大鼠脊髓全横断后脊髓内BDNF表达的变化

为了探讨大鼠脊髓全横断后不同时相(3、7、14、21d)脊髓内BDNF表达的变化,我们采用免疫组织化学ABC法和阳性神经元计数,来检测脊髓全横断后不同时相BDNF的表达。结果发现:(1)BDNF免疫阳性产物主要位于腹角运动神经元,胞浆着色;(2)脊髓全横断后脊髓腹角BDNF阳性细胞数3d开始增多,7d达高峰(P<0.05),14d恢复正常(P>0.05)。提示BDNF表达的变化可能与脊髓可塑性有关。     

大鼠脊髓全横断损伤后脊髓caspase-3的表达变化

目的观察大鼠脊髓全横断(SCT)后横断端细胞凋亡及caspase-3 mRNA、蛋白的表达变化并探讨其意义。方法SD大鼠90只,手术组(SCT组)动物选择在T10节段全横断脊髓,假手术组除不横断外其余步骤相同。TUNEL法检测脊髓横断端凋亡情况,免疫组织化学、RT-PCR、Western blot技术检测不同时间点caspase-3 mRNA、蛋白表达变化。结果SCT后横断端脊髓灰质白质均检测到凋亡细胞,caspase-3在损伤周围组织呈阳性,RT-PCR、Western blot显示1d组基因及蛋白均明显上调,3d、7d、14d、21d组mRNA逐渐下降,且3d组依然高于假手术组;3d、7d、14d组蛋白逐渐下降而21d组又略有回升,且3d、21d组依然高于假手术组。结论SCT后凋亡主要在早期出现,随时间进展呈逐渐下降趋势。     

大鼠脊髓全横断后TrkA和TrkB在前角运动神经元的表达

为了探讨脊髓全横断损伤后神经营养因子受体表达的变化 ,本研究取大鼠 C6 和 L5节段脊髓进行 Trk A和 Trk B的免疫组织化学反应。用 HPIAS-10 0 0高清晰度彩色图像细胞测量系统检测免疫阳性神经元的数量和平均灰度。结果显示 ,大鼠脊髓全横断后 ,两种受体 Trk A和 Trk B在运动神经元的表达均出现短暂上调 ,其中 Trk A在颈段的表达高峰出现在损伤后 14 d而腰段为损伤后 7d;与此不同 ,Trk B在颈段和腰段两个部位的表达高峰均出现在 3d。在高峰之后 ,两种受体的表达均下降 ,至术后2 8d已接近或低于正常水平。提示 ,大鼠脊髓全横断损伤后 ,神经营养因子特异性受体 Trk A和 Trk B的表达有一定的时空规律 ,即损伤后 Trk B的表达由短暂上调到表达下降 ,随之出现 Trk A的表达高峰 ,意味着 Trk B的表达下降可能促进 Trk A的表达     

NT-3基因修饰施万细胞与神经干细胞联合移植治疗全横断脊髓损伤的实验研究

为探索一种治疗急性脊髓损伤的新策略 ,本实验先用核荧光标记培养的神经干细胞 (NSCs) ;再用含神经营养素 3基因的腺病毒 (AdvNT 3)感染培养的施万细胞 (SCs) ,简称NT 3 SCs。然后建立大鼠全横断脊髓损伤模型 ,向损伤处分别移植NSCs、SCs +NSCs和NT 3 SCs +NSCs。所有动物存活 6 0d后 ,进行爬网格测验和BBB评分。接着在脊髓横断处远端组织内注射荧光金 (FG) ,动物再存活 7d。在处死动物前检测皮质运动诱发电位 (CMEP)和皮质体感诱发电位 (CSEP)。最后灌注固定动物 ,取材和切片并行形态学观察。结果显示 :1 NSCs能在损伤…     

挤压伤后脊髓神经元NGF表达的变化

本研究运用免疫组织化学 ABC法和灰度值测定探讨脊髓挤压伤后 NGF在脊髓腹角和背角神经元表达的早期变化。结果显示 :NGF主要分布于脊髓灰质神经元的胞核及胞浆 ;腹角阳性神经元数量在损伤后 2 1d组较正常组明显增多 (P<0 .0 1) ,而背角的阳性神经元在损伤后 2 4h、7d及 2 1d组均较正常组明显增多 (P<0 .0 1)。腹角和背角神经元的阳性灰度值在挤压伤后各组均较正常组显著降低 (P<0 .0 1)。提示 ,内源性 NGF增加对脊髓损伤修复具有重要作用     

