STAT3信号通路与血管重塑中平滑肌细胞表型转化及增殖关系

目的 观察静脉桥再狭窄模型中血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和增殖活性的变化,探讨信号转导子和激活子3蛋白(STAT3)的表达与VSMC表型转化及增殖活性的关系.方法 建立猪静脉桥再狭窄模型,采用血管病理形态学、免疫组织化学和免疫印迹(Western blot)方法,观察术后7、14、30 d血管蓖塑及血管壁中增殖细胞核抗原(PCNA)、平滑肌ot肌动蛋白(SM-α actin)和STAT3表达变化及其相关性.结果 (1)术后7 d新牛内膜形成逐渐增厚,于术后30 d达最大;重塑指数和外弹力板围绕面积(EELA)术后7 d稍有增大,其后不断减小,术后14～30 d明显减小(P<0.05).(2)免疫组织化学和Western blot测定STAT3蛋白显示,术后7 d中膜VSMC中阳性表达明显,术后14 d中膜VSMC和内膜VSMC中阳性表达均增加达高峰;术后30 d中膜VSMC中有较少部分阳性表达,内膜VSMC中阳性表达较14 d减少.血管中膜中STAT3和PCNA的蛋白呈显著性正相关(r=0.726,P<0.05).结论 血管平滑肌细胞的表型转化和增殖活性改变对内膜增生和血管重塑起着重要作用,STAT3信号通路与血管重塑中VSMC的增殖高度相关,参与并促进了VSMC的表型转化和增殖.     

可溶性支架转染c-myc基因反义寡核苷酸对静脉移植物c-myc及PCNA表达的影响

目的采用可溶性支架将原癌基因c—myc反义寡核苷酸转染静脉移植物，观察其对静脉移植物内c—myc蛋白和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白产物表达的影响。方法50只新西兰大耳白兔建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型后随机分成5组，每组10只。对照组：无支架；组1：植入单纯可溶性支架；组2：植入正义c—myc寡核苷酸可溶性支架；组3：植入反义c—myc寡核苷酸可溶性支架；组4：植入不匹配c—myc寡核苷酸可溶性支架。于静脉移植后7d、28d和90d取出静脉移植物，采用免疫组织化学方法检测其c—myc蛋白和PCNA蛋白的表达。结果对照组、组1、组2、组4静脉移植术后7d、28d、90d时静脉移植物内膜和中膜内可见大量c—myc蛋白和PCNA蛋白表达阳性的细胞，与同时间点组3比较差别均有统计学意义（P〈0．01）。28d、90d时5组静脉移植物内c—myc蛋白的表达与同组7d时比较明显增强（P〈0．01）。结论可溶性支架转染c—myc反义寡核苷酸可显著抑制静脉移植物内c—myc蛋白和PCNA蛋白的表达。     

自体移植静脉中sonic hedgehog表达水平的动物实验研究

目的 研究细胞周期相关因子sonic hedgehog(SHH)在大鼠自体移植静脉中的表达变化及其与内膜增生的关系.方法 雄性Wistar大鼠24只,8周龄,体质量140 g.建立颈静脉-腹主动脉移植模型,分别于术后14 d、28 d各处死12只大鼠,取材移植血管,免疫组化检测SHH蛋白在移植血管新生内膜中的表达,Western blot法观察SHH及细胞增殖核抗原(PCNA)的表达,Real-time PCR定量检测SHH mRNA的表达;以对侧颈静脉作为对照.结果 免疫组化结果显示,正常静脉、术后14 d和术后28 d移植静脉SHH+细胞数比例分别为(2.0±0.5)%、(39.4±0.4)%和(63.0±0.3)%,正常静脉与移植静脉差异有统计学意义(P<0.01).Western blot法显示术后SHH表达水平增加并与PCNA表达呈正相关(r=0.808,P<0.01).Real-time PCR结果显示术后14 d组和术后28 d组的SHH mRNA表达增加,分别为对照组含量的9.5和23.8倍.结论 自体静脉移植术后,SHH在新生内膜中高表达并可能与细胞增殖相关.     

