3种细胞用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的比较研究及应用

【目的】比较3种肥大细胞(Ku812、RBL-2H3和P8l5细胞)激活后脱颗粒反应的差异,寻找适宜的肥大细胞脱颗粒体外检测模型,并利用该模型检测几种常见的中药注射剂(TCMI)以探讨肥大细胞体外研究过敏及类过敏反应的可行性。【方法】以10μg/mL C48/80激活细胞0～60 min,采用液质联用法(LC-MS)检测组胺释放量,比色法检测氨基糖苷酶释放率,中性红染色法进行形态学观察。【结果】C48/80刺激P815、RBL-2H3、Ku812细胞0～60 min后组胺释放率、氨基糖苷酶释放率和细胞脱颗粒率均有明显增加,且在相同刺激条件下,P815细胞活化后脱颗粒现象出现更早、程度更高(P<0.05)。故选择P815细胞对数种TCMI的致敏性进行体外检测,正常P815细胞出现较少脱颗粒现象,而清开灵、血塞通、双黄连、肿节风、香丹等注射液能显著引起细胞脱颗粒释放组胺。【结论】相对于RBL-2H3和Ku812细胞,P815细胞更适合作为一种早期、稳定、敏感的肥大细胞脱颗粒体外检测模型,其对几种常用TCMI的检测结果与临床报道有一定的相关性,P815细胞具有评价TCMI致过敏及类过敏反应的潜在应用价值。     

血塞通致RBL-2H3细胞与原代肥大细胞脱颗粒特性的比较

【目的】通过比较血塞通注射液等在类过敏试验中致RBL-2H3细胞与大鼠腹腔原代肥大细胞脱颗粒特性的异同,以评价2种细胞在中药注射液类过敏试验中的意义。【方法】选用已经明确能引起类过敏反应的3种供试品即血塞通注射液、Compound 48/80和吐温80,分别与RBL-2H3细胞和大鼠腹腔肥大细胞共同孵育1 h,通过β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率、释放量等的检测,分析比较脱颗粒特性的异同,同时观察了不同浓度血塞通注射液对脱颗粒程度的影响。【结果】2种细胞在血塞通注射液、Compound 48/80和吐温80的直接刺激下均出现脱颗粒现象,脱颗粒程度与血塞通注射液呈剂量依赖性;原代肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率、组胺释放量和释放率均显著高于RBL-2H3细胞,2种细胞比较差异有统计学意义(P<0.01)。【结论】在类过敏反应脱颗粒试验中,RBL-2H3细胞和原代大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒具有相同趋势,均可用于中药注射液类过敏评价,RBL-2H3细胞应用方便,而肥大细胞更加敏感。     

生脉注射剂致RBL-2H3细胞与大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒研究

【目的】通过分析生脉注射液致RBL-2H3细胞与大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒及其对2种细胞的细胞毒作用,评价生脉注射剂的致类过敏情况。【方法】分离大鼠腹腔肥大细胞,加入不同浓度的生脉注射剂共孵育,采用荧光法检测组胺并计算释放率。RBL-2H3细胞与不同浓度的生脉注射剂共孵育,采用显色法检测β-氨基己糖苷酶释放率。分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法与流式细胞术检测生脉注射剂对2种细胞的细胞毒作用。【结果】生脉注射剂在终浓度为12.5~100μL/mL时可引起肥大细胞组胺释放率增加,25~100μL/mL时可引起RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶释放率增加(均P0.05或P0.01),上述剂量范围内对2种细胞均未表现细胞毒作用。【结论】生脉注射剂在未表现细胞毒作用的剂量下可引起大鼠腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞脱颗粒,提示生脉注射剂具有致类过敏的可能。     

