APA微囊猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的探讨APA微囊猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的有效性。方法用胶原酶灌注分离猪肝细胞,用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)包埋肝细胞,测定肝细胞产量和存活率。用氨基半乳糖诱导建立大鼠急性肝功能衰竭(fulminatehepaticfailure,FHF)模型(n=68),实验动物分为微囊肝细胞植入组、游离肝细胞植入组、空囊组、对照组4组。分别将微囊肝细胞、游离肝细胞、空微囊、生理盐水植入或注入FHF大鼠腹腔,观察治疗效果。结果分离肝细胞产量为1.74×1010～2.90×1010个,微囊肝细胞存活率>80%。APA微囊肝细胞组与游离肝细胞、空囊和对照组相比,能提高FHF大鼠存活率,延长存活时间,改善肝功能。结论APA微囊猪肝细胞腹腔移植治疗FHF大鼠有较好疗效。ExperimentalStudyonHepaticFailureRatInstitute,Tianjin300170AbstractObjectiveThepaticfailurerat.Methpolylysine-alginate(APA(FHF)ratsweresetup     

微囊化肝细胞移植进展

肝细胞分离技术日趋成熟,肝细胞移植成为较热门的研究领域,但供体短缺和免疫排斥反应,制约了其广泛应用.微囊技术的进步,解决了这一矛盾.     

用微囊肝细胞治疗大鼠急性肝功能衰竭

用Ｄ－氨基半乳糖诱发大鼠急性肝功能衰竭，微囊肝细胞腹腔内植入能提高急性肝功能衰竭大鼠的存活率，延长存活时间，改善肝功能，避免排斥反应，为临床急性肝功能衰竭治疗开辟一条新路。     

肝衰竭肝细胞移植治疗时的"种子细胞"

目前,对肝衰竭治疗主要依赖于原位肝移植,但这一治疗手段因存在多方面的困难而难以广泛开展。肝细胞移植的出现以其独特的优点将成为原位肝移植的辅助治疗甚至会替代原位肝移植。但是,肝细胞移植时最佳细胞来源的选择又成为我们面临的一个紧迫的课题,现用于研究的细胞来源多为骨髓干细胞(包括间充质干细胞和造血干细胞)、脐血干细胞及胚胎干细胞等,且在实验研究方面都取得了不同程度的研究进展。通过对这几种细胞分化为肝细胞的实验研究进展作综述,为肝细胞移植时“种子细胞”的选择打下理论基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。 目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。 结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

微囊化大鼠胰岛细胞移植治疗糖尿病小鼠的实验研究

观察微囊化和未囊化大鼠胰岛细胞移植治疗糖尿病小鼠的疗效。选用SD大鼠经胆总管原位灌注胶原酶液,分离消化胰腺组织,用淋巴细胞分离液(Histopaque-1077)纯化胰岛细胞,将微囊化和未囊化大鼠胰岛细胞移植于糖尿病小鼠腹腔。分离的胰岛细胞对刺激反应良好,微囊化和未囊化胰岛细胞移植后均可纠正糖尿病小鼠的高血糖状态,但未囊化胰岛细胞移植组只能维持血糖正常2~3d,而微囊化胰岛细胞移植组可持续降低血糖30d以上。微囊化胰岛细胞移植治疗糖尿病小鼠具有良好的效果,微囊具有较好的免疫隔离作用。     