大鼠脊髓半横断损伤后脊髓神经细胞凋亡与caspase-3的表达

为研究损伤脊髓神经细胞凋亡和相联系的caspase-3的表达,用原位末端标记法(TUNEL)检测了成年大鼠胸脊髓(T9)半横断损伤(hSCI)后脊髓神经细胞的凋亡变化,并用免疫组织化学染色方法观察了caspase-3的表达。结果显示:hSCI后6h损伤侧脊髓腹角即出现较多的TUNEL阳性神经细胞,并持续至5周。损伤脊髓的吻侧段于手术后4d达高峰,尾侧段脊髓于伤后1d达高峰。与假手术组相比,在所有观察的时间点TUNEL阳性神经细胞的数量在损伤侧均有明显增加。caspase-3免疫组化染色显示,与假手术组相比,伤后6h损伤侧脊髓腹角caspase-3表达也明显增加,并持续至5周。以上结果提示hSCI后,脊髓可出现神经细胞凋亡,且此凋亡的发生可能与caspase-3的表达有关。     

大鼠脊髓全横断后神经营养素-3在红核表达的变化

目的:研究大鼠脊髓全横断后神经营养素-3(NT-3)在红核表达的变化,为进一步探索脊髓损伤后的再生修复机制和神经营养因子治疗脊髓损伤提供实验依据。方法:雄性SD大鼠36只随机分为3组,脊髓横断组:大鼠脊髓在胸10~11节段之间完全横断,按存活时间不同又分为术后1、3、7及14d组;假手术组(只行椎板切除术);正常对照组。动物到达存活时间点后,应用免疫组织化学ABC法和图像分析技术检测NT-3在红核的表达。结果:对照组和实验组红核有NT-3阳性细胞。脊髓全横断后红核NT-3的表达逐渐增高,于术后7d达高峰,后缓慢下降。结论:脊髓全横断后红核对NT-3的表达增加,内源性NT-3的增加可能有利于受损的红核内神经元的存活与再生。     

针刺对脊髓全横断SD大鼠BDNF基因表达的影响

目的探讨电针刺对脊髓全横断成年SD大鼠脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic fac-tor,BDNF)mRNA在横断脊髓上端、下端、大脑皮质和比目鱼肌中的表达及变化的影响。方法建立40只SD大鼠脊髓全横断损伤模型,雌雄不限,随机分为针刺1d、3d、7d、14d和手术1d、3d、7d、14d组,每组5只,选"足三里 悬钟"及"三阴交 伏兔"2组穴位隔天交替针刺。采用RT-PCR技术检测各时间段脊髓横断上、下端、大脑皮质、比目鱼肌四部位中BDNF mRNA的表达。结果针刺14d组比目鱼肌中BDNF mRNA较手术14d组显著增加(P<0.05)。结论电针刺可促进BDNF在损伤部位所支配的肌肉-靶组织中的表达。     

移植神经干细胞促进脊髓全横断大鼠结构与功能修复的研究

目的 探讨移植神经干细胞对脊髓全横断性大鼠部分结构与功能修复的影响。方法 在脊髓全横断处移植神经干细胞60d后，在横断处下方3mm注射荧光金逆行标记轴突再生的上运动神经元，用免疫组织化学检测神经干细胞在宿主内的分化，同时用体视学方法观测脑干红核和大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层的神经元密度变化。用BBB评分法和爬网格法观测大鼠后肢运动功能的恢复等。结果 移植的神经干细胞能在宿主内存活并向前后方向迁移到脊髓内，部分神经干细胞分化为GFAP、NF-200和GAP-43阳性细胞。移植神经干细胞后在红核和感觉运动区内锥体细胞层可见有被荧光金标记的神经元胞体，脊髓横断处附近脊髓组织的溃变程度减轻，红核及躯体感觉运动区内神经元密度高于未移植组，大鼠后肢的自主运动功能明显好于未移植组。结论 神经干细胞移植入损伤脊髓后能分化为神经元及神经胶质细胞，能减轻脊髓的继发性损伤，保护受损伤的神经元，促进运动功能的恢复。     

大鼠脊髓半横断损伤对脊髓versican、 CD44表达的影响

目的:观察大鼠脊髓半横断损伤(HSCI)对硫酸软骨素蛋白多糖versican及CD44在脊髓中表达的影响,为进一步探索脊髓损伤后的再生修复机制提供实验依据.方法:成年SD大鼠随机分为假手术对照组和HSCI 3、 7和14d组.建立成年大鼠HSCI(胸9～10)模型.取损伤位点头尾段胸9、胸10节段制作冷冻切片,用免疫组织化学ABC法和图像分析技术检测脊髓内versican和CD44的表达.结果:Versican阳性产物主要分布于细胞外基质中,腹角神经元和胶质细胞的胞质中也有分布;CD44阳性产物主要分布于细胞外基质及腹角神经元和胶质细胞的胞质中.损伤后脊髓内versican表达较对照组明显增加,CD44表达也较对照组明显增加.结论:HSCI后versican与CD44表达都增加,两者可能相互作用共同参与损伤后轴突生长被抑制这一过程.     