中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒的研究

目的:探讨中药注射剂引起RBL-2H3细胞脱颗粒情况及其机制。方法:RBL-2H3细胞分别与阳性药物C48/80及15种中药注射剂作用,从形态学和超微结构观察、β-氨基己糖苷酶释放检测等方面研究RBL-2H3细胞脱颗粒情况。用WST-8法检测中药注射剂对RBL-2H3细胞和BRL细胞的细胞毒作用。结果:甲苯胺蓝染色和电镜观察细胞超微结构变化从形态学上证明中药注射剂引起RBL-2H3细胞脱颗粒。上清中β-氨基己糖苷酶释放率检测表明脉络宁、清开灵、参麦和痰热清注射液明显促进酶的释放,酶释放率在20%以上,与阴性对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。进一步的研究发现,痰热清注射液成分中的黄芩和生脉注射液成分中的红参、五味子与RBL-2H3细胞的脱颗粒有关。大部分中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒的作用与细胞毒作用相关,但有的中药注射剂致脱颗粒无细胞毒作用。结论:一些中药注射剂可致RBL-2H3细胞脱颗粒,中药注射剂中有的成分与RBL-2H3细胞脱颗粒相关;有的中药注射剂致RBL-2H3细胞脱颗粒与细胞毒作用有关,而pH和渗透压可影响细胞的脱颗粒。     

清开灵注射液对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的影响

目的:清开灵注射液对RBL-2H3细胞脱颗粒和组胺释放影响。方法:取不同浓度的清开灵注射液与RBL-2H3肥大细胞系共培养,在放大镜下观察比较细胞脱颗粒情况;检测肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶活性A值,并计算β-氨基己糖苷酶释放百分率。结果:与不同浓度的清开灵共培养后,细胞的脱颗粒有明显的差异,以1/8原浓度稀释后细胞脱颗粒明显,清开灵注射液使肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶活性(A值)为0.828±0.004,β-氨基己糖苷酶活性为8.5%。结论:清开灵注射液能通过直接作用使RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,为鉴定中药注射剂的过敏机制和临床前研究提供了一定的实验依据。     

大鼠羊水与RBL-2H3肥大细胞共培养后脱颗粒的检测

[目的]探讨大鼠羊水与 RBL-2H3肥大细胞共培养后是否有脱颗粒现象发生。[方法]取大鼠不同稀释度的羊水与大鼠来源的RBL-2H3肥大细胞系共培养,用酶联免疫法测定不同时间样品上清的组胺、自发释放的组胺和总组胺,计算组胺释放率。对细胞用阿利新蓝染色,计算脱颗粒指数。用流式细胞仪测定RBL-2H3细胞Annexin Ⅴ标记后的阳性细胞率。[结果]与不同稀释度的羊水共培养后,细胞的组胺释放率有显著差异,组胺的释放和羊水浓度正相关。阿利新蓝染色后计算的脱颗粒指数与组胺释放率测定结果一致。细胞Annexin Ⅴ标记后的阳性率在羊水刺激后明显上升,进一步证明了脱颗粒的发生。[结论]羊水中的物质可以通过直接作用导致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,为羊水栓塞时肥大细胞脱颗粒机制的研究提供了一定的实验依据。     

大鼠羊水与RBL—2H3肥大细胞共培养后脱颗粒的检测

[目的]探讨大鼠羊水与RBL-2H3肥大细胞共培养后是否有脱颗粒现象发生。[方法]取大鼠不同稀释度的羊水与大鼠来源的RBL-2H3肥大细胞系共培养，用酶联免疫法测定不同时间样品上清的组胺。自发释放的组胺和总组胺，计算组胺释放率。对细胞用阿利新蓝染色。计算脱颗粒指数，用流式细胞仪测定RBL-2H3细胞AnnexinV标记后的阳性细胞率。[结果]与不同稀释度的羊水共培养后，细胞的组胺释放率有显差异。组胺的释放和羊水浓度正相关。阿利新蓝染色后计算的脱颗粒指数与组胺释放率测定结果一致。细胞AnexinV标记后的阳性率在羊水刺激后明显上升，进一步证明了脱颗粒的发生。[结论]羊水中的物质可以通过直接作用导致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒，为羊水栓塞时肥大细胞脱颗粒机制的研究提供了一定的实验依据。     

白鲜皮提取物抗过敏反应研究

目的:探讨白鲜皮提取物的抗过敏作用,分析其作用机制。方法:采用C48/80处理大鼠肥大细胞RBL-2H3,刺激RBL-2H3细胞脱颗粒,释放组胺及β-氨基己糖苷酶,模拟人类过敏反应。用不同浓度的白鲜皮提取物处理大鼠肥大细胞RBL-2H3,观察白鲜皮提取物对大鼠肥大细胞RBL-2H3脱颗粒释放组织胺及β-氨基己糖苷酶的影响;采用伊文思兰染色的方法,观察白鲜皮提取物对组织胺引起的毛细血管通透性的影响。结果:发现白鲜皮提取物能够剂量依赖性的抑制C48/80诱导的大鼠肥大细胞RBL-2H3脱颗粒,减少组织胺及β-氨基己糖苷酶的释放,并能够降低小鼠毛细血管通透性。结论:白鲜皮提取物能够缓解过敏反应引起的炎症而用于过敏反应,其作用机制可能是通过抑制肥大细胞功能而降低毛细血管通透性。     

