三种不同方法诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的对比研究

目的对比地塞米松、游离脂肪酸、高糖高胰岛素3种不同方法诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量及葡萄糖转运子4(Glut4)的表达。方法采用3种不同方法诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗,分别检测各组细胞12、24、36、48、60 h时的葡萄糖消耗量及Glut4蛋白的表达。结果在24 h内,地塞米松组、游离脂肪酸组、高糖高胰岛素组细胞的葡萄糖消耗量与正常对照组比较均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);在24 h以后,游离脂肪酸组葡萄糖消耗量与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);而地塞米松组葡萄糖消耗量相较正常对照组仍显著降低,高糖高胰岛素组葡萄糖消耗量较地塞米松组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。地塞米松组及游离脂肪酸组的Glut4表达水平较正常对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);相对于地塞米松组及游离脂肪酸组,高糖高胰岛素组的Glut4表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论高糖高胰岛素能够诱导3T3-L1脂肪细胞产生更强的胰岛素抵抗,这种抗性的产生可能是因为抑制了Glut4蛋白的表达获得的。     

内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

目的观察内质网应激(ERs)抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)对ERs诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的干预效果,探讨脂肪细胞IR与ERs的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞。以MTT比色法检测不同干预条件下脂肪细胞存活情况、以葡萄糖氧化酶法(GOD)法检测不同干预条件下脂肪细胞葡萄糖消耗情况,利用Western blot检测不同干预条件下ERs关键信号蛋白(P-IRE、IRE)的表达差异。结果 (1)5μg/mL TM作用5h后可使胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量降低19.7%(P<0.05),而1mmol/L TUDCA预处理24h后均可缓解TM的抑制作用。(2)Westernblot显示,5μg/mL TM作用5h明显增加P-IRE的表达,而经1mmol/L TUDCA预处理24h后可减少P-IRE的表达。不同处理因素对总IRE的表达无明显影响。结论 ERs可诱导3T3-L1脂肪细胞发生IR,缓解ERs可减轻IR。     

IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立

目的探讨3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞（insulin resistant 3T3-L1 adipocytes cell, IR-3T3-L1）最佳的建立条件。方法采用
地塞米松（Dexamethason,DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）和不同浓度的胰岛素（10-8、10-7、
10-6 mol·L-1）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,Oil red O染色确定最佳胰岛素诱导浓度,继而用1 μmol·L-1 DEX
诱导建立IR-3T3-L1 脂肪胰岛素抵抗细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（Glucose oxidase-peroxidase, GOD-POD）法对
IR-3T3-L1细胞的最佳诱导时间（24~120 h）及其稳定时间（24~48 h）进行了考察。结果Oil red O染色发现3T3-L1前脂肪细胞
用DEX、IBMX和10-6 mol·L-1胰岛素诱导9 d,>90% 的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;用1 μmol·L-1 DEX培养96 h后,脂肪
细胞葡萄糖消耗率达到最大（P=0.0003）;稳定时间考察发现,在36 h内葡萄糖消耗与对照组比较有统计学意义（P<0.001）。结
论3T3-L1前脂肪细胞在1 μmol·L-1 DEX、0.5 mmol·L-1 IBMX 和10-6 mol·L-1最佳胰岛素浓度作用下诱导分化为成熟的脂肪细
胞后,用1 μmol·L-1 DEX培养96 h即可成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪胰岛素抵抗细胞,且在36 h内稳定。
     

地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的 应用地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞,探讨建立方便可靠的胰岛素抵抗(IR)细胞模型的方法. 方法 3T3-L1前脂肪细胞经1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,将其与10 nmol/L和100 nmol/L、1 μmol/L地塞米松共孵育,100 nmol/L胰岛素作用30 min刺激脂肪细胞糖转运.以葡萄糖氧化酶法测定培养液中残余的葡萄糖含量,观察地塞米松对脂肪细胞糖摄取的影响,鉴定IR模型. 结果 地塞米松抑制胰岛素诱导前后的脂肪细胞糖转运,抑制作用呈剂量依赖性,其中1 μmol/L地塞米松的抑制率分别为80%及75%(P＜0.05). 结论 地塞米松可诱导3T3-L1脂肪细胞产生IR,这种细胞模型简便、可靠.     