胚胎干细胞源性神经前体细胞移植脑缺血大鼠局部细胞的免疫反应

背景：神经前体细胞的免疫原性各家研究结果不一,尤其是体内移植后的机体免疫反应模式需要进一步研究。 目的：体外观察神经前体细胞组成型及诱导型主要组织相容性抗原表达情况;体内观察神经前体细胞移植入大鼠脑缺血组织后局部免疫细胞活化情况,探讨神经前体细胞的移植排斥可能性及模式。 方法：自pCX-hrGFP ES-D3胚胎干细胞诱导分化神经前体细胞,流式细胞术体外检测主要组织相容性抗原Ⅰ,Ⅱ类分子表达及γ-干扰素诱导前后表达变化。实验分3组,磷酸盐缓冲液组、神经前体细胞组分别于大脑中动脉缺血大鼠模型造模后经侧脑室给予磷酸盐缓冲液注射及神经前体细胞移植,假手术组不造模。免疫组化法观察纹状区ED1+、CD4+、CD8+细胞浸润情况;淋巴细胞再刺激增殖实验观测神经前体细胞诱导移植大鼠颈部淋巴细胞的增殖指数。 结果与结论：神经前体细胞组成型高表达主要组织相容性抗原Ⅰ类分子,几乎不表达主要组织相容性抗原Ⅱ类分子;经γ-干扰素诱导后,主要组织相容性抗原Ⅰ类分子进一步上调,主要组织相容性抗原Ⅱ类分子亦有轻度上调,提示神经前体细胞有可能引起机体免疫反应。移植实验表明,与假手术组相比,磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组均表现强烈的ED1+、CD4+、CD8+细胞浸润(P < 0.05),说明脑缺血损伤本身能导致局部免疫细胞活化;神经前体细胞组比磷酸盐缓冲液组有更强的ED1+、CD4+细胞浸润(P < 0.05),提示神经前体细胞移植可能导致局部免疫更进一步活化,且以CD4+T细胞反应为主。磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组神经前体细胞诱导下的增殖指数值均较假手术组升高(P < 0.01),但前两组增殖指数值比较差异无显著性意义(P > 0.05),提示脑组织局部炎症导致颈部淋巴细胞增殖性增加,而离体神经前体细胞不足以单独刺激致敏淋巴细胞增殖。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

胚胎干细胞源性树突状细胞对同源性神经前体细胞脑内移植耐受诱导

目的:观察脑缺血环境下胚胎干细胞源性树突状细胞(es DCs)能否诱导同源性神经前体细胞(NPCs)的移植耐受。方法:分别自129/svj p CX-e GFP ES-D3诱生NPCs及129/svj ES-D3诱生es DCs。线栓法制作MCAo模型SD大鼠并相应分为预处理组及对照组,术后1周预处理组经尾静脉注射es DCs而对照组注射PBS,两组动物在预处理1周后侧脑室注射NPCs,2周后(MCAo术后4周)免疫组化观察纹状区CD4+、CD8+、ED1+细胞的分布差异,MTT法观察颈部淋巴细胞增殖性(PI),逆转录PCR(RT-PCR)半定量局部IL-10、IFN-γmRNA表达差异,荧光显微镜观察GFP标记NPCs海马存活率。结果:预处理组大鼠,CD4+细胞浸润显著低于对照组(134.7±36.2 vs 198.8±59.6,P0.05),NPCs存活率显著高于对照组(P0.05),但预处理组对ED1+(298.8±75.9 vs 302.2±88.5)、CD8+(145.8±45.4 vs 134.3±39.0)细胞浸润、局部细胞因子mRNA IFN-γ(1.697±0.273 vs 1.829±0.250)、IL-10(1.147±0.260 vs 1.264±0.119)及外周淋巴细胞增长率(PI,1.245±0.211 vs1.331±0.235)无明显影响。结论:es DC可能通过降低局部CD4+细胞反应诱导针对同源性NPCs免疫耐受,尚无确切证据表明细胞因子途径参与该过程,确切的机理尚需更深入研究。     

内皮前体细胞促骨髓间充质干细胞向肝样细胞转化中的VEGF-Notch信号通路

背景:在前期研究中发现骨髓血管内皮前体细胞在体外培养过程中通过旁分泌的方式产生了能够促进骨髓间充质干细胞分化的因子,血管内皮生长因子是其中之一.目的:探讨骨髓血管内皮前体细胞促进骨髓间充质干细胞向肝样细胞转化中是否有VEGF-Notch信号通路参与.方法:①分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞和骨髓血管内皮前体细胞,将第3...     

