大劣按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的探讨大劣按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化的相互关系.方法将雌大劣按蚊成蚊分为吸糖水组、正常小白鼠血组和约氏疟原虫感染血组,以挤压法收集各组的血淋巴,解剖中肠并利用超声波提取其蛋白,继而对血淋巴和中肠蛋白进行SDS-PAGE分离,Western blot检测丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶的表达差异,并利用免疫组织化学进行血细胞丝氨酸蛋白酶与前酚氧化酶的定位检测.结果 SDS-PAGE显示吸糖水大劣按蚊有34条蛋白带,而吸正常小鼠血和吸感染血蚊血淋巴有35条蛋白带,而且在分子量约160×103和66×103的蛋白差异带显著,吸正常血及感染血后表达增强.吸糖水和吸正常小白鼠血组血淋巴丝氨酸蛋白酶呈现2条带,分子量分别约160×103和150×103,3组蚊血淋巴前酚氧化酶呈现1条带,分子量约66×103,吸正常小鼠血和吸感染血组蚊1 d后血淋巴丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶表达均显著上调,尤其疟原虫感染后表达最强.感染1 d后中肠前酚氧化酶带型明显增宽.免疫酶化学显示,丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶在血细胞内均呈颗粒状分布,血细胞外血淋巴液内有少许散在颗粒分布.结论约氏疟原虫卵囊黑化期间,大劣按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶表达增强,提示二者可能参与了卵囊黑化包裹反应.     

约氏疟原虫卵囊黑化期间大劣按蚊血淋巴蛋白的分析

目的　初步探讨大劣按蚊 (Anophelesdirus)黑化包被约氏疟原虫 (Plasmodiumyoelii)卵囊相关蛋白。方法　挤压法分别收集血餐后第 1、3、4、5天时不吸血组、吸正常血组和感染组的雌大劣按蚊血淋巴 ,经SDS PAGE分离后 ,银染显色。同时 ,用烟草天蛾 (ManducaSexta)前酚氧化酶 (Prophenoloxidase ,PPO)亚基 1IgG检测正常雌大劣按蚊血淋巴中的PPO。结果　SDS PAGE发现感染约氏疟原虫后 ,部分大劣按蚊的血淋巴蛋白带增强 ,而部分血淋巴蛋白带却减弱 ,免疫印迹发现大劣按蚊血淋巴PPO有 87× 10 3 、6 7× 10 3 、6 3× 10 53条蛋白带 ,而相应分子量的 3条蛋白带在约氏疟原虫感染后第 4、5天开始增强 ,其中尤以 87× 10 3 的增强最为明显。结论　大劣按蚊在对约氏疟原虫卵囊黑化包被期间诱导合成的某些血淋巴蛋白与前酚氧化酶级联反应主要成分有关联     

约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO4基因转录与卵囊内Ca2+的影响

目的观察约氏疟原虫感染对大劣按蚊前酚氧化酶(prophenoloxidase, PPO)基因转录的影响与卵囊黑化期间囊内Ca2 的变化,探讨疟原虫感染不易感蚊种时卵囊黑化的相关机制.方法分别在大劣按蚊吸血感染约氏疟原虫前与感染后1、2、3和5 d抽提蚊总RNA进行RT-PCR,PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后扫描进行凝胶图像分析,并对所得数据进行统计学处理.在吸血感染后5、7、11和15 d解剖分离按蚊中肠,以荧光染料Fluo-3/Am作为卵囊内Ca2 指示剂,利用共聚焦扫描显微镜观察不同时期约氏疟原虫卵囊内Ca2 的分布及变化.结果吸血感染约氏疟原虫前大劣按蚊PPO4基因的RT-PCR扩增产物较少,但感染后明显增加(P<0.01),尤其在感染后1 d与2 d最为明显;约氏疟原虫未黑化卵囊内Ca2 为(137.15±7.02) nmol/L,完全黑化卵囊内Ca2 为(18.44±1.75) nmol/L、并在囊壁出现明显的钙沉着.结论吸血感染约氏疟原虫后大劣按蚊PPO4基因转录比感染前明显增强,黑化卵囊内Ca2 较未黑化卵囊明显减少,并有外排现象.     