Temporal changes in the level of neurotrophins in the spinal cord and associated precentral gyrus following spinal hemisection in adult Rhesus monkeys

Neurotrophins (NTs) appear to be crucial for the survival and potential regeneration of injured neurons. However, their temporal changes and remote regulations following spinal cord injury (SCI) have been only partially determined, especially in primates. In this study, ELISA was performed on the extracts of injured spinal cord and the associated precentral gyrus contralateral to the site of spinal cord hemisection to investigate the temporal changes in the levels of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3) and neurotrophin-4 (NT-4) in adult rhesus monkeys subjected to T8 spinal hemisection. Animals were allowed to survive 3, 7, 14, 30 and 90 days post-operation (dpo). In the spinal cord, the levels of NGF, BDNF and NT-3 sharply decreased between 3 and 7dpo. Thereafter, the levels of NGF and BDNF were transiently elevated while NT-3 level continuously increased and recovered to normal level at 30dpo. In the contralateral precentral gyrus (cPG), only the NT-3 level was altered and in fact elevated above the normal value. No obvious changes were observed in NT-4 level in any of the regions studied. Taken together, the present findings indicated that intrinsic NGF, BDNF and NT-3 may play a local role in the responses to the SCI in primates. Especially, the increase of NT-3 level occurred continuously in both the cPG and the spinal cord pointed to a possible transportation of NT-3 to the cord following SCI.     

部分背根切断后备用DRG卫星细胞NGF、BDNF和NT-3的表达变化

为探讨部分去背根猫备用背根节 ( L6 )卫星细胞 NGF、BDNF和 NT-3的表达变化 ,将成年雄猫 2 0只分为正常对照组和术后 3 d、术后 7d及术后 10 d三个实验组。实验组行单侧部分背根切断术 (切除一侧 L1 ～ L5,L7～S2 DRG,保留 L6 背根为备用根 )。取正常组一侧和术后 3 d、7d及 10 d实验组手术侧的 L6 DRG制作 2 0μm厚冰冻切片 ,行免疫组化反应 ;观察 NGF、BDNF和 NT-3在 DRG卫星细胞的分布 ,计数各组 L6 DRG的 NGF、BDNF和 NT-3的阳性卫星细胞数量。结果发现 ,部分去背根术后7d和 10 d组 L6 DRG的 NGF、BDNF和 NT-3的阳性卫星细胞数量较术后 3 d组和正常组者明显增高 ( P<0 .0 1)。表明 ,单侧部分背根切断导致备用 DRG卫星细胞的 NGF、BDNF和 NT-3的表达上调 ,这一变化可能与脊髓可塑性有关。     

BDNF,NGF和NT-3的mRNA和蛋白在猫左侧腰第六背根节共表达的不同方式(英文)

本实验研究了脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF),神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的mRNA和蛋白在猫左侧腰第六背根节(dorsal root ganglion,DRG)共表达的不同方式,并探讨了共表达的机制,为阐明神经营养因子的表达与脊髓可塑性的关系提供依据。本实验所使用的为未接受任何处理的健康猫。猫的左侧腰第六DRG被取出,行免疫组织化学染色与原位杂交方法结合的双重标记,确定是否有BDNF,NGF和NT-3的蛋白与mRNA共表达。实验结果显示BDNF,NGF和NT-3的蛋白与mRNA在猫DRG均有表达,但这三种神经营养因子mRNA和蛋白共表达的方式是不同的。免疫组化结果显示:BDNF阳性产物主要分布于细胞质和细胞核,细胞核的染色颜色较细胞质浅;NGF阳性产物主要分布于细胞核;NT-3阳性产物主要分布于细胞质。原位杂交结果显示:BDNF和NGF阳性信号主要分布于细胞质;NT-3阳性信号在细胞质和细胞核都有分布。由此可见,BDNF,NGF和NT-3的mRNA和蛋白在猫左侧腰第六DRG有不同的共表达方式,提示它们可能存在与脊髓可塑性有关的自分泌和/或旁分泌机制。     