去端肽胶原介导小干扰RNA抑制大鼠静脉移植物内膜增生

目的 评价局部应用组织因子小干扰RNA(siRNA)抑制静脉移植物内膜增生的效果.方法 SD大鼠120只,体重260～300 g,建立颈外静脉一颈总动脉移植模型后随机分成4组,每组30只.A组:去端肽胶原-TF StealthTMSelect RNAi组.B组:去端肽胶原-TF SteaLtHTM RNAi阴性对照组,C组:去端肽胶原组,D组:空白对照组.使用去端肽胶原-siRNA混合物涂抹于静脉移植物周围,免疫印迹检测术后1、3、7、14、28 d管壁组织因子蛋白表达,免疫组织化学法检测术后3 d管壁组织因子表达,同时检测术后14 d管壁增殖细胞核抗原指数,计算术后28 d新生内膜厚度.去端肽胶原-BLOCK-iTTM荧光寡核苷酸平行实验组12只,分别于术后3、7 d检测管壁BLOCK-iTTM寡核苷酸荧光确认其稳定性和转染效率.结果 平行实验组静脉移植物可观察到BLOCK-iTTM绿色荧光并持续到术后7 d.术后3 d A组siRNA有效抑制管壁TF蛋白表达,术后14 d A组与其他组比较增殖细胞核抗原指数明显减少(P＜0.05),术后28 d A组新生内膜厚度明显低于其他组(P＜0.05).结论 去端肽胶原携带siRNA可有效下调静脉移植物组织因子表达,抑制内膜增生.     

可溶性支架转染c-myc反义寡核苷酸预防静脉移植物再狭窄

目的 探讨可溶性支架转染c-myc反义寡核苷酸的可行性及其对静脉桥内膜增生的作用,以利在分子水平对静脉桥再狭窄进行防治.方法 新西兰大耳白兔随机分成5组,每组10只.建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植术模型.合成c-myc寡核苷酸,处理可溶性支架,依组别不同,在静脉移植时管腔内分别置人：（1）空白对照;（2）单纯可溶性支架;（3）反义寡核苷酸可溶性支架;（4）正义寡核苷酸可溶性支架;（5）不匹配寡核苷酸可溶性支架;静脉移植后7、28和90d取出静脉桥.行HE及弹力纤维染色,计算内膜、中膜厚度及内膜/中膜比值;利用免疫组化方法,检测各组静脉移植物内c-myc基因及PCNA的表达;采用原位杂交及激光灰度扫描,检测各组静脉桥中c-myc基因mRNA表达水平.结果 静脉移植后7、28和90d反义寡核苷酸可溶性支架组静脉桥内膜增生程度显著降低;c-myc及PCNA蛋白的表达显著低于同时间点其他各组;c-myc基因mRNA的表达显著低于同时间点其他各组.结论 可溶性支架可实现c-myc基因反义寡核苷酸的转染,可溶性支架转染c-myc基因反义寡核苷酸可显著抑制静脉桥c-myc及PCNA基因的表达,预防静脉桥再狭窄.     

纳米粒子介导的p27kip1基因转染对静脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的探讨以纳米粒子为载体的人p27kip1基因转染对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用.方法聚乳酸聚乙醇酸共聚物包载p27kip1基因,制备纳米级粒子混合物.转染培养的大鼠血管平滑肌细胞,流式细胞仪分析细胞周期.建立自体静脉移植动物模型,随机分成转基因组、空白载体对照组、单纯静脉移植组.分别于术后3、7、14、28 d取材,进行苏木素-伊红(HE)及Verhoeff 染色检测内膜厚度、Western blot检测p27kip1基因蛋白的表达、免疫组织化学法,检测外周血增殖细胞核抗原(PCNA)、E2F表达.结果转基因组表达蛋白,3、7、14 d较其他俩组明显增多(P<0.05);转基因组内膜平均厚度较其他组明显减少(P<0.01),对照组及单纯静脉移植组之间差异无统计学意义(P>0.05);转基因组PCNA的表达7～28 d较其他组明显降低(P<0.01),其E2F的表达7～14 d较其他组显著降低(P<0.01);对照组及单纯静脉移植组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论纳米粒子可以作为转基因载体,p27kip1抑癌基因的表达能够有效抑制自体静脉移植后内膜平滑肌细胞的增殖.     