感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白分析

目的获得并分析感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白.方法利用二维电泳方法分别分离感染约氏疟原虫前后的大劣按蚊血淋巴蛋白,进行考马斯亮蓝染色,并利用PDQuest 2D Elite软件分析和比较凝胶结果;对感染约氏疟原虫前后的差异表达蛋白进行质谱分析,获得肽质量指纹图谱;利用Mascot软件系统,在Swiss-Prot等数据库中检索和分析所获得的肽质量指纹图谱.预测差异表达蛋白的生物学特性和在卵囊黑化中的功能.结果获得了分辨率和重复性均较好的二维电泳图,感染组凝胶可见120个蛋白点,正常组凝胶可见95个蛋白点,二者比较分析后发现有37个差异蛋白点;质谱分析获得3个肽质量指纹图谱,于蛋白数据库检索后未发现匹配分值很高的相关蛋白,其中差异蛋白点1与冈比亚按蚊一蛋白具有较高的同源性.结论获得了感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异蛋白和部分差异蛋白的相关信息,这为从蛋白水平认识蚊媒和疟原虫的相互关系和更深入地利用大劣按蚊-约氏疟原虫模型开展卵囊黑化的相关研究奠定了基础.     

约氏疟原虫感染诱导大劣按蚊AdSP1 和AdSP3的转录

目的观察丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊主要组织中的表达,分析血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞AdSP1 和AdSP3转录的影响.方法离心收集血细胞,解剖分离大劣按蚊蚊胃和唾液腺,提取相应的总RNA,RT-PCR扩增;然后将同批3～5 d龄大劣按蚊分为正常组(N)、吸正常血组(B)和感染约氏疟原虫组(I),分别在血餐后1、2、3、4、7 d和11 d,收集3组各50只雌大劣按蚊血细胞和提取总RNA,以Ads7为内参照,进行半定量RT-PCR分析.结果丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊血细胞和唾液腺中表达,不在蚊胃表达;吸血和约氏疟原虫感染后,大劣按蚊血细胞中AdSP1 和AdSP3的转录上调,尤以约氏疟原虫黑化期间明显.结论 AdSP1和AdSP3可能参与大劣按蚊对约氏疟原虫的黑化反应,并可能是大劣按蚊的PPAE.     

斯氏按蚊血淋巴在约氏疟原虫卵囊黑化时差异表达蛋白的SDS-PAGE分析

目的　初步了解约氏疟原虫感染后的雌斯氏按蚊成蚊吸饲硝喹蔗糖水和蔗糖水后不同时间的血淋巴蛋白差异表达。方法　挤压法分别收集两组雌斯氏按蚊成蚊 1～ 5d的血淋巴 ,经SDS PAGE ,考马斯亮蓝和银染显色 ,Bio Rad10 0 0凝胶图像分析系统进行扫描和差异蛋白条带的自动化分析。结果　用药第 2天少数蚊卵囊开始部分黑化 ,第 5～9天黑化蚊及其黑化卵囊逐渐增多。用药后第 3天处理组蚊血淋巴蛋白条带数明显多于对照组 ,两组间存在较多差异蛋白带 ,主要集中在 ( 2 0～ 40 )× 10 3、( 60～ 80 )× 10 3和 13 0× 10 3处。银染比考马斯亮蓝染色出现的蛋白条带数多。结论　约氏疟原虫感染的雌斯氏按蚊成蚊吸饲硝喹糖水后其血淋巴蛋白表达有差异 ,其差异蛋白很可能就是黑化相关蛋白     