肝细胞移植的研究进展

肝细胞移植作为治疗暴发性肝功能衰竭及各种终末期肝病一种安全有效的方法在各种动物模型及临床应用中得到广泛证实,具有创伤小、安全简单、可一肝多用、重复移植、抗原性低等优点。就其细胞来源、移植途径、理论基础及应用等方面的研究进展综述如下。     

肝干细胞移植治疗大鼠暴发性肝功能衰竭的实验研究

目的探索肝干细胞移植对暴发性肝功能衰竭大鼠的治疗效果。方法以二乙酰氨基芴(15mg/kgBW)联合2/3肝切除建立雄性大鼠肝干细胞增殖模型,以改进Seglen胶原酶原位灌注及Percoll密度梯度离心方法分离、纯化肝干细胞,经肝脏注射移植(4×106细胞)治疗由D-氨基半乳糖诱导的暴发性肝功能衰竭雌性大鼠,移植前及移植后24、48、72h及1周取血测定肝功能指标如血氨、ALT、TBiL,移植后1、2、4周取受体肝脏组织应用PCR方法进行性别决定因子检测。结果肝干细胞移植可延长暴发性肝功能衰竭大鼠的中位生存时间(P<0.05),移植后肝干细胞移植组大鼠血清ALT、TBiL及血氨水平明显下降,其测定值各时间点组间比较,治疗组明显低于对照组(P<0.01);肝脏病理损伤减轻,肝干细胞移植2周后雌性受体肝脏组织中性别决定因子呈阳性表达,且随时间延长而表达增强。结论肝干细胞移植可延长暴发性肝功能衰竭大鼠中位生存时间,改善肝功能及病理指标。     

Therapeutic effect comparison of hepatocyte-like cells and bone marrow mesenchymal stem cells in acute liver failure of rats

Goals: To evaluate the therapeutic efficacy of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) induced into hepatocyte-like cells and of un-induced BMSCs in acute liver failure rats. Methods: BMSCs in highly homogenous passage 3 were cultured using the whole bone marrow adherent culture method. Hepatic-related characters were confirmed with morphology, RT-PCR analysis, glycogen staining and albumin (ALB) immunofluorescence assay. Carbon tetrachloride (CCl4) was injected intraperitoneally to establish an acute rat liver failure model. Hepatocyte-like cells or un-induced BMSCs were respectively injected into the models to examine rats’ appearance, liver function assay and liver tissue pathology. Results: Hepatocyte-like morphology, higher expression of cytokeratin 18 (CK18) mRNA and ALB protein, and glycogen accumulation were confirmed in the induced BMSCs. The transplanted DAPI-labeled BMSCs were localized in the liver tissue 3-14 days after transplantation. The levels of liver function indicators (AST, ALT, ALP, and TBIL) from transplanted rats were significant decreased and pathology was improved, indicating the recovery of liver function. However, the differences were statistically insignificant. Conclusion: Both hepatocyte-like cells and un-induced BMSCs had a similarly positively therapeutic efficacy on liver regeneration in rat liver failure model.     

Liver regeneration by small hepatocyte-like progenitor cells after necrotic injury by carbon tetrachloride in retrorsine-exposed rats

Liver regeneration after partial hepatectomy (PH) in rats exposed to the pyrrolizidine alkaloid retrorsine is accomplished through the proliferation and differentiation of a population of small hepatocyte-like progenitor cells (SHPCs). The activation, emergence, and outgrowth of SHPCs in response to the liver deficit generated through surgical PH have been well characterized. However, the participation of these cells in the restoration of hepatocyte numbers and regeneration of liver tissue mass following necrotic injury has not been investigated. To investigate the capacity of SHPCs to respond to necrotizing liver injury, we combined retrorsine treatment with the centrilobular-specific toxin carbon tetrachloride (CCl₄). Male Fischer 344 rats were treated with retrorsine (30 mg/kg ip) at 6 and 8 weeks of age, followed by CCl₄ treatment (1500 mg/kg ip) 5 weeks later. Liver tissues were harvested at 3, 7, 14, 21, and 30-days post-injection. The dose of CCl₄ employed resulted in the necrotic destruction of 59 ± 2% of liver mass and elicited a regenerative response equivalent to that of surgical PH. Livers from retrorsine-exposed CCl₄-treated rats exhibit SHPC proliferation similar to retrorsine-exposed rats subjected to PH (RP). SHPCs appear at 3-days post-injection, continue to expand at 7-days and 14-days post-injection, and completely regenerate/restore the liver mass and structure in these animals by 30-days post-injection. The magnitude of SHPC response observed in the undamaged periportal zone of the liver in these animals is unaffected (versus RP rats) by the loss of the centrilobular region. The results of this study show that SHPCs are capable of regenerating liver after exposure to necrotizing agents and suggest that the progenitor cell of origin of the SHPCs is not restricted to the centrilobular zone of the liver parenchyma.     

