纤维连接蛋白在小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞中的作用

目的：观察采用ITSF和N2无血清培养方法诱导小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞的作用及纤维连接蛋白对神经诱导的影响。方法：小鼠胚胎干细胞的培养和N2无血清条件培养基诱导为神经前体细胞，细菌培养皿法或悬滴法制备胚体，小鼠胚胎干细胞采用NBT／BCIP染色，神经前体细胞的nestin免疫组化染色采用ABC法。结果：细菌培养皿法或悬滴法培养胚体、ITSF或N2无血清培养基均能将小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞。纤维连接蛋白预处理培养表面，对胚体的贴壁情况影响不大，但能使无血清培养后存活的神经前体细胞明显增多。结论：小鼠胚胎干细胞在ITSF和N2培养基均能分化为神经前体细胞，在N2培养基中加入纤维连接蛋白能使存活的神经前体细胞数量增多。     

昆明小鼠3.5d和4d囊胚不同分离方法的比较

背景:远交系的昆明小鼠作为中国自然科学研究主要实验动物,其胚胎干细胞建系的成功率一直很低.目的:探讨昆明小鼠胚胎干细胞体外分离培养的最佳方法和最适合的采胚时间.方法:采集孕3.5 d和4 d的囊胚分别以免疫外科法和全胚培养法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离和克隆昆明小鼠胚胎干细胞集落.结果与结论:免疫外科法和全胚法培养3.5 d囊胚的内细胞团贴壁率和原代克隆形成率差异均不显著(P > 0.05);全胚法培养4 d囊胚的内细胞团贴壁率显著高于免疫外科法(P < 0.05),但原代克隆形成率显著低于免疫外科法(P < 0.05);全胚法培养4 d囊胚的原代克隆形成率显著高于3.5 d囊胚(P < 0.05);免疫外科法分离4 d囊胚内细胞团的贴壁率和原代克隆形成率显著高于以同样方法分离培养的3.5 d囊胚(P < 0.05).结果显示用免疫外科法分离4 d囊胚更适合于昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养.     

昆明小鼠3.5d和4d囊胚不同分离方法的比较

背景：远交系的昆明小鼠作为中国自然科学研究主要实验动物,其胚胎干细胞建系的成功率一直很低.目的：探讨昆明小鼠胚胎干细胞体外分离培养的最佳方法和最适合的采胚时间.方法：采集孕3.5 d和4 d的囊胚分别以免疫外科法和全胚培养法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离和克隆昆明小鼠胚胎干细胞集落.结果与结论：免疫外科法和全胚法培养3.5 d囊胚的内细胞团贴壁率和原代克隆形成率差异均不显著（P 〉 0.05）;全胚法培养4 d囊胚的内细胞团贴壁率显著高于免疫外科法（P 〈 0.05）,但原代克隆形成率显著低于免疫外科法（P 〈 0.05）;全胚法培养4 d囊胚的原代克隆形成率显著高于3.5 d囊胚（P 〈 0.05）;免疫外科法分离4 d囊胚内细胞团的贴壁率和原代克隆形成率显著高于以同样方法分离培养的3.5 d囊胚（P 〈 0.05）.结果显示用免疫外科法分离4 d囊胚更适合于昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养.     