斯氏按蚊黑化包被约氏疟原虫卵囊时血淋巴蛋白的二维电泳分析

目的以斯氏按蚊-约氏疟原虫为模型,用二维电泳技术分析比较约氏疟原虫感染后雌性斯氏按蚊吸饲硝喹蔗糖水和蔗糖水蚊血淋巴蛋白差异.方法用挤压法分别收集吸硝喹糖水3 d、吸感染血和吸蔗糖水雌斯氏按蚊成蚊血淋巴,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度,继而对血淋巴进行双向电泳,凝胶考马斯亮蓝染色,ImageMaster VDS-CL对二维电泳凝胶蛋白斑点扫描和用ImageMaster 2D Elite软件进行蛋白质斑点自动分析.结果用药组血淋巴蛋白浓度总是低于吸感染血组和吸糖水组,用药组蚊血淋巴蛋白点有101个,对照组有115个,有51个蛋白点相同.50个仅在用药组中检测到,64个仅在对照组中检测到;蛋白点的分子量和等电点主要位于(40～60)×103和碱性端.结论二维电泳技术可直接反映蛋白质的差异,其蛋白浓度和白点的差异与硝喹诱导疟原虫卵囊黑化有关.     

青蒿琥酯对食蟹猴疟原虫在按蚊体内发育的影响

目的 观察青蒿琥酯(Artesunste)对食蟹猴疟原虫在大劣按蚊体内发育的影响。方法 受疟原虫感染实验猴在肌注和静注青蒿琥酯各60mg之前、之后0h、2h各感染一批大劣按蚊；另取部分药前感染的大劣按蚊在感染后第3天和10．5天吸药血，另设一对照组吸正常猴血。各组实验蚊均在感染后第9天解剖蚊胃和第13天解剖涎腺，观察疟原虫在蚊体内发育情况。结果 药前组和药后0h组的蚊胃及唾腺感染阳性率均为100％，两组蚊胃卵囊平均密度、卵囊平均大小、子孢子平均感染度都无显性差异(P＞0．5)；药前组和药后2h组蚊胃卵囊平均密度有显性差异(P＜0．5)；大劣按蚊感染后第3天和10．5天吸药血组和吸正常血组，蚊胃卵囊平均密度、卵囊大小、子孢子平均感染度都无显性差异(P＞0．1，P＞0．5)。结论 青蒿琥酯对食蟹猴疟原虫在蚊体内的配子生殖、孢子增殖及子孢子进入唾腺无直接的抑制作用。     

约氏疟原虫感染斯氏按蚊后血淋巴PPO的酶解激活

目的了解约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊是否发生黑化相关性酶级联反应.方法挤压法收集雌斯氏按蚊成蚊血淋巴,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度,然后对血淋巴进行一维和二维SDS-PAGE,继而利用Western印迹分析比较PPO蛋白点的差异.结果约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊之前的血淋巴蛋白二维凝胶电泳后的Western印迹的PVDF膜上出现2个分子量均约为64×103、等电点分别约为7.4和7.6的两个PPO蛋白点,感染后发现8个蛋白点,36×103分子量处3个,等电点分别约为7.2、7.4和8.0;30×103分子量处5个,等电点分别约为7.0、7.2、7.5、7.6和7.8.结论约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊之前的血淋巴PPO以异二聚体形式结构性表达于血淋巴内,感染后PPO发生免疫激活反应和酶学分解过程,提示PPO参与疟原虫卵囊黑化包被反应.     

与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库构建

目的 构建与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵差异新基因奠定基础.方法 以大劣按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后14 d的大劣按蚊作为T 组和D 组,采用抑制差减杂交方法和T/ A克隆技术构建按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入...     

蒿甲醚对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育影响

目的 研究蒿甲醚对约氏疟原虫在大劣按蚊体内发育的影响及其机制.方法 本课题利用已经建立的斯氏按蚊-约氏疟原虫模型,通过吸饲蒿甲醚糖水的方法,观察蒿甲醚是否影响约氏疟原虫在斯氏按蚊体内的发育.通过RT-PCR方法,分析NOS、TEP1和PPO三个斯氏按蚊重要的免疫反应相关基因的表达变化,以了解青蒿素类药物蒿甲醚影响疟原虫...     

