TPA基因克隆与体外表达模型建立

目的 重组TPA基因并构建体外表达模型，为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄奠定基础。方法 构建真核表达载体pcDNA3．1( )TPA，然后将pcDNA3．1( )TPA转入中国苍鼠卵巢(CHO)细胞，并观察外源性TPA表达情况。结果 真核表达载体pcDNA3．1( )TPA在CHO细胞表达量好，发色底物法测得外源性TPA活性为12．296IU／10^6细胞／24hr，未转pcDNA3．1( )TPA的CHO细胞测得为3．176IU／10^6细胞／24hr；酶联免疫实验(ELASA)检测结果为586．172ng／10^6细胞／24hr，未转pcDNA3．1( )TPA的CHO细胞测得为9．608ng／10^6细胞／24hr，达未转TPA基因组的60倍。结论 pcDNA3．1( )TPA转入CHO细胞后，外源性TPA基因获有效表达，为TPA临床基因治疗提供了理论依据。     

转人血管内皮生长因子基因内皮细胞的一氧化氮分泌研究

血管内皮生长因子(VEGF)是一种血管内皮的特异性生长因子，具有显著的促进内皮再生和新生血管形成作用。一氧化氮(NO)是强有力的血管舒张因子，在血管内皮细胞的增生和功能维护方面发挥着重要意义。本研究拟将pcDNA3．1( )／hVEGFl21真核表达质粒转染离体的人脐静脉内皮细胞，观察转基因内皮细胞分泌NO的能力水平，为基因修饰血管功能研究打下基础。     

花青素对人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶影响

目的研究花青素对人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶(MMP)1，2和9蛋白表达和活性的影响。方法分离人脐静脉内皮细胞，先用5mg／L人重组CD40配体(rCD40L)处理细胞24h，再分别用1，10，100μmol／L的花青素标准品矢车菊定-3-葡萄糖苷(C3G)和芍药定-3-葡萄糖苷(P3G)处理细胞24h。用Western Blotting分别检测MMP-1，MMP-2，MMP-9的蛋白表达量，用酶谱分析法检测MMP-1，MMP-2，MMP-9的活性水平。结果花青素C3G和P3G组的MMP-1，MMP-2，MMP-9的活力明显下降，且蛋白表达量也明显下降。结论花青素C3G和P3G能够降低rCD40L诱导的人脐静脉内皮细胞MMP-1，MMP-2，MMP-9的蛋白表达和活性水平，对于增加动脉粥样斑块的稳定性有重要意义。     

阿托伐他汀对IL-6诱导人脐静脉内皮细胞表达内皮抑素的影响

目的探讨阿托伐他汀对IL-6诱导的人脐静脉内皮细胞表达内皮抑素(ES)的抑制作用。方法采用IL-6和/或阿托伐他汀处理人脐静脉内皮细胞24～48h,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养人脐静脉内皮细胞上清液中ES浓度,RT-PCR检测ESmRNA的表达。结果 IL-6组48h时较对照组上清液ES浓度显著增加[(18.45±6.80)vs(6.81±2.33)ng/ml,P0.01],同时较24h时上清液ES浓度显著增加[(18.45±6.80)vs(7.07±2.54)ng/ml,P0.01];At+IL-6组与IL-6组48h时比较上清液ES浓度减少差异有统计学意义[(9.82±4.74)vs(18.45±6.80)ng/ml,P0.05]。IL-6组48h时与对照组比较ESmRNA表达显著增加[(0.587±0.220)vs(0.122±0.096),P0.001];At+IL-6组48h时与IL-6组相比ESmRNA表达减少差异有统计学意义[(0.310±0.205)vs(0.587±0.220),P0.05]。结论 IL-6可诱导人脐静脉内皮细胞分泌表达ES,阿托伐他汀对其分泌表达ES具有抑制作用。     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2．为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA，以其为模板采用聚合酶链反应（PCR）法获取SAP2基因，将真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC和SAP2基因行EcoRI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶纯化，连接酶切产物，转化TOP10感受态细菌，筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同，并定向插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）myc-HisC，电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3．1／SAP2重组质粒，该质粒能直接激活抗原提呈细胞，可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