术后静脉化疗对犬腹主动脉人工血管移植物影响的观察

目的探讨5-FU和DDP静脉联合化疗对犬人工血管移植物的影响。方法建立12只犬ePTFE人工血管重建腹主动脉模型,随机平分为化疗组和对照组。化疗组于术后第2周给予5-FU(10 mg/kg)和DDP(1 mg/kg)静脉联合化疗,1次/d,共5 d,对照组行同量液体输液;记录实验犬干预期间的生理指标;于化疗(输液)后4周(术后6周)获取5个平面标本,检测移植物内膜厚度及CD34和PCNA的表达。结果化疗组死亡1例(1/6),对照组无死亡(0/6);化疗组2例(2/5)人工血管少量附壁血栓形成,对照组未见(0/6)。组间比较:两组人工血管内膜厚度无统计学差异(P>0.05);化疗组人工血管中段的CD34阳性细胞率显著低于对照组(P<0.05),其余平面无统计学差异(P>0.05);两组内膜PCNA的表达无统计学差异(P>0.05)。组内比较:两组人工血管中段的内膜厚度及CD34阳性细胞率均低于吻合口(P<0.05或P<0.01);远端吻合口PCNA表达量均较近端吻合口高(均P<0.05),两端吻合口PCNA高于人工血管中段(均P<0.05)。结论术后2周行5-FU和DDP静脉联合化疗可能一过性影响人工血管移植物...     

聚对二氧环己酮血管外支架抑制移植静脉内膜增生的机制

目的 构建可降解性聚对二氧环己酮(PDS)血管外支架抑制移植静脉内膜增生的动物模型,探讨PDS外支架抑制移植静脉内膜增生的作用及其机制。方法 建立兔颈外静脉移植模型,24只新西兰大白兔分为单纯移植组(n=12)和PDS外支架组(n=12)。术后4周及12周取出移植静脉,测量移植静脉内膜、中层面积及厚度,免疫组织化学法和实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和肾素-血管紧张素Ⅱ受体1( AT1 R)表达。结果 24只兔均存活,移植血管全部通畅。外支架组中膜面积、内膜面积、中膜厚度、内膜厚度各值皆小于单纯移植组,差异有统计学意义(P＜0.05)。免疫组织化学与RT-PCR检测表明血管外支架组TGF-β1在外膜中过度表达,而中膜和内膜表达减少。术后4周,外支架组AT1R表达水平低于对照组,12周时,两组AT1R表达水平都降低,差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 大孔隙、非限制性PDS血管外支架通过形成新生外膜、调节细胞因子再分布等机制有效地抑制内膜和中膜的增生,其用于抑制移植静脉内膜增生是可行的。     

自体股静脉复合血管外支架修复股动脉缺损的组织学变化

目的探讨复合聚乙丙交酯(PGLA)血管外支架对自体静脉修复动脉缺损的组织学变化的影响。方法以30只犬两侧股动脉各切除5cm,用6cm同侧股静脉移植修复,随机一侧复合PGLA血管外支架为A组;另一侧仅行自体股静脉移植为B组。术后1、2、4、6、8周取材,HE、Masson和弹力染色,光镜观察组织形态变化,进行图像分析,PCNA免疫组化染色观察平滑肌细胞增殖。结果两组移植静脉内膜厚度和截面积都较正常静脉差异有极显著意义(P<0.01),且随时间的推移而递增;两组间内膜厚度、截面积差异有极显著意义(P<0.01)。两组中膜厚度和截面积较正常静脉差异有显著意义(P<0.05),两组管腔截面积与正常静脉相比差异有极显著意义(P<0.01);两组间比较自第4周起差异有极显著意义(P<0.01)。移植静脉PCNA阳性细胞较正常静脉明显增加,术后2周达到高峰,而后逐渐减少,B组PCNA阳性细胞数高于A组,其中在术后前6周两者差异有极显著意义(P<0.01)。实验中A组移植的静脉无明显炎症反应,PGLA血管外支架保持较完整的结构,强度没有明显改变。结论复合应用PGLA血管外支架移植静脉内膜增生和平滑肌增殖减少,管腔狭窄较少。     