二维电泳-质谱分析斯氏按蚊中约氏疟原虫卵囊黑化相关的差异表达蛋白

目的　用 2 DE和PMF分离和鉴定约氏疟原虫卵囊黑化相关的斯氏按蚊中肠和血淋巴差异表达蛋白。方法　用固相pH梯度二维电泳分离中肠和血淋巴差异表达蛋白 ,考马斯亮蓝染色 ,ImageMasterVDS CL凝胶扫描和PDQuest2DElite软件分析 ,差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱 ,用PeptIdent软件查询SWISS PROT数据库。结果　获得了分辨率和重复性均较好的 2 DE考马斯亮蓝图谱 ,吸硝喹糖水组蚊血淋巴和中肠蛋白点分别有 10 1个和 10 4个 ,感染组分别有 115个和 162个 ,匹配点分别为 5 1个和 44个。斯氏按蚊血淋巴和中肠蛋白质组中蛋白点分别主要分布于酸性端和碱性端 ,血淋巴和中肠差异蛋白也分别主要分布于酸性端和碱性端。随机取2 5个差异蛋白点进行胶内原位酶解 肽质指纹图谱分析得到了 16个蛋白质肽质指纹图 ,查询数据库初步鉴定了 8个蛋白质 ,分别为与抗疟免疫、黑化、结构、糖代谢、细胞通讯等相关蛋白。结论　建立了一套重复性和分辨率较好的斯氏按蚊蛋白质分离和鉴定的二维凝胶电泳 肽质谱指纹分析法 ,约氏疟原虫卵囊黑化前后 ,斯氏按蚊血淋巴和中肠伴随大量差异表达蛋白 ,部分蛋白可能与黑化有关。     

SCANNING ELECTRON MICROSCOPIC OBSERVATIONS ON LATE SPOROGONIC STAGES OF DEVELOPMENT OF PLASMODIUM FALCIPARUM

Five batches of Anopheles dirus, after taking blood meal from 3 Plasmodium falciparum infected patients were dissected 10-17 days later. 46 midgut specimens of these infected mosquitoes were examin ed with the scanning electron microscope (SEM). The surface features of early and late stage oocysts were similar to those described for other species of P. but those of the sporoblast and sporozoite ap peared somewhat different from those described by us earlier for P. yoelii yoelii, P. cynomolgi and P. vivax. It seems that the SME morphological charac- teristics, especially those of sporoblasts and sporo zoites can be utilized in differentiating these Plasmodium species.     

大劣按蚊丝氨酸蛋白酶AdSP3的组织定位和定量研究

目的 对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶3(AdSP3)的表达进行组织定位和定量研究.方法 首先利用RT-PCR方法对大劣按蚊血淋巴细胞、唾液腺和蚊胃进行AdSP3的扩增,然后利用Realtime PCR对大劣按蚊感染约氏疟原虫后不同时相点的血淋巴细胞AdSP3表达水平进行定量研究.结果 从血淋巴细胞和唾液腺均成功扩增出目的片段;...     

蚊血细胞对正常和退变之约氏疟原虫卵囊的反应及其在卵囊黑化中之作用

感染约氏疟原虫之斯氏按蚊，饲以1％二氟甲基鸟氨酸，使卵囊发生退变，第11天电镜下分别观察退变卵囊及对照组正常发育之卵囊外周血细胞之反应。结果表明，对照组中正常发育卵囊之周围无明显血细胞反应，但个别退变卵囊有血细胞趋附；用药组中卵囊均呈不同程度之退变，有的已开始黑化，其周围均有一个或多个血细胞，均属颗粒类细胞。血细胞胞浆内及血细胞与卵囊之间均有许多具微管结构之颗粒，提示卵囊退变后可诱使血细胞趋附，后者并可释放颗粒物质或许还有他种物质，促使包被卵囊和黑化卵囊。     