白鲜皮提取物抗过敏反应研究

目的:探讨白鲜皮提取物的抗过敏作用,分析其作用机制。方法:采用C48/80处理大鼠肥大细胞RBL-2H3,刺激RBL-2H3细胞脱颗粒,释放组胺及β-氨基己糖苷酶,模拟人类过敏反应。用不同浓度的白鲜皮提取物处理大鼠肥大细胞RBL-2H3,观察白鲜皮提取物对大鼠肥大细胞RBL-2H3脱颗粒释放组织胺及β-氨基己糖苷酶的影响;采用伊文思兰染色的方法,观察白鲜皮提取物对组织胺引起的毛细血管通透性的影响。结果:发现白鲜皮提取物能够剂量依赖性的抑制C48/80诱导的大鼠肥大细胞RBL-2H3脱颗粒,减少组织胺及β-氨基己糖苷酶的释放,并能够降低小鼠毛细血管通透性。结论:白鲜皮提取物能够缓解过敏反应引起的炎症而用于过敏反应,其作用机制可能是通过抑制肥大细胞功能而降低毛细血管通透性。     

聚山梨酯80刺激肥大细胞RBL-2H3脱颗粒作用的评价

目的：研究不同类别及厂家的聚山梨酯80直接刺激肥大细胞RBL-2H3脱颗粒的作用,为建立完善的注射用辅料引发类过敏反应的筛选评价体系提供依据。方法：以不同剂量的聚山梨酯80处理RBL-2H3细胞,测定β-氨基己糖苷酶释放量,并通过MTT法进一步研究有脱颗粒作用的受试物对RBL-2H3细胞的毒性作用。结果：8种聚山梨酯80样品具有不同程度的直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒的作用,且呈浓度依赖性,其中上海试剂采购供应站提供的受试物作用极强,威尔制药口服级受试物作用较强,威尔制药A、威尔制药B、威尔制药注射级、威尔制药4个受试物作用相近,2个进口品种的作用略弱。在产生直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒作用的浓度下,上海试剂采购供应站的聚山梨酯80有明显的细胞毒性,并呈浓度依赖性。结论：聚山梨酯80能够直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒,其作用强度不同反映了产品的质量差异;上海试剂采购供应站提供的聚山梨酯80直接刺激RBL-2H3细胞脱颗粒的作用可能由其细胞毒性引起。     

内毒素对肥大细胞脱颗粒释放组胺和类胰蛋白酶的影响

目的通过体外分离培养大鼠腹腔肥大细胞（RPMC）,进而探讨内毒素（endotoxin,ET）对RPMC脱颗粒释放组胺和类胰蛋白酶的影响。方法将悬浮培养的RPMC分为5组：①无ET处理组;②0.5μg/mlET处理组;③1μg/mlET处理组;④2μg/mlET处理组;⑤4μg/mlET处理组。37℃孵育2h,收集RPMC上清,荧光法测定RPMC培养上清中组胺含量;专性底物α-N-苯甲酰-DL-精氨酸-P-硝基苯胺（BAPNA）测定RPMC培养上清中类胰蛋白酶含量,分析不同浓度ET对RPMC释放组胺和类胰蛋白酶的影响。结果不同浓度ET处理组与无ET处理组相比RPMC脱颗粒现象明显;不同浓度ET处理组刺激RPMC释放组胺和类胰蛋白酶的量均高于无ET处理组（P〈0.05）,与ET剂量依赖性不明显（P〉0.05）,并且给予1μg/mlET处理时组胺和类胰蛋白酶的释放量最高。结论ET体外可刺激RPMC脱颗粒释放组胺和类胰蛋白酶,但与ET剂量依赖性不明显。     

骨肽类注射剂类过敏反应评价研究

目的 采用小鼠耳廓蓝染实验对骨肽类注射剂类过敏反应进行评价,探究不同剂量的骨肽类注射剂引起类过敏反应的情况.方法 分别以磷酸组胺、组胺盐酸盐、组胺作为阳性药,筛选适宜的阳性模型;对不同剂量下的骨肽类注射剂进行小鼠耳廓蓝染实验,以蓝染率及伊文思蓝(evans blue,EB)升高率作为类过敏评价指标.结果 以磷酸组胺作为...     