靶向PIK3cb双位点shRNA干扰抑制血管移植术后再狭窄

目的 研究RNA干扰（RNAi）对大鼠血管平滑肌细胞磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）p110β亚单位（PIK3cb）基因表达的干扰效应。方法 雄性SD大鼠150只，均行白体颈外静脉-颈总动脉移植手术，随机数字分组法分为6组：空白对照组（25％空白Pluronic F-127）、shRNA-1组、shRNA-2组、1／2（shRNA-1＋shRNA-2）组、阴性对照组（无序质粒）和阳性对照组（渥曼青霉素），每组25只。3个转染组[shRNA-1组、shRNA-2组及1／2（shRNA-1＋shRNA-2）组]通过Pluronic F-127缓释系统将shRNA均匀喷涂于移植静脉周围。分别于术后1、3、7、14及28d各取5只大鼠取材，采用计算机图像分析法测量管腔内膜厚度及新生内膜面积，Western blot（术后3d）及免疫组化染色检测细胞增殖情况。结果 术后3、7、14及28d时，3个转染组血管内膜厚度均较空白对照组及阴性对照组明显减少（P〈0．05）；而新生内膜面积3个转染组（除shRNA-2组第3、7d）于术后1d起即开始明显减少（P〈0．05）。免疫组化染色结果示术后各时间点3个转染组PCNA阳性细胞面积百分比显著低于空白对照组及阴性对照组（P〈0．05）。Western blot检测结果示术后3d3个转染组PCNA蛋白表达明显低于空白对照组及阴性对照组（P〈0．05）。各时间点空白对照组与阴性对照组血管内膜增生情况及PCNA表达情况差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 shRNA真核表达载体转染入移植静脉后能有效抑制管壁平滑肌细胞增殖，是一种防治移植静脉狭窄的基因疗法。     

可降解壳聚糖血管外周支持与静脉移植物早期结构的变化

目的　探讨可降解壳聚糖血管外周支持 (CES)对静脉移植物 (VG)早期结构变化的影响 ,为临床提高VG通畅率提供新的治疗方法。　方法　将兔右颈内静脉端 端吻合于同侧颈总动脉建立静脉移植模型 ,以有无CES干预分为支架组与无支架组 (每组 2 4只兔 )。术后 1、2、4周分别切除移植静脉 ,计算机图像分析系统测量和计算内膜、中膜厚度和面积 ,免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原 (PCNA)指数观察平滑肌细胞增殖程度。　结果　CES在术后 2周开始降解。支架组VG ,术后 1～ 2周内膜、中膜的厚度和面积、PCNA指数在术后 1周轻度增加 ,1～ 2周维持稳定 ,术后 2周分别为(2 6 3± 3 7) μm、(2 6 0± 1 9) μm、(0 5 6± 0 0 8)mm2 、(0 34± 0 0 5 )mm2 与 (11 5± 2 1) % ,明显低于无支架组的 (5 6 4± 9 4 ) μm、(47 6± 4 9) μm、(1 17± 0 0 8)mm2 、(1 2 0± 0 4 3)mm2 与 (36 6± 2 9) % (P <0 0 1) ;术后 4周虽然又增加 ,分别为 (31 7± 1 6 ) μm、(31 7± 1 6 ) μm、(0 72± 0 12 )mm2 、(0 4 2± 0 0 6 )mm2 与 (13 4± 1 2 ) % ,但仍低于无支架组的 (76 8± 8 0 ) μm、(5 7 4± 9 5 ) μm、(1 2 7± 0 17)mm2 、(1 2 7± 0 0 9)mm2 与 (16 8± 2 2 ) % (P <0 0 5 )。结论　CES     

