肌色素上皮源性因子基因与黑色素瘤的发生相关

目的：寻找与B16黑色素瘤发生相关的DNA序列或片段。方法：用105条引物对B16黑色素瘤及其来源小鼠C57BL／6J基因组DNA进行随机扩增多态DNA分析,比较肿瘤组织及其相应正常组织的DNA指纹,对差异很明显的片段收、克隆和测序,序列与GenBank数据库进行同源性分析。结果：105条引物中有24条引物扩增出的条带在肿瘤组织与其相应正常组织间存在差异。在6个差异很明显的回收DNA片段中引物AB8－5扩增后所得差异片段B8－5,肿瘤组织中此片段缺失,该片段序列长610bp,与GenBank序列数据库中鼠肌色素上皮源性因子基因具有99％（419／421）的同源性,与鼠肌色素上皮源性因子（PEDF）mRNA的同源性为100％（213／213）。可以认为该序列即为此基因,结论：黑色素瘤中存在PEDF基因缺失,提示PEDF基因与黑色素瘤发生相关。     

肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

肺腺癌同源正常组织中差异表达基因的克隆

目的 从与肺腺癌同源的正常组织中筛选差异表达基因，以期从分子水平阐明机体抑制肿瘤发生的机制。方法 利用抑制性消减杂交分别肺癌组织及肺腺癌同源正常组织cDNA片段，并建立相应的cDNA文库。用肺腺癌组织及与其同源的正常组织cDNA片段作为探针，分别进行逆向和正向斑点杂交，筛选与同源正常组织探针杂交而不与肺腺癌组织探针杂交的阳性克隆并测序，测序结果与GenBank中的序列进行同源性分析。结果 在肺腺癌同源正常组织中，获得12个差异表达基因片段，其中4个与细胞凋亡相关基因有较高的同源性；8个与人类不同染色体的不同区域有较高的同源性，功能不详。结论 推测肺腺癌同源正常组织中存在凋亡相关基因等，它们可能通过多种途径促进细胞凋亡而抑制细胞异常增殖，从而达到抑制肿瘤发生的目的。     

大鼠骨髓间质干细胞神经分化相关基因cNDA片段的克隆与初步鉴定

目的：寻找与骨髓间质干细胞(MSC)向神经细胞分化相关的基因。方法：应用荧光-差异显示(fluorescence differential display)技术，分离骨髓间质干细胞和由黄芪诱导分化来的神经元样细胞之间的差异表达cDNA片段，分离的片段分别与pGEM-T载体连接并转化JM109菌中，斑点杂交排除假阳性克隆，提取质粒进行测序。以BLAST程序进行GenBank的同源性检索。结果：共得到在神经元样细胞中表达而在MSC中不表达的差异表达cDNA片段7条，其中5条为已知基因，2条为新基因。结论：克隆的7条cDNA序列所在的基因可能与MSC神经分化的分子机制相关，对它们的进一步研究将为神经退行性疾病的治疗提供思路。     

小鼠生发泡完整卵母细胞一个特异基因的克隆及其在胚胎的表达

目的：克隆和筛选小鼠生发泡完整卵母细胞(Gv卵)特异基因，并检测其一在胚胎中的表达。方法：应用抑制性消减杂交技术(SSH)，建立Gv卵特异的cDNA文库。通过斑点杂交法进一步筛选并对阳性克隆进行序列测定和同源性分析；采用RT-PC方法观察其一在着床前胚胎的表达。结果：克隆发现18个基因和8个EST序列在GV卵中特异表达。RT-PCR显示该阳性克隆的基因在GV卵、MII卵、1-细胞胚胎和2-细胞胚胎有表达，其短片段是预期要扩增者，从MII卵开始表达下降；长片段在Gv卵、MII卵、1．细胞胚胎和2-细胞胚胎表达未见明显变化。长、短片段两端序列一致。结论：该基因是GV卵特异cDNA文库中的一个基因，且是母源性基因，提示该基因在卵母细胞成熟和合子基因激活中起一定作用。     

绒癌相关基因片段T26的克隆和测序

目的：对绒癌相关基因片段T26进行克降隆和测序分析。方法：利用T－A克隆将绒癌相关基因片段T26连接入PGEM－5载体,酶切鉴定并测序,测序结果与GenBank比较,分析所得的片段。结果：绒癌相关基因片段T26的核苷酸序列与scar,rps4,ccg2基因的3‘端核苷酸序列同源性达99％以上。结论T26及scar,ccg2,rps4基因与绒癌发生相关。     