膜结合型抗大鼠FcεRIα单克隆抗体制备及活性鉴定

目的:建立抗鼠FcεRI单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),为靶向诱导肥大细胞凋亡创造条件.方法:大鼠嗜碱性粒细胞细胞系RBL-2H3免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,ELISA筛选鼠血清和融合细胞产生的抗体,有限稀释克隆化培养.SDS-PAGE胶电泳、免疫扩散鉴定抗体性质,IgE竞争结合、组胺释放检测抗体生物活性,125I-细胞膜抗体复合物免疫沉淀放射自显影鉴定抗体识别抗原成分.结果:获得2株抗FcεRIα McAb生产细胞株ER-E5.3、ER-C7.4,均为IgG1.培养上清和小鼠腹水获得的抗体效价均大于10-5.流式细胞术分析抗体与RBL-2H3结合率均大于95%,与大鼠胸腺细胞和外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)无交叉反应,并能竞争性抑制IgE与肥大细胞结合.抗体触发RBL-2H3脱颗粒,组胺释放效应与抗原特异性IgE对肥大细胞的激活效应相同.酶切的Fab片段能与RBL-2H3结合,也能竞争抑制IgE与肥大细胞的结合,但不致RBL-2H3脱颗粒.抗体结合的细胞膜成分为α亚单位.结论:大鼠肥大细胞免疫小鼠与骨髓瘤细胞融合得到2株抗体产生杂交瘤克隆ER-E5.3和ER-C7.4,抗体效价和功能活性达到了实验要求,抗原识别成分为膜FcεRIα.     

体外检测RBL-2H3细胞脱颗粒方法的研究进展

<正>嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3细胞)属于大鼠嗜碱粒细胞肿瘤株的一个亚系,1978年美国国立研究所从Wistar大鼠嗜碱性白血病细胞株反复克隆获得的[1-2]。RBL-2H3细胞具有肥大细胞的生物学特性,能模拟肥大细胞的多种功能,是体外研究与肥大细胞相关的各种药物作用机制的重要模型。笔者阐述了RBL-2H3细胞作为体外模型用于检测脱颗粒的不同检测方法。1 RBL-2H3细胞的特征     

过敏症的Th1/Th2失衡与抗过敏药物的筛选

过敏症对人类健康和生命的危害日益严重。目前对过敏症的诊断和治疗仍不完善,了解过敏症的免疫机制,寻求有价值的抗过敏药物具有重要意义。1过敏症的免疫机制1·1特异性IgE是I型过敏反应的关键分子I型过敏反应的特征是IgE生成量异常增多,并介导肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放组胺、白三烯等过敏活性介质,引发过敏症。而特异性IgE的上调机制至今尚未完全阐明。研究显示[1],B细胞IgE生成具有T细胞依赖性,由过敏原特异性CD4+T细胞克隆诱导和调节[2]。其中IL-4,IL-5,IL-6和TNF-α促进IgE合成,而IFN-γ,IFN-,αTGF-β抑制IgE…     

防风提取物对IgE致敏肥大细胞的改善作用及机制研究

[目的]探究防风(Saposhnikovia divaricata,SD)提取物对大鼠嗜碱性白血病细胞RBL-2H3脱颗粒的影响及作用机制。[方法]采用噻唑蓝(methylthialazole tetrazolium,MTT)比色法检测,根据5、25、50、100、200、400μg·mL^-1SD提取物对RBL-2H3细胞活性的影响,确定后续实验浓度。以免疫球蛋白E(immunoglobulinE,IgE)诱导建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型。设立空白对照组、模型组、低剂量SD提取物组(5μg·mL^-1)、中剂量SD提取物组(25μg·mL^-1)、高剂量SD提取物组(50μg·mL^-1)和地塞米松(dexamethasone,DXMS)组(100μg·mL^-1),干预30 min。MTT法检测低、中、高剂量SD提取物对RBL-2H3细胞脱颗粒模型活性的影响。甲苯胺蓝染色观察脱颗粒细胞形态,计算细胞脱颗粒率。免疫荧光染色测定细胞F-肌动蛋白(F-actin)表达。酶联免疫吸附试验...     

