉默N-Ras基因的16HBE-T细胞系,Western blot显示N-Ras蛋白抑制率最高达86%。流式分析发现稳定沉默N-Ras基因表达诱导转化细胞G0/G1期捕获,软琼脂实验和裸鼠成瘤实验发现稳定沉默N-Ras基因降低了体外恶性转化细胞的集落形成率、抑制了体内肿瘤细胞生长。结论N-Ras基因沉默可以降低转化细胞的细胞周期进程和细胞恶性性状表型,提示N-Ras基因在二羟环氧苯并芘诱导细胞恶变过程中具有重要作用。     

纳米氧化钕致SD大鼠肺部炎症反应中 miR-498-5p的表达及意义

目的 探讨纳米氧化钕（NPs-Nd2 O3 ）致SD大鼠肺部炎症反应中miR-498-5p的表达水平及意义。方法 将42只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为对照组和NPs-Nd2 O3 染毒组,按照100 mg/kg浓度,采用非暴露式气管内一次性滴注法对大鼠进行NPs-Nd2 O3 染毒处理,在染毒第7、14和28 d后处死大鼠。计算肝脏、脑、肾脏、脾脏、睾丸、肺脏的脏器系数;采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）检测肝脏、脑、肾脏、脾脏、睾丸、肺脏中钕元素的含量;酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清、肺泡灌洗液及肺组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的含量;实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织中miR-498-5p的相对表达水平; TargetScan、 mireap、miRanda网站预测与miR-498-5p相互作用的下游靶基因; Pearson相关分析miR-498-5p与炎症因子TNF-α、IL-6的相关性。结果 NPs-Nd2 O3 染毒后,大鼠肺脏的脏器系数增加（t=-3.408,P=0.005）;肝脏、脑、肾脏、脾脏、睾丸、肺脏中均检测到钕元素;血清、肺泡灌洗液及肺组织中TNF-α、IL-6的含量升高（P<0.05）;NPs-Nd2 O3 染毒第7、14和28 d后肺组织中miR-498-5p的相对表达水平升高（7 d组: t= -21.236,P<0.001;14 d组: t= -4.631,P=0.010;28 d组: t= -6.132,P=0.001）,miR-498-5p表达与TNF-α含量呈正相关（ r =0.787,P=0.012）,与IL-6含量呈正相关（ r =0.708,P<0.033）;KEGG富集分析发现与miR-498-5p作用的靶基因其中有27个mRNAs参与JAK/STAT通路,19个mRNAs参与NF-κB通路。结论 NPs-Nd2 O3 经呼吸道进入体内可引起肺部明显炎症反应;NPs-Nd2 O3 染毒组大鼠肺组织中miR-498-5p表达水平升高,并与TNF-α、IL-6含量呈正相关;MiR-498-5p可能通过JAK/STAT通路和NF-κB通路参与NPs-Nd2 O3 诱导的肺部炎症。