血小板源性生长因子-BB影响下大鼠血管平滑肌细胞增殖及其ras蛋白的表达

目的 观察血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖及其ras蛋白表达的影响.方法 体外培养大鼠VSMC并传代,将第4代VSMC分4组,设空白对照组,另设3组分别加入1、2、4 μg/L PDGF-BB进行干预,采用细胞计数、免疫组织化学及免疫荧光等方法,观察干预后1、3、7 d 3个时间点的VSMC计数、增殖细胞核抗原(PCNA)表达及相应时段ras蛋白的表达,并分析两者之间的相关性.结果 (1)在7 d内各组VSMC计数均逐渐增加,其中2 μg/L和4 μg/L PDGF-BB组的计数增长较对照组快(P＜0.05),4 μg/L PDGF-BB组较1 μg/LPDGF-BB组快(P＜0.05);(2)免疫组织化学和免疫荧光检测显示,干预3 d后各组VSMC增殖细胞百分比均表现为高PDGF-BB浓度组高于低浓度组(P＜0.05),ras蛋白荧光表达强度亦呈现相同趋势(P＜0.01).PDGF-BB干预后的VSMC的PCNA表达和ras蛋白表达呈显著正相关(r=0.735,P＜0.05).结论 PDGF-BB可以刺激体外培养大鼠VSMC增殖,并可促进其ras蛋白的表达.     

组织细胞间粘附分子-1在阻塞性黄疸小肠粘膜损伤中的作用及丹参防治机制的研究

目的：研究组织细胞间粘附分子－1（ICAM－1）在阻塞性黄疸（阻黄）小肠粘膜损伤中的作用及丹参防治小肠粘膜损伤机制。方法：SD大鼠48只分为4组：假手术对照组（SO＋NS）、阻黄组（BDL＋NS）、治疗对照组（SO＋SM）及丹参治疗组（BDL＋SM），每组术后再随机分设7、14d两个时相点。在不同时相点检测小肠组织髓过氧化物酶活性（MPO）、ICAM－1、二胺氧化酶（DAO）、血浆内毒素水平变化，并与丹参治疗组进行比较。结果：BDL＋NS组7、14d时小肠DAO的活性降低，MPO活性增高P＜0．05），门表脉血浆内毒素增加，ICAM－1主要表达在小肠粘膜上皮组织，且表达逐渐增强（P＜0．05）；BDL＋SM组7、14d时小肠组织DAO活性显著升高，门静脉血浆内毒素降低，ICAM－1表达受到抑制（P＜0．05），MPO改变不明显。结论：阻黄引起小肠上皮细胞上的ICAM－1表达上调，参与了中性粒细胞（PMN）介导的小肠粘膜损伤；丹参是通过抑制ICAM－1的表达而减轻小肠粘膜的损伤。     

MMP-2、MMP-9、TIMP-1在血管成形术后再狭窄中的表达及其意义的实验研究

目的观察PTA后MMP-2、MMP-9和TIMP-1在血管壁各层随时间的演变规律,探讨其在血管再狭窄过程中的表达及意义。方法48只大鼠制作成颈动脉再狭窄动物模型,选取30只内膜增生满意的标本,分别代表动脉损伤后1、3、7、14、28、42天6个观察时间点,对胶原纤维进行Masson染色。MMP-2、TIMP-1、PCNA进行免疫组织化学染色,MMP-9进行免疫组织化学和原位杂交两种染色。分析它们的表达与内膜增生和血管重塑的关系。结果正常血管不表达MMP-9mRNA及蛋白,损伤后第3天中膜、外膜mRNA表达达高峰,第7天内膜表达达高峰。MMP-9蛋白第7天内膜表达达高峰,且阳性细胞率高于中膜和外膜。第14、28天,血管壁各层表达逐渐下降至基线水平,内膜的阳性细胞主要集中在新生内膜靠近管腔的一侧。内膜MMP-2表达高峰出现晚至第14天,且近内弹力板处MMP-2也有明显的表达。正常血管壁不表达TIMP-1,损伤后第3天,中膜和外膜表达达高峰。第7天,新生内膜表达达高峰,中膜和外膜仍有较高水平表达。结论MMP-9、MMP-2、TIMP-1参与再狭窄,内膜MMP-9表达与早期增殖的细胞向内膜迁移形成新生内膜有关。MMP-2表达与晚期内膜形成、内膜重塑有关。TIMP-1的表达对内膜增生和重塑没有直接作用,其表达升高是机体为适应MMPs升高做出的代偿反应,在维持自身平衡中起作用。     