斯氏按蚊MyD88基因生物信息学分析及其在抗约氏疟原虫感染中的作用

目的 对斯氏按蚊MyD88基因进行生物信息学分析,并研究其在抗约氏疟原虫感染中的作用。方法 首先,通过VectorBase数据库获取斯氏按蚊MyD88基因cDNA序列,并利用VectorNTI、DNAMAN等软件对MyD88基因cDNA序列进行生物信息学分析。然后,根据MyD88的cDNA序列设计Real-time PCR引物,提取斯氏按蚊总RNA,通过反转录合成 cDNA,利用Real-time PCR方法检测MyD88基因在蚊各个生活史阶段转录水平情况及其在约氏疟原虫感染后的转录水平变化。结果 斯氏按蚊MyD88基因位于斯氏按蚊KB664619号染色体155 163~158 066 bp的反义链上,包含两个外显子,其cDNA全长1 383 bp,编码460个氨基酸。系统发育树结果显示,斯氏按蚊与大劣按蚊和冈比亚按蚊系统发育的距离近,其氨基酸序列同源性达79%。对斯氏按蚊各时期MyD88基因转录水平的研究结果显示,吸食正常血和感染血均能够上调MyD88的转录,吸血后3 d和5 d吸感染血组MyD88基因转录水平上调明显,显著高于正常血组和未吸血组。结论 本研究证实了Toll信号通路中的MyD88基因在蚊抗疟原虫感染的天然免疫中发挥了重要作用,在感染后3 d时作用明显。     

大劣按蚊AdS7基因的克隆及分析

目的克隆AdS7基因cDNA序列,为大劣按蚊基因定量研究提供内参照.方法采用RT-PCR扩增、TA克隆技术获得AdS7 cDNA部分序列,标记地高辛AdS7探针,从大劣按蚊cDNA文库中筛选得到AdS7全长克隆,以半定量RT-PCR方法研究血餐和约氏疟原虫感染对其表达水平的影响.结果从大劣按蚊cDNA克隆得到长464 bp的AdS7基因cDNA部分序列,从大劣按蚊cDNA文库筛选获得了长871 bp的AdS7基因全长克隆,大劣按蚊吸血和感染约氏疟原虫后24 h,AdS7表达水平没有显著变化.结论 AdS7基因可作为大劣按蚊基因定量研究的内参照.     

抗生素对重组约氏疟原虫BY265株感染斯氏按蚊的影响

目的 探讨抗生素对斯氏按蚊感染重组约氏疟原虫BY265-GFP株的影响.方法 在疟原虫感染斯氏按蚊前后分别饲含抗生素的糖水,分别于7 d、16 d观察蚊胃卵囊和唾液腺子孢子情况.结果 饲加入抗生素糖水组蚊胃感染度和感染率、唾液腺子孢子数量明显高于对照组.结论 抗生素可提高重组约氏疟原虫对斯氏按蚊的感染能力.     

温度对斯氏按蚊传疟能力的影响及分子机制初探

目的 研究环境温度对按蚊传疟能力的影响,并通过比较分析不同温度下斯氏按蚊天然免疫关键分子TEP1转录水平,初步探讨相关分子机制,为气候变化对疟疾传播和流行的影响提供理论依据。 方法 本研究利用斯氏按蚊-约氏疟原虫动物模型,分别在24 ℃和28 ℃的环境温度下利用约氏疟原虫感染斯氏按蚊,感染后9 d解剖蚊中肠,荧光显微镜下观察疟原虫卵囊发育情况并计数,比较不同温度条件下疟原虫感染率和感染度。然后,利用荧光定量PCR方法比较不同温度条件下,感染前后不同时间点的斯氏按蚊TEP1分子的转录水平。 结果 在24 ℃的环境温度下,斯氏按蚊的感染率为91.7%,感染度为(403.9 ± 37.09)个/蚊。在28 ℃的环境温度下,斯氏按蚊的感染率为38.8%,感染度为(38.63 ± 13.91)个/蚊。24 ℃组的按蚊感染率和感染度均显著高于28 ℃组（P<0.001）。于吸血感染当天但尚未吸血时和吸血感染疟原虫后的第5天、第7天及第9天,斯氏按蚊的TEP1转录水平在28 ℃的条件下均高于24 ℃,提示斯氏按蚊TEP1参与的感染前基础免疫力和疟原虫感染中后期的免疫杀伤力28 ℃组均高于24 ℃组。结论 环境温度对按蚊传疟能力的影响较大,24 ℃较28 ℃的环境更适宜于约氏疟原虫感染斯氏按蚊;TEP1参与的天然免疫反应可能是温度对按蚊传疟能力影响的原因和分子机制之一。