血清淀粉样蛋白A在3T3-L1脂肪细胞的表达及其与胰岛素抵抗的关系

目的 了解血清淀粉样蛋白A(SAA)在3T3-L1脂肪细胞的表达情况及其与胰岛素抵抗的关系.方法 用3种不同浓度的地塞米松(10、100、1000nmol/L)建立3种不同程度的脂肪细胞胰岛素抵抗模型(分别称为模型组1、模型组2、模型组3),同时设立空白对照组.采用2-脱氧-3H-D-葡萄糖摄入法检测葡萄糖的摄入情况.以葡萄糖摄入减少的百分比反映胰岛素抵抗程度;RT-PCR技术检测各组SAAmRNA的表达,ELISA检测SAA蛋白的表达.结果 各组基础状态下葡萄糖的摄取率无明显差异(P>0.05);胰岛素刺激后模型组1、模型组2、模型组3的葡萄糖摄取率分别比对照组减少了15%(P<0.05)、40%(P<0.01)、55%(P<0.01);SAAmRNA的表达量分别是对照组的2.5(P<0.01)、3.33(p<0.01)、4.08倍(P<0.01);SAA蛋白表达量分别是对照组的2.05(P<0.05)、3.13(P<0.01)、4.23倍(P<0.01);相关分析显示3T3-L1脂肪细胞SAA mRNA的表达量(r=0.773,P<0.01)和蛋白表达量(r=0.832,P<0.01)与胰岛素抵抗程度均呈正相关.结论 采用地塞米松干预3T3-L1脂肪细胞可成功建立胰岛素抵抗模型;脂源性炎症因子SAA与胰岛素抵抗密切相关,它可能是胰岛素抵抗的一个标记物.     

熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型CAP表达的影响

目的：观察熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗、摄取及细胞分化的影响,并探讨其作用机制。方法：将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,用高糖、高胰岛素联合诱导胰岛素抵抗模型。使用葡萄糖氧化酶法检测3T3-L1细胞葡萄糖消耗量,氚标葡萄糖法检测其葡萄糖摄取量,以评价模型建立情况。用四唑盐（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法检测不同浓度熊果酸对3T3-L1脂肪细胞活力的影响以确定实验药物浓度。加入不同浓度熊果酸分组干预,用氚标葡萄糖法检测脂肪细胞葡萄糖摄取量;用油红O色法检测3T3-L1脂肪细胞分化情况;用实时荧光定量聚合酶链反应法、蛋白质印迹法分别观察熊果酸对3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型细胞分化相关蛋白脂肪细胞脂类结合蛋白、基质金属蛋白酶1和原癌基因Cbl相关蛋白（c-Cbl-associatedprotein,CAP）表达的影响。结果：在成功建立胰岛素抵抗模型的基础上,使用MTT法检测细胞活力。确定熊果酸的作用浓度在4～20μmol／L。与模型组相比,低、高剂量熊果酸组（10、20μmol／L）及罗格列酮组（5μmol／L．）葡萄糖摄取均明显升高（P〈0．01）;低、高剂量熊果酸组3T3-L1脂肪细胞分化程度低于对照组和罗格列酮组。熊果酸可明显上调3T3-I,1细胞胰岛素抵抗模型CAPmRNA及蛋白的表达（P〈0．01）。结论：熊果酸改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的同时可抑制其分化,这一机制可能与熊果酸上调脂肪细胞CAP的表达有关。     

3T3-L1脂肪细胞与胰岛素抵抗脂肪细胞miRNAs表达谱的差异性分析

目的探讨正常3T3-L1脂肪细胞和胰岛素抵抗(IR)脂肪细胞微小RNA(miRNAs)的差异性表达,并进行初步分析。方法采用高糖(25 mmol/L葡萄糖)/高胰岛素液(1μmol/L)处理3T3-L1脂肪细胞24h,通过葡萄糖摄取实验判断IR脂肪细胞模型的建立;接着通过miRNA芯片技术,检测脂肪细胞和IR脂肪细胞中miRNAs的表达,并对其分析;随后借助生物信息学方法,对显著变化的2个miRNAs(miR-320和miR-21)寻找并筛检其可能调控的靶基因。结果共获得79个IR相关miRNAs(29个低表达,50个高表达,其中miR-320显著上调,miR-21显著下调),且筛选出与IR或糖尿病相关的靶基因共13个。结论获得了3T3-L1脂肪细胞和IR脂肪细胞miRNAs的差异性表达谱,为进一步研究这些miRNAs在IR和糖尿病的发病机制中的作用奠定了基础。     

小檗碱与梓醇及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运子4蛋白及C-Cb1相关蛋白表达的影响

目的观察梓醇与小檗碱及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗及这一过程中葡萄糖转运子4(Glut4)和C-Cb1相关蛋白(CAP)表达的影响。方法采用高糖联合高胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗(IR),分别给予小檗碱、梓醇、小檗碱 梓醇、盐酸罗格列酮进行干预,以葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖消耗量,以Western Blotting法检测Glut4和CAP蛋白的表达。结果与模型组相比,小檗碱能增加培养液中葡萄糖的消耗,但对Glut4蛋白的表达无影响;梓醇、小檗碱 梓醇均能显著增加培养液中葡萄糖的消耗,并使细胞中Glut4蛋白的表达增强,且小檗碱 梓醇组的效应优于梓醇组及小檗碱组;与模型组相比,小檗碱与梓醇及其配伍对CAP的表达没有显著性影响。结论小檗碱、梓醇及其配伍能改善IR 3T3-L1脂肪细胞的胰岛素活性,其作用机制与罗格列酮不同。     