利用抑制消减杂交技术研究钩端螺旋体致病相关基因

目的：利用抑制消减杂交技术（SSH）,比较致病与非致病钩端螺旋体（简称钩体）之间基因组差异,筛选致病钩体特有的基因片段。方法：以赖型O17株为tester,非致病性patocI株为driver,选择合适的四碱基内切酶将基因组酶切,连接特殊设计的adaptor进行消减杂交和PCR,得到消减混合物,与T／A克隆载体连接,转化JM109建立差异消减文库,经PCR和Southern blot筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和同源分析。结果：Alu I适于将钩体酶切成用于SSH技术的小片段;经SSH筛选鉴定得到30个片段大小为200－1300bp的阳性克隆,部分已测序的片段中1个与硫胺素合成蛋白高度同源,4个与GenBank无明显同源性,可能为赖型致病钩体所特有而非致病钩体缺失的基因片段,已被GenBank收录,收录号分别为AF300873－300877。结论：SSH是一种有效、灵敏、高特异的比较分析基因组差异的方法,对钩端螺旋体致病基因的筛选、基因组分化、分子遗传研究等具有重要意义。     

胃癌高表达cDNA片段W41的克隆及组织表达谱分析

目的：从人胃癌组织中克隆新的相关易感基因。方法：利用cDNA末端快速扩增PCR技术得到了扩增片段，将其克隆、核苷酸序列分析，并将序列在GenBank进行同源性比较。利用Northern杂交、多组织Northern及基因表达系列分析了所得基因片段的组织表达谱。结果：获得1条533bp带有poly(A)尾的cDNA片段，可见加尾信号AATAAA，与GenBank基因数据库同源比较，该序列未见与任何已知基因同源，登录GenBank(登录号为AF325202）。该序列在胃癌组织的表达强度高于对应正常组织，多组织Northern及基因表达系列分析表明该序列在多种肿瘤组织中高表达，在正常组织中表达减弱。结论：得到了1条与胃癌可能相关的新的cDNA序列。     

赖型钩端螺旋体毒力株新基因差异片段筛选和核苷酸序列分析

目的:筛选致病钩端螺旋体赖型017株毒力相关基因DNA差异片段,并进行核苷酸及基因信息学分析。方法:提取钩端螺旋体017株基因组DNA,根据抑制消减杂交(SSH)筛选的017株特有的153bp核苷酸短片段,采用盒式连接半巢式PCR技术,扩增相邻未知序列,进行序列测定、分析及同源性检索,并进行蛋白二级结构预测。结果:克隆获得580bp核苷酸长度的基因片段,包含4个重叠开放阅读框架(ORF),在氨基酸水平上与A型化脓性链球菌,肺炎链球菌保守的假想蛋白高度同源。被GenBank收录,收录号为AF495587。结论:本研究筛选并分析了可能是钩体毒力相关的基因片段,为进一步探讨该基因的生物学功能及阐明赖型钩端螺旋体致病分子机制打下了基础。     

应用mRNA差异显示技术筛选大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达基因

目的： 应用mRNA差异显示技术对大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达基因进行筛选，克隆以及鉴定。方法: 大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养；对大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型进行荧光mRNA差异显示逆转录PCR（FDDRT-PCR,fluorescent differential display RT-PCR）；EST片段亚克隆入pGEM-T EasyTM，克隆后测序并进行序列同源性检索；反Northern杂交重鉴定与筛选。结果: 通过DDRT-PCR获得164 个在小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达的ESTs；对其中的17个ESTs进行了克隆并测序；通过反Northern杂交的初步筛选初步鉴定出5个阳性片段。结论: 阳性差异表达EST的筛选、克隆以及鉴定为神经元凋亡与保护分子机制研究奠定基础。     

小脑颗粒神经元凋亡差异表达基因的分离克隆研究

目的筛选分离低钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡的差异表达基因。方法采用低钾处理的小脑颗粒细胞,抽提细胞总RNA,用荧光法mRNA差异显示技术分离差异表达基因,并对差异表达基因片段进行回收、克隆,经反向RNA印迹及RT鄄PCR技术验证。结果发现51条差异片段,成功克隆8个片段,其中2个未知功能的基因片段证实在低钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡中表达增加。结论mRNA差异显示法是分离差异表达基因的一个良好的工具,分离出的差异基因与神经细胞凋亡有关。     

从rds小鼠视网膜克隆视网膜色素变性相关差异片段

目的 从遗传性视网膜色素变性动物模型rds小鼠中克隆视网膜色素变性发病过程中特异表达的基因。方法 应用差异显示技术,分析rds小鼠发病过程中视网膜的mRNA。对特异性表达的mRNA片段进行克隆测序。结果 在视网膜色素变性发病过程中,rds小鼠的视网膜存在着相当明显的基因表达差异。在所测序分析的5个差异显示片段中其中一个与GenBank刚登录的功能未知的、从成年男性睾丸组织中克隆出来的cDNA序列较高同源（同一率为86％）另外4个为低同源序列。25天rds小鼠高表达的一个差异片段,与37天正常鼠表达而rds小鼠不表达的另一个片段,长度相同,177个碱基只相差两个。结论 视网膜色素变性这类慢性病变,存在着多个基因的表达及调控。     