体外局部微环境下小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化

背景:周围微环境能够调节胚胎干细胞在体外的诱导分化情况,可能与多种信号通路及细胞因子作用有关.目的:观察局部微环境对体外培养的小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞定向诱导分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成.材料:清洁级孕13.5 d的C57BL/6昆明鼠6只,由中科院上海实验动物中心提供.携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8由上海市发育生物学研究中心提供.方法:取孕鼠胚胎,采用组织块消化法制备小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理得到滋养层细胞.将携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8解冻复苏,加入含白血病抑制因子的高糖DMEM培养基体外扩增培养,将细胞克隆吹打成单细胞悬液,加到滋养层细胞上,在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养.胚胎干细胞传代后,再加入含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基,以单纯加入高糖DMEM培养基作为空白对照,调整细胞浓度为3×108L-1,吹打法悬浮培养48 h,收集悬浮液,反复离心去上清,移入铺有明胶的培养皿中,培养9 d.主要观察指标:诱导前后细胞形态及生长状态变化,RT-PCR检测诱导后细胞向神经前体细胞的分化情况.结果:胚胎干细胞在含有白血病抑制因子的高糖DMEM培养基中能够保持未分化状态,克降生长良好:换用含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基悬浮培养后,4.0～5.0 h聚集成团,形成圆球状的类胚体.加入全反式维甲酸的诱导组内胚层细胞呈多边形且数量较多,对照组内胚层细胞呈长梭形且数量少.诱导后细胞表达神经干细胞特异性标志巢蛋白,神经细胞特异性标志微管相关蛋白2呈弱表达,不表达神经胶质细胞特异性标志胶质纤维酸性蛋白.结论:体外培养的小鼠胚胎干细胞可保持末分化状态,具有不断增殖的能力,经白血病抑制因子与全反式维甲酸两步诱导后可分化为神经前体细胞.     

鼠胚胎干细胞及其衍生神经前体细胞的免疫原性检测

目的:体外观察ES-D3鼠胚胎干细胞(mESCs)及其衍生神经前体细胞(NPCs)的免疫原性。方法:采用无血清培养法从mESCs诱导出NPCs,运用流式细胞仪检测mESCs及NPCs主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ、Ⅱ类分子的组成型表达,及γ干扰素(IFN-γ)诱导作用下MHC分子诱导型表达情况。结果:mESCs在未分化前少量表达MHC-Ⅰ分子但几乎无MHC-Ⅱ分子表达,经诱导分化成NPCs后MHC-Ⅰ分子表达明显上调但MHC-Ⅱ分子仅微弱增加;运用IFN-γ诱导ESCs及NPCs,二者MHC-Ⅰ分子表达进一步增加,而NPCs MHC-Ⅱ分子也呈现相当程度上调。结论:ESCs及其衍生的NPCs具有一定免疫原性,体内移植之后可能引起针对MHC Ⅰ类或Ⅱ类抗原的移植排斥。     

体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞最佳胚龄的筛选:孕2.5d与3.5d及4.5d比较

背景:昆明小鼠基因型与人类近似,建立昆明小鼠胚胎干细胞系有利于其转基因动物的获得,但目前对于何时收集胚胎尚无明确报道.目的:探讨体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的最佳胚龄.方法:分别从孕2.5 d,3.5 d和4.5 d的昆明系母鼠子宫中分离收集胚胎,于显微镜下观察胚胎的形态、贴壁情况、内细胞团形成情况、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率等,并进行碱性磷酸酶染色.结果与结论:孕2.5 d采集的胚胎多为16细胞期胚胎,孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚.孕2.5 d胚胎和孕3.5 d胚胎的贴壁率、内细胞团形成率、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率均无明显差异(P＞0.05);孕4.5 d胚胎上述指标均显著高丁二前两者,更适合作为胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代的材料.     

昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性

背景:到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BL/6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道.目的:分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006-05/2007-06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成.材料:昆明小鼠3.5 d胚龄的囊胚.方法:自昆明系小鼠3.5 d胚龄的囊胚分离内细胞团细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养.主要观察指标:观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析.结果:分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型.结论:成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符.     

C57BL/6小鼠来源的胚胎干细胞建系及体外定向造血分化的研究

哺乳动物的胚胎造血表现为时间和空间的连续变化。既往研究表明，129小鼠来源的胚胎干细胞系（em-bryonic stem cells，ES细胞）的体外分化能在一定程度上模拟胚胎造血。为研究C57BL/6小鼠来源的ES细胞系体外定向造血细胞分化的特点，分离C57BL/6小鼠3.5天囊胚的内细胞团建立ES细胞系并采用常规方法鉴定，应用体外二步分化法形成拟胚体并进行集落培养，细胞化学染色和RT-PCR鉴定造血前体细胞。结果表明：所建ES细胞系MES-1符合建系标准，其体外分化后可在不同阶段的拟胚体中发现多种造血前体细胞的有序出现，包括原始红系前体细胞，永久红系前体细胞，混合集落形成细胞和粒单系集落形成细胞。RT-PCR分析显示，拟胚体表达多种造血特异性的转录因子和造血标记。结论：自C57BL/6小鼠建立的ES细胞系MES-1体外定向造血细胞分化在一定程度上能模拟胚胎造血。     

胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

<正>胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)是一类源于囊胚时期内细胞团的特定细胞群,是具有分化为体内三个胚层来源的各种类型组织细胞潜能的全能干细胞。其基本特征是体外培养可长期保     

昆明小鼠胚胎干细胞的分离培养方法

背景:目前已经建立了数百个小鼠的胚胎干细胞系,这些细胞系大多数来源于129,C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠,而昆明株小鼠的胚胎干细胞建系的成功率很低.目的:探寻昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的方法,以期提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的成功率.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006-04/2007-06在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:昆明白小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚.方法:分别将昆明白小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,四五天后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,分别采用2.5g/L胰蛋白酶-0.4g/L乙二胺四乙酸与1g/L胰蛋白酶0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械离散胚胎干细胞集落.主要观察指标:观察集落的生长情况,通过碱性磷酸酶染色、OCT-4染色、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定.结果:[1]4d胚龄胚胎的贴壁率、内细胞团出现率及克隆形成率高于3.5d胚龄(P<0.05).[2]采用1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械作用,分离克隆胚胎干细胞效果较好.[3]胚胎干细胞呈集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性,悬浮培养胚胎干细胞能得到囊状胚体.结论:采用4d胚龄的囊胚和1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min,并辅以机械作用的消化方法,有助于提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的能力.     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

背景：对于神经千细胞的分离培养,目前多采用胰蛋白酶对组织细胞予以消化,但消化时间较难把握。 目的：采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养,并进行初步的免疫组织化学检测。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006～10/2007—09在广西医科大学基础医学实验室完成。材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供。 方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清DMEMIF12培养基中培养。主要观察指标：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果：培养24h后,细胞以悬浮方式生长,聚集成团：48h后形成由数十个细胞组成的细胞球,形态规则,体积大小不等,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代扩增。免疫细胞化学染色结果示细胞巢蛋白呈阳性表达。 结论：在含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清B27培养基条件下,有利于小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和传代增殖。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的:在神经干细胞的分离培养过程中,国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化,但是消化时间比较难把握.采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测,为相关研究建立实验条件.方法:实验于2006-10/2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成.实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站. ①实验材料:孕14～16 d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养.③实验评估:用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞.结果:在无血清DMEM/F12培养液中,加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下,培养24 h后可见细胞以悬浮方式生长,三五聚集成团块,48 h后形成由十数个至数十个细胞组成的,大小不等的细胞球,形态规则,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代.免疫细胞化学法检测显示,细胞表达神经巢蛋白.结论:①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力.②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖.     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的：在神经干细胞的分离培养过程中，国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化，但是消化时间比较难把握。采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测，为相关研究建立实验条件。 方法：实验于2006—10／2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成。实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站。①实验材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织，经胰酶消化加机械吹打后，在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养。③实验评估：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。 结果：在无血清DMEM／F12培养液中，加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下，培养24h后可见细胞以悬浮方式生长，三五聚集成团块，48h后形成由十数个至数十个细胞组成的，大小不等的细胞球，形态规则，细胞无突起，形成典型的神经球，可传代。免疫细胞化学法检测显示，细胞表达神经巢蛋白。 结论：①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力。②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖。     

昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定

目的探讨昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养和鉴定。方法收集小鼠14—16d胚龄的囊胚,以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的胚胎干细胞（ES）细胞样集落,分离隆起生长的胚胎内细胞团并继续培养,观察集落的生长状态,通过碱性磷酸酶染色进行的分析鉴定,并对其体外分化能力进行检测。结果共培养收集74个昆明小鼠的囊胚,其中有53个囊胚的内细胞团（ICM）离散程度较强;ES细胞集落的特征呈鸟巢状,其细胞圆小,细胞核大,排列紧密,边缘清晰,细胞之间的界限不清楚;碱性磷酸酶（AKP）染色呈阳性,集落呈红棕色或蓝色,成纤维细胞或分化细胞呈淡黄色或无色;体外悬浮培养时,Es细胞集落能够形成简单拟胚体,且EBs外向性生长,周围分化的细胞形态成多样性。结论昆明小鼠是我国应用最多的实验小鼠,建立昆明小鼠的Es细胞系有利于其转基因动物的获得,能够为我国的科研工作更好地服务。     