高浓度葡萄糖诱导脂肪细胞产生胰岛素抵抗

目的 观察不同浓度的葡萄糖对脂肪细胞葡萄糖转运的影响,探讨建立胰岛素抵抗细胞模型的方法。方法 首先诱导3T3-L1和SW872两株前脂肪细胞分化,然后分别用25.50mmol/L的葡萄糖刺激分化成熟的脂肪细胞．采用2-Deoxy[3^H]-D-glucose掺入法测定脂肪细胞葡萄糖转运,同时测定相应的细胞总蛋白,以每毫克蛋白的衰变数来反映葡萄糖转运的情况。结果 ①胰岛素明显刺激3T3-L1和SW872脂肪细胞的葡萄糖转运．与基础葡萄糖转运相比．差异有显著性意义（P＜0.01）.25、50mmol/L葡萄糖均可影响3TS-L1和SW872脂肪细胞的葡萄糖转运，与基础葡萄糖转运相比，差异有显著性意义（（P＜0.01））②25、50mmol/L。葡萄糖均可影响3T3-L1脂肪细胞的基础葡萄糖转运（P〈0．05）．并减弱胰岛素诱导的葡萄糖转运（P〈0．01）．但高糖组之间差异无显著性意义，③25、50mmol/L葡葡糖对SW872脂肪细胞的基础葡萄糖转运无明显影响（P〉0．05）．但能减弱胰岛素诱导的葡萄糖转运（P＜ 0．01）。结论 高糖可以诱导3T3-L1和SW872两株脂肪细胞产生胰岛素抵抗．为深入研究胰岛素抵抗的发生、发展提供了新的细胞模型。     

柚皮素对3T3-L1和HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取能力和胰岛素敏感性的影响

目的 探讨柚皮素(Naringenin,Nar)对3T3-L1和HepG2细胞胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)模型葡萄糖摄取能力和胰岛素敏感性的影响.方法 采用含0.5 mM IBMX、1μM地塞米松、10 mg/L胰岛素的诱导液将3T3-L1细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,采用高糖/高胰岛素诱导建立3T3-L1和HepG2细胞IR模型;按照空白组、正常组、IR模型组、对照药物IR组以及不同浓度Nar干预IR组;以M T T法检测细胞增殖;以葡萄糖氧化酶法(GOD)检测细胞对葡萄糖的摄取量.结果 与正常组细胞相比,3T3-L1和HepG2 IR模型组细胞增殖受到抑制、葡萄糖摄取量减少以及对胰岛素敏感性减弱(P<0.001);Nar干预IR模型组能明显促进IR细胞的增殖,增加IR细胞的葡萄糖摄取和增强对胰岛素的敏感性(P<0.001).结论 Nar对3T3-L1和HepG2细胞IR模型葡萄糖摄取能力降低和胰岛素敏感性改变有改善作用,可以作为防治IR的一种手段.     

甘精、地特、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响

目的探讨甘精、地特、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响。方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,诱导分化成熟后加入含有1nmol／L、10nmol／L、100nmol／L、1000nmol／L甘精、地特、人胰岛素的基础培养基培养24h,并设立基础培养基组为空白对照组,培养24h,RT-PCR方法检测脂肪细胞脂联素mRNA水平。结果100nmol／L、1000nmol／L甘精、地特、人胰岛素均抑制脂联素mRNA的表达中,1000nmol／L胰岛素的抑制作用强于100nmol／L胰岛素。地特胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素及甘精胰岛素。甘精胰岛素的抑制作用弱于人胰岛素。结论高浓度甘精、地特、人胰岛素均不同程度抑制3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA的表达。     

罗格列酮抗氧化应激效应影响3T3-L1细胞内脏脂肪素表达

目的:研究罗格列酮对3T3-L1细胞内脏脂肪素表达的影响及其机制。方法:体外培养并诱导分化3T3-L1细胞,加入葡萄糖激酶制作氧化应激模型,并用不同浓度和不同作用时间罗格列酮干预,观察脂肪因子表达的变化。结果:内脏脂肪素的表达随着葡萄糖激酶氧化应激的浓度增高而递减,具有剂量依赖效应(P<0.05);内脏脂肪素的表达随着罗格列酮干预浓度增加而增加(P<0.05),随着罗格列酮作用时间的延长,内脏脂肪素的表达经历了先下降后上升的过程,且罗格列酮对于内脏脂肪素表达的影响与氧化应激状态的改变平行。结论:罗格列酮可以通过抗氧化应激作用调节内脏脂肪素的表达,可能在罗格列酮改善肥胖相关的2型糖尿病胰岛素抵抗中起到重要作用。     