hUCMSCs腹腔移植治疗大鼠急性肝损伤后的病理变化

目的本研究拟对CCl所致大鼠急性肝损伤模型应用人脐带间充质干细胞(humanum bilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)进行治疗,观察其效果。方法将健康雌性150-170gSD大鼠随机分为3组:正常对照组(N,n=8),CCl_4组(C,n=32)及CCl_4+MSCs组(T,n=32)。N组不予任何处理;T组和C组腹腔注射10%(V/V)四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)橄榄油溶液制造急性肝损伤模型后24h,分别经腹腔移植hUCMSCs和等量PBS。肝功能测定、病理组织学方法观察移植前后大鼠肝功能及肝脏结构改善情况。结果 CCl腹腔注射24h后大鼠肝脏的HE染色示弥漫性肝小叶中心带肝细胞气球样变或脂肪变性,可见炎性细胞浸润。4随着观察时间的推移,上述组织学变化均好转,T组较C组更早更快的恢复,7d时肝脏结构完全恢复正常,C组7d时仍可见脂滴或气球样变,14d才恢复正常肝脏组织结构。MSCs移植后3d,T组与C组比较,肝损伤大鼠的ALT(p<0.05)及AST(p<0.01)水平明显降低,说明MSCs移植可降低CCl_4所致大鼠肝脏损伤的ALT及AST水平。47d后,所有观察组的ALT及AST均降至正常水平。结论鼠腹腔移植hUCMSCs后可以在一定程度上改善肝功能及修复受损的肝组织。     

急性肝功能衰竭急诊肝移植围术期治疗的单中心经验探讨

背景：急性肝衰竭行急诊肝移植患者围手术期治疗的病情复杂,风险大,并发症多,死亡率高,与普通肝脏移植有着明显不同。 目的：总结急诊肝移植治疗急性肝功能衰竭的围手术期治疗经验,以提高急性肝功能衰竭的治疗成功率。 方法：回顾性分析38例因急性肝功能衰竭行急诊肝移植患者的临床资料,男21例,女17例,年龄15-69岁。其中乙型肝炎病毒性肝炎23例(其中乙型合并丁型肝炎2例),Wilsons病7例,3例为毒蕈中毒,2例不明原因药物肝脏损害,1例雷公藤多甙中毒,1例为外伤行肝脏部分切除后失代偿,1例尸体肝移植后患者。 结果与结论：38例患者生存时间为13-1 740 d,中位生存时间为634 d。患者的围手术期存活率为76%,1年存活率为63%,2年存活率为58%。9例围手术期死亡原因包括脑水肿及颅内高压、肾功能衰竭、严重肺部感染、多脏器功能衰竭、凝血功能障碍(颅内出血、上消化道出血等)、急性成人呼吸窘迫综合征、移植物原发性无功能。目前急诊肝移植仍是治疗急性肝功能衰竭最有效的方法,出血、感染、排异反应是死亡的主要原因,肝移植围手术期间每一环节的处理,对于肝移植的成功和患者长期存活具有重要意义。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

Acute hepatic failure: limitations of medical treatment and indications for liver transplantation