An appropriately sized soft polyester external stent prevents enlargement and neointimal hyperplasia of a saphenous vein graft in a canine model

Although the efficacy of external stents for vein grafts in coronary artery bypass grafting has been recognized, the ideal diameter and material of the stent remain controversial. We created a new external stent made of soft polyester mesh and performed an animal experiment using canines. Bilateral saphenous vein grafts were interposed in the bilateral common carotid artery of 10 beagles. The grafts in the left carotid artery were designated as the control group, and those in the right rolled by a soft polyester mesh external stent were designated as mesh group. Two of the 10 animals were sacrificed due to severe wound infection. The other eight were observed by echography for 6 months, and then grafts were extracted and thickness of the neointima of the grafts was measured. The control group showed 146% ± 26% postoperative enlargement of the internal diameter of the vein grafts after 6 months, whereas the mesh group showed only 115% ± 15% after the same duration (P = 0.0003). The median thickness of the neointima in the mesh group (170 µm [range: 150–190]) was significantly thinner than that in the control group (260 µm [range: 220–310], P < 0.0001). Some degree of correlation between the thickness of neointima and proportion of enlargement was noted (r = 0.518, P = 0.0024). A soft polyester mesh external stent for vein grafts successfully suppressed the enlargement of the vein grafts and thickness of the neointima after 6 months.     

三七总皂苷对移植静脉再狭窄的影响

目的 观察三七总皂苷(PNS)对大鼠移植静脉再狭窄的影响.方法 建立SD大鼠颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,随机分为假手术组、模型组和PNS组,造模后第2天开始灌胃给药,PNS组给予PNS(100 mg/kg),假手术组、模型组灌胃等量蒸馏水(10 ml/kg).给药14 d后,取静脉血管桥固定,观察血管内膜增生,免疫组织化学测定增殖细胞核抗原(PCNA)表达及TUNEL法检测平滑肌细胞凋亡.结果 上述3组的内膜厚度分别为(4.05±0.85)、(26.30±1.15)、(10.80±0.98)μm;内膜/中膜分别为(0.22±0.09)、(0.76±0.27)、(0.45±0.23),PNS组新内膜厚度明显低于模型组(P＜0.05);模型组的PCNA表达量(A值)为(23.6±4.3),明显高于PNS组(11.5±3.6,P＜0.05);模型组的凋亡细胞百分数为(4.3±1.9),明显低于PNS组(20.3±3.5,P＜0.05).结论 PNS可以抑制静脉移植血管桥新生内膜的增生,对预防移植血管再狭窄有一定作用.

Abstract：

Objective To observate the effects of panax notoginseng saponin (PNS) on restenosis of rat vein graft.Methods Jugular vein-to-artery bypass grafting was performed on 30 Sprague-Dawley rats.The rats were divided into three groups: sham group, model group and PNS group.Drugs were administered at the second day after the operation for 14 days.The grafts were harvested for histochemical staining to observe the hyperplasia of neointima, and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression,and apoptosis of smooth muscle cells were detected by TUNEL.Results In sham group, model group and PNS group, the endometrial thickness was (4.05 ±0.85), (26.30 ± 1.15), ( 10.80 ±0.98) μm; the intima/media was (0.22 0.09), (0.76 0.27), (0.45 0.23), respectively.The neointimal thickness in PNS group was significantly less than in model group ( P ＜ 0.05 ).The PCNA expression in model group (A value) was ( 23.6 ± 4.3 ), significantly higher than in PNS group ( 11.5 ± 3.6 ) ( P ＜ 0.05 ).The percentage of apoptotic cells in model group was (4.3 ± 1.9), significantly lower than in PNS group (20.3 ± 3.5 ) (P ＜ 0.05 ).Conclusion PNS can inhibit the neointimal hyperplais of vein graft, which can prevente restenosis after bypass grafts.