葡萄糖和胰岛素对脂肪细胞内脂素表达的作用

 目的  观察脂肪细胞经不同浓度葡萄糖和胰岛素干预后内脂素表达的改变,探讨内脂素在糖尿病发病过程中的作用。 方法  培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导分化成成熟脂肪细胞。采用不同浓度葡萄糖、胰岛素孵育脂肪细胞48h,RT-PCR和western blot技术检测3T3-L1脂肪细胞中内脂素mRNA和蛋白的表达水平 结果  与对照组比较,随着葡萄糖浓度的增加,3T3-L1脂肪细胞内脂素mRNA和蛋白的表达量下降（P均＜0.05）;在不同浓度胰岛素作用下,3T3-L1脂肪细胞内脂素mRNA和蛋白的表达量改变无统计学意义（P＞0.05）。  结论  高糖状态可抑制体外培养的脂肪细胞内脂素的表达,胰岛素浓度的改变对内脂素表达无影响。     

LRP16蛋白在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化中表达量的变化

目的 LRP16蛋白在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达量的变化及胰岛素对脂肪细胞LRP16蛋白表达的调控。方法经典脂肪细胞诱导方案诱导前脂肪细胞为成熟脂肪细胞,每天（0-8d）均留取蛋白标本。不同浓度（0、1、10、100nmol/L）胰岛素刺激脂肪细胞24h,分别留取蛋白标本。Western-Blot方法检测样本中LRP16蛋白的表达量。结果 LRP16蛋白在前脂肪细胞无表达或极低表达,从诱导的第3、4天开始表达,迅速升至高峰,此后维持在高表达水平。LRP16蛋白在第6-8天之间表达水平无统计学差异（P〉0.05）,其余各时段间表达水平均有显著差异（P〈0.01）。不同浓度胰岛素刺激脂肪细胞24h,细胞中LRP16蛋白表达量与胰岛素浓度呈负相关（P〈0.01）。结论 LRP16蛋白随着前脂肪细胞分化的开启,表达量从无到有逐渐增加至高峰,并一直维持在高表达水平;胰岛素（INS）负调控脂肪细胞LRP16蛋白的表达。     

MiRNA-27a对3T3-L1细胞胰岛素抵抗的作用及机制简

目的研究miRNA-27a对3T3-L1细胞葡萄糖摄取的影响,并初步探讨其作用机制。方法通过肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactoralpha,TNF-α）诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的细胞模型,观察miRNA-27a对3T3-L1细胞葡萄糖摄取的影响,酶联免疫吸附（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELlSA）检测细胞培养上清中白细胞介素6（interleukin6,IL-6）的变化,Westernblot检测细胞内总Akt和磷酸化Akt的变化。结果miRNA-27a明显抑制3T3-L1细胞对胰岛素诱导的葡萄糖的摄取,miRNA-27a可促进炎症因子IL-6的产生并抑制Akt的磷酸化。结论miRNA-27a可促进脂肪细胞产生胰岛素抵抗,其作用可能通过抑制胰岛素信号通路P13K／Akt实现。     

胰岛素、地塞米松、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对3T3-L1脂肪细胞脂肪水孔蛋白表达的调节作用

目的通过细胞培养研究胰岛素样生长因子-1(IGF鄄1)、地塞米松对成熟脂肪细胞水孔蛋白(Aquaporinadipose,AQPap)基因表达的影响,并与胰岛素的作用相比较,以此了解AQPap基因表达的影响因素,探讨其在肥胖及糖尿病发病中所起作用。方法用不同浓度(10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)的胰岛素、IGF鄄1(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)及地塞米松刺激液(10-6、10-7、10-8mol/L)刺激诱导分化第9天的3T3鄄L1细胞6h;提取细胞RNA,运用半定量RT鄄PCR技术,检测AQPapmRNA表达量的变化。结果与对照组相比,10-9mol/L胰岛素刺激细胞6h可使AQPap基因表达下降16%,10-6mol/L胰岛素使之下降超过50%。IGF鄄1也降低AQPap的基因表达,但相同浓度(10-7mol/L)刺激下,IGF鄄1的作用要弱于胰岛素(P<0.05)。地塞米松对AQPapmRNA的表达量无明显影响,不过,同时给予10-6mol/L的地塞米松和胰岛素与单用10-6mol/L胰岛素相比,AQPapmRNA的表达量有所上升(P<0.05)。结论胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap的表达起抑制作用,并呈剂量及时间依赖性。IGF鄄1也有抑制作用,但较胰岛素弱。地塞米松能够拮抗胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap基因表达的下调作用。