体外羊膜间充质干细胞分离培养及向神经元样细胞的分化

背景:胎盘组织作为寻找人类间充质干细胞的新来源,已成为备受人们关注的研究热点.从胎盘组织中羊膜层分离、培养细胞,因其来源广泛、不受伦理限制等优越性而具有广阔的应用前景.目的:观察人羊膜间充质干细胞体外分离培养的方法,及向神经元样细胞分化的能力.方法:用酶消化法从羊膜中分离和培养间充质干细胞,并通过形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度.应用DMEM-LG+20 g/L DMSO+100 μmol/L BHA+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子诱导分化,通过免疫荧光染色鉴定诱导后的细胞.结果与结论:可从羊膜组织成功分离培养出间充质干细胞,细胞贴壁生长,在体外短期内可以稳定增殖和传代.具有与骨髓间充质干细胞相似的表面标志,体外可以诱导分化为神经元样细胞,胶质纤维酸性蛋白与神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色均为阳性.提示羊膜间充质干细胞可以在体外分离培养并诱导分化为神经元样细胞,羊膜组织可以作为干细胞研究以及神经组织疾病细胞治疗的一个全新的细胞来源.     

人胎肺间充质干细胞分离培养条件及向心肌细胞诱导分化的可能关联

目的:观察分离培养得到人胎肺间充质干细胞的条件,并分析诱导其转分化为心肌细胞的可能性及其相关因素。方法:实验于2003-01/2005-12在西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心完成。取10周龄人工流产胎儿肺组织,0.25%胰蛋白酶消化,经培养得到人胎肺间充质干细胞。观察细胞形态及增殖,测细胞生长曲线。将人胎肺间充质干细胞以1.8×104/孔接种于明胶预处理的24孔板中。加Dulbecco修正Eagle’s基础培养液培养24h后弃去培养液,磷酸盐缓冲液(-)洗两三次。每14孔为1组,分别加入Dulbecco修正Eagle’s基础培养液和先进的Dulbecco修正Eagle’s(分别添加2%、5%、8%和10%新生牛血清)5种不同的培养液,其后方法同上,每天选任意两孔计数,求平均值。用流式细胞仪对所分离第8代细胞进行以下细胞表面标志检测:CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44。人胎肺间充质干细胞向心肌细胞诱导分化:将第12代人胎肺间充质干细胞以500个/孔接种于明胶预处理的24孔板中。每6孔为1组,分别在Dulbecco修正Eagle’s基础培养液中添加0、5、10、20μmol/L5-氮胞苷,每组中每2孔为一诱导时间段,分别诱导培养24,48,72h后换成Dulbecco修正Eagle’s基础培养液,以后每3d换液1次。观察细胞在各组中变化情况,诱导12d后固定进行糖元染色和α平滑肌肌动蛋白免疫组化染色。结果:成功分离了人胎肺间充质干细胞,细胞已扩增至26代,流式细胞仪检测CD25、CD105、CD166和CD44表达阳性;CD71(39.1%)和CD117(29.8%)弱阳性。Dulbecco修正Eagle’s培养液比先进的Dulbecco修正Eagle’s培养液更适合于这类细胞生长。经10μmol/L5-氮胞苷诱导48h后,糖元染色、心肌α平滑肌肌动蛋白免疫组化染色阳性细胞率达60%以上。结论:①人胎肺间充质干细胞在Dulbecco修正Eagle’s基础培养液中能够大量扩增。②并表达CD25,CD105,CD166和CD44等细胞表面标志。③10μmol/L5-氮胞苷诱导48h对该细胞向心肌细胞分化有明显促进作用。