NGF,BDNF,NT-3和GDNF在背根节不同神经元的配布的免疫组织化学证据

为了探讨神经生长因子、脑源性神经生长因子 ,神经营养素 -3,胶原细胞源性神经生长因子在成年猫背根节神经元不同大小细胞的分布。取 L6背根节制成 2 0μm厚冰冻切片 ,用上述四种因子抗血清进行免疫组化反应。计数每一种因子阳性大、中、小型 (小于 42μm者为小型神经元 ;42～ 5 7μm者为中型神经元 ;大于 5 7μm者为大型神经元 )神经元的百分数。结果证明 ,此四种因子在背根节大、中、小神经元的阳性百分数分别为 :1.2± 0 .7,2 .1± 0 .9,3.3± 1.1;1.7± 0 .4,11.2± 1.2 ,30 .0± 1.5 ;2 6 .7± 2 .2 ,6 .2± 1.2 ,13.2± 2 .9;2 7.4± 3.3,8.1± 1.7,2 0 .1± 2 .4。表明 :在成年猫 L6背根节仅存在少数神经生长因子阳性细胞 ,而脑源性神经生长因子则主要配布于中、小神经元 ,神经营养素 -3和胶质细胞源性生长因子的免疫阳性细胞主要是大神经元 ,但也包括一些中小神经元。提示此四种因子在成年猫背根节的生理功能可能与神经元的不同大小有关。     

Expression of some neurotrophins in the spinal motoneurons after cord hemisection in adult rats

There are numerous studies reporting on the crucial roles of neurotrophins (NTFs) in neuronal survival and sprouting after spinal cord injury (SCI). But studies on endogenous changes of neurotrophins after SCI are few. In this study we explored by means of immunohistochemistry the localization of NGF, BDNF and NT-3 in the normal adult spinal cord (SC) and the changes in the expression of these chemicals in the ventral horn after right cord hemisection at T9-10. The results showed an obvious increase in the numbers of NGF, BDNF and NT-3-immunoreactive neurons in the ventral horn and also an increase in their intracellular optical density (O.D.) at 3, 7 and 21 days after cord hemisection, when compared with sham-operated rats. The expression of NGF peaked at 7 days postoperation (dpo), while BDNF and NT-3 expressions peaked at 3 dpo. Evaluation of hindlimb functions by Basso Beattie Bresnahan (BBB) scoring showed that the hindlimb support and stepping function improved very quickly at 7 dpo. This study indicated that NGF, BDNF and NT-3 could play important but different roles in the mechanisms of spinal neuroplasticity at different times after SCI.     

大鼠脑组织NT-3融合蛋白的表达、纯化及抗体制备

目的克隆大鼠脑组织神经营养素3(NT-3)基因,原核诱导表达并纯化,制备高效价抗体,为研究其对周围神经损伤修复的影响提供实验基础。方法用RT-PCR法扩增目的基因,依次克隆入pMD-18T载体及亚克隆入pRSET-A原核表达载体。导入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定后用镍柱纯化。免疫家兔制备特异性抗体。结果RT-PCR得到777 bp的片断,酶切鉴定及测序证实与GeneBank中大鼠NT-3序列一致,成功构建了原核表达载体pRSET-A-NT-3。导入BL21诱导得到一条约34 ku的新蛋白带。免疫家兔获得1∶64000的高效价特异性抗大鼠NT-3血清。     

NGF、BDNF和NT-3在正常成年大鼠主要脑区表达的免疫组织化学研究

目的研究神经生长因子(NGF)﹑脑源性神经营养因子(BDNF)﹑神经营养素-3(NT-3)在正常成年大鼠主要脑区的表达。方法将正常成年大鼠用4%多聚甲醛灌注固定后取脑制成20μm厚的冰冻切片,应用上述3种因子的抗体进行免疫组织化学染色。结果3种因子的表达既有共同点也有不同点:共同点是在主要脑区都能表达,不同点是在单个细胞中,BDNF主要表达于胞浆边缘;NGF在大部分神经元的整个细胞都表达,但少量神经元则在胞核无表达;NT-3则与BDNF相似。结论3种因子在正常成年大鼠主要脑区都能表达。     

新生儿肠闭锁NT-3与Trk-C表达研究

目的了解神经节细胞NT-3、Trk-C、Nf蛋白和神经胶质细胞GFAP蛋白在肠闭锁中的分布情况,并探讨其临床意义.方法应用免疫组化技术检测15例先天性小肠闭锁患儿肠壁内NT-3、Trk-C、GFAP和Nf的表达情况,并以死于与肠道发育异常无关的尸检新生儿小肠标本6例作为正常对照.结果肠闭锁组肌间神经丛NT-3阳性细胞数明显低于对照组的阳性细胞数(t'=9.9000,P<0.05).Trk-C在对照组肠壁肌间神经丛中存在高表达,而在肠闭锁组存在低表达(t=22.2991,P<0.05).对照组肠壁肌间神经丛胶质细胞GFAP呈阳性表达,而肠闭锁组GFAP呈强阳性表达.Nf在对照组中的表达明显高于闭锁组.结论先天性小肠闭锁的近端肠壁内存在有神经节细胞的减少和神经干的变细,支持细胞在闭锁近端肠壁中呈增生表现.这种肠壁肌层神经丛的改变,可能会引起肠腔内压力减低,从而影响闭锁区域肠道的功能.