香烟烟对血管内皮表达细胞间粘附分子-1的影响

目的探讨香烟烟对人血管内皮表达细胞间粘附分子-1的影响。方法以香烟烟为抗原刺激巨噬细胞株细胞,再用其上清液刺激人脐带静脉内皮细胞。采用ELISA法分别测定了经抗原刺激后3h、6h、12h、24h的巨噬细胞上清液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α);采用同样方法分析用抗原刺激巨噬细胞株细胞的上清处理血管内皮细胞3h、6h、9h、12h、24h培养基中可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)。结果随着处理时间的延长,TNF-α的表达量增多,实验组(4.967±0.802)pg/ml较对照组(3.181±0.214)pg/ml含量明显增加。统计结果提示,随孵育时间延长,sICAM-1表达的量增加,并且观察组(均数为0.0684ng/ml)比对照组(均数0.0459ng/ml)增加49%。结论香烟烟可以刺激人体最主要的抗原递呈细胞-巨噬细胞表达TNF-α,进一步使血管内皮细胞表达ICAM-1增加。     

VEGF165在哺乳动物细胞中的稳定表达

目的探讨pcDNA3．1-VEGF165质粒对哺乳动物细胞的表达和转染。方法将pcDNA3．1-VEGF165质粒用电转的方法导入CHO细胞中，C418筛选细胞克隆。通过RT—PCR、ELISA、Westen—blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF165在转基因CHO细胞中的表达。通过内皮细胞增殖实验和血管通透性实验检测所表达的VEGF165的生物学活性。结果获得有C418抗性的CHO细胞克隆。RT—PCR扩增出一条大小约600bp的特异性泳带，测序结果与VEGF165mRNA一致。ELISA显示细胞培养上清的VEGF浓度约为10-20ng／ml。WESTEN—BLOT检测到大小为23KD的特异性蛋白质条带。内皮细胞增殖实验显示细胞培养上清具有促内皮细胞增殖作用。血管通透性实验显示细胞培养上清明显增加毛细血管通透性。结论pcDNA3．1-VEGF165质粒真核表达系统能在哺乳动物细胞中表达具有良好生物学活性的VEGF165蛋白。     

氧化低密度脂蛋白促进内皮细胞MMP-9mRNA、LOX-1mRNA的表达及LOX-1在其中的作用研究

目的观察氧化低密度脂蛋白（OX．LDL）诱导人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶．9（MMP-9）mRNA、血凝素氧化型低密度脂蛋白受体1（LOX-1）mRNA的表达及LOX-1在表达中的作用。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,逆转录聚合酶链反应检测MMP-9mRNA和LOX-1mRNA的表达。并观察予以LOX-1的抑制剂多聚肌苷酸作用后,人脐静脉内皮细胞MMP-9mRNA表达的变化。结果与对照组比较（0．252±0．032,0．279±0．041）,OX—LDL作用后,人脐静脉内皮细胞MMP-9mRNA、LOX-1mRNA（25ng／组：0．486±0．012,0．586±0．02;50n舀／L组：0．668±0．011,0．739±0．014;100ng／组：0．817±0．030,0．872±0．003）表达明显增加,且诱导作用呈浓度-时间依赖性;与氧化低密度脂蛋白组（1．020±0．039）比较,多聚肌苷酸抑制后,MMP-9mRNA（0．872±0．046）表达明显下降。结论OX—LDL能促进内皮细胞MMP-9mRNA及LOX-1mRNA的表达,LOX-1参与了OX-LDL诱导内皮细胞MMP-9mRNA表达的过程。     

人脐静脉血管内皮细胞的体外培养及rhNDPK-A对其增殖的作用

目的：建立一种体外培养人脐静脉血管内皮细胞的方法，初步探讨rhNDPK-A蛋白对内皮细胞生长的影响。方法：采用胶原酶对新生儿脐带静脉血管进行消化，从中分离出血管内皮细胞，体外传代培养，通过MTS／PMS法测定不同浓度的rhNDPK-A蛋白对HUVEC体外增殖的影响。结果：成功获得体外培养的人脐静脉血管内皮细胞，从0．0610μg／m1到250μg／ml的rhNDPK-A蛋白对人脐静脉血管内皮细胞的增殖既没有抑制也没有促进作用。结论：建立了分离培养人脐静脉向管内皮细胞的方法，rhNDPK-A蛋白不是通讨抑制内皮血管细胞的增殖而抑制血管新生的。     