抗过敏中药研究进展

过敏反应是病理性免疫反应,即体机受抗原性物质刺激后引起的组织损伤或生理功能紊乱.在抗过敏中药的研究中,发现多种单味、中药复方和中成药具有抗过敏作用,能在保护和稳定靶细胞膜(减少或防止其脱颗粒、释放过敏介质,提高细胞内cAMP水平)、抑制IgE产生、对抗过敏介质、中和变应原等多环节起作用,临床疗效较好,且未见显著的不良反应.现将中药抗过敏反应研究概况综述如下.     

复方中药抑制大鼠肥大细胞脱颗粒的作用及其机制

目的探讨复方中药(Formula-3)抑制大鼠肥大细胞脱颗粒的作用及其机制。方法通过DNP-BSA-IgE激发建立致敏的RBL-2H3细胞模型。采用MTT实验检测Formula-3(中药组成:人参9g,干姜9g,黄连9g,当归9g,乌梅30g,灵芝30g)对细胞活性的影响;利用酶联免疫吸附法研究Formula-3对致敏肥大细胞β-氨基己糖苷酶及细胞因子的影响;共聚焦激光扫描荧光显微镜观察检测SOC通道的变化。结果成功建立致敏的细胞模型。Formula-3不会对细胞活性造成影响。Formula-3可减少致敏肥大细胞β-氨基己糖苷酶的释放,Th2型细胞因子和Th1型细胞因子的水平亦有显著变化(P<0.05);能够抑制肥大细胞膜上SOC通道的开放,Ca2+瞬变从1.83降至1.18(P<0.05)。结论 Formula-3通过抑制SOC通道的开放达到抑制肥大细胞脱颗粒的目的。     

5-羟甲基糠醛及其二聚体OMBF引发Ⅰ型超敏反应毒性评价与机制初探

目的对5-羟甲基糠醛及其二聚体OMBF是否引发I型超敏反应进行评价,并初步探索其作用机制。方法分为体内实验和体外实验。体内实验选取雄性BN大鼠,随机分为7组:生理盐水对照组(NS),佐剂对照组(Adj.),模型组,5-HMF低、高剂量组,OMBF低、高剂量组。各组大鼠分别给予生理盐水、佐剂或相应浓度的药物佐剂混悬液,30 min后腹主动脉采血,测定血清中IgE、IgG和IL-4含量。体外实验采用RBL-2H3细胞系,分组同体内实验。采用甲苯胺蓝染色观察给药前后细胞脱颗粒情况;测定药物作用后细胞上清中β-HEX、His的释放率。通过Western blot技术初步探索5-HMF及其二聚体OMBF诱导Ⅰ型超敏反应的作用机制。结果体内实验显示,血清中各指标除5-HMF低剂量作用下IgG未见明显差异外,其余均显著性升高。体外实验研究表明,低、高剂量组均出现了细胞脱颗粒现象,测定的β-HEX和His释放量均出现了不同程度的升高。结论 5-HMF及其二聚体OMBF作为小分子过敏原可诱导I型超敏反应的发生,且发挥免疫毒性可能与MAPK家族磷酸化蛋白的上调水平有关。     

神经肽P物质对大鼠肥大细胞脱颗粒的影响

目的 :探讨不同浓度的神经肽P物质 (SP)对大鼠肥大细胞脱颗粒的影响 ,以及不同浓度Ca2 对SP诱导肥大细胞脱颗粒的影响。方法 :应用荧光分光光度计观察SP、Ca2 对大鼠肥大细胞组胺释放率的影响。结果 :①SP可刺激肥大细胞脱颗粒 ,其组胺释放率与SP浓度呈显著正相关 (r=0 .976 ,P <0 .0 1 )。②SP物质刺激肥大细胞脱颗粒与细胞外Ca2 浓度相关 (r=0 .70 9,P <0 .0 1 )。结论 :SP呈剂量依赖性刺激肥大细胞脱颗粒 ,Ca2 可促进肥大细胞脱颗粒。