Dedicated to Prof. Dr. G. Paumgartner on the occasion of his 60th birthday     

Functional aftereffects of intraparenchymatous injection of human fetal stem and progenitor cells to rats with chronic and acute renal failure

Chronic renal insufficiency was modeled in rats by unilateral nephrectomy and electrocoagulation of both poles of the remaining kidney; acute renal failure was induced by 90-min clamping of the vascular pedicle of the only kidney. Injection of unfractionated culture of human fetal kidney cells or bone marrow mesenchymal stem cells into damaged kidney restored its function in rats with chronic renal insufficiency (observation period up to 2 months). After 2.5 months a relapse of chronic renal insufficiency was observed in 1 of 3 rats receiving human fetal kidney cells and in 1 of 2 animals receiving bone marrow mesenchymal stem cell culture. Injection of bone marrow mesenchymal stem cell culture to rats with acute renal failure improved recovery of renal function and prevented the death from uremia, while injection of total culture of human fetal kidney cells had virtually no effect on the course of acute renal failure. __________ Translated from Kletochnye Tekhnologii v Biologii i Medicine, No. 2, pp. 70–76, April, 2006     

异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤大鼠

背景：成体肝前体细胞可在受体肝脏内定植并分化为肝细胞。不过,异种肝前体细胞移植能否促进急性肝损伤的恢复,脾脏微环境能否促进移植物的存活和向肝细胞分化,尚没有研究。 目的：评价异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤的作用;监测移植肝前体细胞在大鼠脾脏实质内的定植及向肝细胞的分化。 方法：体外培养雄性小鼠来源的肝前体细胞系肝上皮样前体细胞。通过CCl4腹腔注射联合2/3肝切除构建急性肝损伤大鼠模型,进行肝上皮样前体细胞脾脏移植。在肝切除后1,5,14和21 d,苏木精-伊红染色观察肝脏病理改变,全自动生化分析仪监测血清转氨酶变化,PCR反应检测脾脏组织Y染色体特异性序列Sry,脾脏CK-19和Alb免疫组织化学追踪移植肝上皮样前体细胞的植入和肝细胞分化。 结果与结论：肝上皮样前体细胞可在体外长期培养,保持增殖能力和双向分化潜能。肝上皮样前体细胞脾脏移植后,肝损伤大鼠肝细胞肿胀明显减轻,丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶下降更明显。移植后1,5,14和21 d,脾脏DNA中均能检测到Sry序列。在整个实验期间CK-19阳性细胞在大鼠脾脏实质内始终存在。Alb阳性细胞在移植后5 d在脾脏实质中出现,随后阳性细胞数逐渐增多。实验表明,移植肝前体细胞能在大鼠脾脏实质中植入,并分化为肝细胞,能有效促进CCl4腹腔注射联合2/3肝切除诱导的大鼠急性肝损伤的修复过程。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

小鼠胚胎肝祖细胞的分离和扩增培养

目的从胎龄14.5 d的C57小鼠胚胎肝脏中分离、培养小鼠胚胎肝祖细胞(m HPCs),并将其诱导分化为胆管细胞。方法用荧光激活细胞筛选法(FACS)分选DLK1表面抗原阳性的小鼠胚胎肝细胞,并和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)Transwell共培养或者单独培养。细胞免疫荧光检测刚分选和共培养4和6 d的DLK1~+细胞的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)及细胞角蛋白19(CK19)抗原的表达。结果体外共培养时,大部分DLK1~+细胞分裂增殖明显,呈葡萄状聚集生长。第4天,部分细胞开始贴壁增殖,形态开始变成梭形。结果显示,分选的DLK1~+细胞表达AFP和少量ALB,但不表达CK19;在共培养的第4天其开始表达CK19,和微弱表达ALB;第6天,其高表达CK19,而几乎不表达的ALB。结论应用FACS技术成功从E14.5胎肝细胞中分选出DLK1~+细胞并鉴定其大部分为mHPCs,并可在体外与MEFs Transwell共培养的条件下,诱导培养其分化为胆管细胞。