人细胞间黏附分子1cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3．1hisB-ICAM-1。方法 设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物，从肝癌组织中提取总RNA，以此为模板经RT-CR扩增人ICAM-1的cDNA片段；然后将其克隆到pGEM-T Easy Vector，构建中介重组体(pGEM-ICAM-1)，再克隆，构建真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1，经菌落PCR和限制性酶切有目的片段出现，进行DNA序列分析。结果 RT-PER扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1622bp，中介重组体(pGEM-ICAM-1)，酶切后与真核表达载体连接，根据酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1；结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1。     

多发性骨髓瘤恶性相关基因MYEOV2对NIH/3T3细胞生长的影响

目的　分析多发性骨髓瘤恶性相关基因MYEOV2对NIH/ 3T3细胞生长的影响。方法　将MYEOV2基因克隆到真核表达载体pcDNA3 1( +)上 ,并将阳性重组子通过脂质体转染入NIH/ 3T3细胞中 ,G418筛选获得转染阳性克隆并用RT -PCR检测MYEOV2基因的表达。运用流式细胞分类法、细胞生长曲线分析MYEOV2基因对NIH/ 3T3细胞生长的影响。结果　成功获得转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2的细胞阳性克隆。流式细胞分析显示转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2、转染空载体及未转染的NIH/ 3T3细胞的S期细胞分别为 3 0 9%、2 0 1%、16 1% ,前者较后两者S期细胞增多 ,有显著性差异 (P <0 0 5 )。细胞生长曲线显示转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2、转染空载体、未转染的NIH/ 3T3细胞的倍增时间分别为 13 6h、2 5 3h、2 7 4h ,前者细胞倍增时间较后两者缩短 ,有显著性差异 (P <0 0 5 )。结论　MYEOV2基因的表达增加促进DNA合成增加 ,细胞增殖加快 ,是多发性骨髓瘤瘤细胞恶性增殖的一个重要因素     

垂体肿瘤转化基因1对结肠癌SW480细胞增殖的影响及其机制研究

目的 研究垂体肿瘤转化基因 1(Pituitary Tumor Tansforming Gene1,PTTG1)过表达对人结肠癌细胞SW480增殖和周期的影响及其可能机制。方法 采用脂质体转染法将pcDNA3.1(+)-PTTG1及空载pcDNA3.1(+)质粒转染人结肠癌SW480细胞,G418法筛选阳性克隆。Western blot法检测PTTG1和cyclin D、cyclin E、p21的表达。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。结果 （1）成功获得PTTG1高表达的SW480细胞pcDNA3.1(+)-PTTG1及对照pcDNA3.1(+)细胞,Western blot结果显示pcDNA3.1(+)-PTTG1细胞PTTG1表达量分别为pcDNA3.1(+)细胞和SW480细胞的3.58倍和3.42倍;（2）过表达PTTG1基因后,SW480细胞周期改变,G0/G1期细胞减少而S期和G2/M期细胞增加;细胞周期调控蛋白cyclin D和cyclin E表达升高,p21表达降低;SW480细胞增殖显著性加快。（3） 过表达PTTG1基因后,SW480细胞中PI3K/AKT信号活化增强,使用PI3K/AKT信号抑制剂LY29400干预后,细胞增殖减弱,周期蛋白cyclin D和cyclin E表达降低,p21表达升高。结论 PTTG1基因过表达可能通过活化PI3K/AKT信号加速SW480细胞从G1期向S期的转化促进细胞增殖,提示PTTG1蛋白可能成为结肠癌治疗的一个潜在靶点。     

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT—6基因真核表达重组质粒在真核细胞(COS—7)中的表达。方法 用LipofectAMINE^TM2000介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6转染真核细胞COS—7，72h后，通过RT—PCR和Western Blotting试验鉴定ESAT—6基因在COS—7中的表达。结果 通过RT—PCR从转染了pcDNA3．1( )—ESAT—6的006—7中检测到目的基因mRNA的转录；Western Blotting试验鉴定在转染pcDNA3．1( )—ESAT—6的COS—7的细胞裂解上清液中有ESAT—6基因的表达蛋白。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ES—AT—6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS—7中表达ESAT—6蛋白，为进一步研究其特性及为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

端粒和端粒酶相互作用蛋白在真核细胞中的表达

目的从人肝癌细胞系HepG2中获得PinX1基因,构建真核表达载体,转染Hek293细胞。方法采用RT-PCR技术从HepG2中扩增PinX1,克隆入真核表达载体pcDNA3,重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化法检测蛋白的表达。结果RT-PCR方法扩增获得PinX1基因,构建真核表达载体pcDNA3-PinXl-vsv重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化检测结果表明在细胞核内有PinX1表达。结论成功获得PinX1基因,构建的重组载体可在Hek293细胞内表达,为探索PinX1在端粒、端粒酶调控中的作用机制奠定基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

OPN反义基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

目的:探讨OPN反义基因(ANOPN)对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞生长及迁移能力的影响。方法:构建人骨桥蛋白反义基因真核表达质粒pcDNA3.1-ANOPN,将质粒pcDNA3.1-ANOPN、空载体pcDNA3.1(+)和等量的脂质体分别转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,将转染细胞分别命名为MDA-ANOPN、MDA-vect和MDA,在体外观察各组细胞的迁移能力。结果:MDA-MB-231细胞比MDA-vect及MDA细胞迁移能力弱(P<0.01)。结论:ANOPN可抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的迁移能力。     

家兔pEGFP-N1/rCNP质粒的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

[目的]构建真核表达载体pEGFP-N1/rCNP并转染体外培养的人脐静脉内皮细胞,观察CNP基因在其中的表达。[方法]利用RT-PCR方法从家兔腹主动脉组织扩增获得CNP基因全场全长编码区,克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组载体pEGFP-N1/rCNP。利用LipofectaminTM 2000脂质体将重组质粒转染人脐静脉内皮细胞。[结果]重组质粒pEGFP-N1/rCNP构建成功;将其转染人脐静脉内皮细胞,观察到目的基因CNP表达。[结论]成功构建了家兔腹主动脉CNP基因的真核表达载体pEGFP-N1/rCNP,并可转染人脐静脉内皮细胞。     

ω-3PUFA及其诱导的外源性跨膜型TNFα对肿瘤细胞生长的影响

目的:探讨ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)及其诱导的外源性跨膜型TNFα对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:将ω-3PUFA可调控的跨膜型TNFα真核表达载体转导入HL-60和MCF-7细胞,免疫荧光细胞化学方法检测ω-3PUFA对转染细胞外源基因表达的调控,生长曲线、流式细胞和DNA梯形带分析检测ω-3PUFA对转染细胞增殖能力和凋亡的影响。结果:在6.0×10-5mol/Lω-3PUFA诱导下转染细胞外源性跨膜型TNFα表达增加。HL-60和MCF-7细胞经6.0×10-5mol/Lω-3PUFA处理后增殖能力减弱,但只有HL-60细胞周期阻滞于G0/G1期及形成DNA梯形带。经ω-3PUFA处理后,以上变化在HL-60和MCF-7转染细胞中均更为显著。结论:ω-3PUFA诱导的外源性跨膜型TNFα基因产物可以增强ω-3多不饱和脂肪酸的抗肿瘤能力,而诱导细胞凋亡可能是其中重要机制之一。     

EB病毒转化的永生性人B淋巴母细胞中MTHFR基因的表达

ＨｐＳＶ２－ｎｅｏ质粒作为载体，在ＥｃｏＲＩ酶切位点上插入小鼠金属充蛋白（ＭＴ－Ｉ）基因，然后用ＤＮＡ－磷酸钙介导的基因转移法将重组质粒转染ＨｅＬａ细胞，经筛选得到表达ＭＴ－Ｉ的抗性细胞克隆，经检测，Ｇ４１８抗性细胞内有ＭＴ的特异性表达，表达量是未围染细胞的２．６倍。用不同浓度顺铂、阿霉素处理细胞，观察ＭＴ－Ｉ基因的表达与ＨｅＬａ细胞耐药性的关系。结果表明：０．１μｍｏｌ／ｍｌ顺铂作用细胞７２ｈ后