cDNA代表性差异分析法分离鼻咽癌上皮细胞株HNE1表达差异cDNA序列的初步研究

目的寻找鼻咽癌中差异性表达基因，包括与鼻咽癌发病相关的候选抑瘤基因。方法应用ｃＤＮＡ代表性差异分析法（ＲＤＡ），分离原代培养的正常人鼻咽上皮细胞与鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１中差异表达的ｃＤＮＡ序列，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交被用来分析差异性表达产物的来源，最后，将这些序列克隆到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，并用链终止法测序。结果在第４轮杂交及扩增反应后，获得４条差异性条带。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证明，这些差异性片段来自作为“检测”扩增子的正常人鼻咽上皮，在鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１中不表达或表达降低。序列分析这些差异性片段的克隆，发现一些序列是与已知基因高度同源的基因，包括一些看家基因；另有一些基因则为新基因序列。结论鼻咽癌的发生是一个多基因参与的过程，所获得的差异性片段中，与之同源的一些已知基因具有抑瘤功能。     

用mRNA差异显示法寻找帕金森病猴模型的相关基因

本研究采用mRNA差异显示方法，比较了在1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的恒河猴单侧帕金森病模型中，双侧黑质细胞在基因表达上的不同。具体方法为制成恒河猴单侧帕金森病模型，1周后处死动物，分别取两侧黑质组织，提取总RNA。用三种锚定引物Oligo（dT）A、Oligo（dT）G、Oligo（dT）C将mRNA逆转录成为cDNA。使用试剂盒提供的部分随机引物（AP1～8，AP34）与上述几种锚定引物组合，以逆转录得到的cDNA为模板，分别进行PCR。把对照与病变侧组织相应的PCR产物在7％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经过银染，显示出差异条带。回收差异条带中的DNA并以之为模板再次进行PCR扩增，将所得片段在HindⅢ位点插入pGEM－3Zf（＋）质粒进行克隆。在所发现的数条差异条带中，初步筛选出一个长度约为310bP的DNA片段。分析此结果表明此片段具有一定特异性。     

实验性脑脓肿组织中G蛋白信号系统相关基因的克隆

目的 筛选和克隆实验性脑脓肿的早期相关基因，研究脑组织对病原菌的免疫反应过程中所涉及的分子机制。方法通过脑组织内直接注射金黄色葡萄球菌获得大鼠脑脓肿，利用mRNA荧光差异显示PCR技术比较脑脓肿组脑组织中mRNA的表达与正常对照组、手术对照组之间的差异，获得的差异表达cDNA片段经克隆、测序及BLAST软件进行同源性比较分析，并采用Noahem杂交和RT-PCR进行鉴定。结果共获得25条差异表达的cDNA条带，经Noahem杂交和RT-PCR鉴定其中17条为阳性（阳性率为68％）。克隆和测序结果显示其中3个差异表达片段与G蛋白相关的细胞信号传导系统有关：片段G18-1代表的鸟苷二磷酸解离抑制因子3（GD13）、片段G20-1代表的交集素（ITSN）以及片段C2-1代表的Ras相关蛋白（Rap1）。结论在实验性脑脓肿早期GD13、ITSN和Rap1差异表达，推导G蛋白信号系统的激活可能与脑脓肿的发病相关。     

食管癌低表达cDNA片段C6-2A的克隆及表达分析

目的　克隆人食管癌发生相关的基因。方法　用ｍ Ｒ Ｎ Ａ 差异显示技术分离、克隆食管癌组织中不表达或低表达的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,再通过 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 、ｄｏｔ ｂｌｏｔ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 证实。结果　获得２８０ｂｐ 的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,命名为 Ｃ６２ Ａ。与 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 基因数据库比较,未发现 Ｃ６２ Ａ 与任何已知基因有同源性。查询 Ｅ Ｓ Ｔ 数据库,发现 Ｃ６２ Ａ 与ｎｅ２７ｂ０３ ,ｓ１ Ｎ Ｃ Ｉ Ｃ Ｇ Ａ Ｐ Ｃ０３ 人ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆８９８５４１ 及人卵巢肿瘤ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆７５５１９６ 等高度同源。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 结果显示６／６ 例食管癌组织表达丧失或低表达,ｄｏｔ ｂｌｏｔ 分析表明７／８例食管癌组织低表达, Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 显示食管癌细胞系 Ｅ Ｃ１０９ 、 Ｅ Ｃ８７１２ 、 Ｅ Ｃ９７０６ 和肺腺癌细胞系 Ｇ Ｌ Ｃ８２ 极弱表达,１７／２０ 例食管癌组织表达丧失或低表达,胎儿食管、皮肤、大脑、胎盘较高表达,胎儿胃、肝较弱表达,胎儿心、小肠、肾不表达。结论　在食管癌细胞系和食管癌组织高频率的不表达或低表达提示, Ｃ６２ Ａ 很可能与食管癌的发生、发展有关。     

人扁桃体B淋巴细胞mRNA的差异显示分析及活化B细胞表达的新EST的分离

目的分离新的Ｂ细胞活化基因。方法采用差异显示反转录ＰＣＲ技术（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）对人扁桃体活化和静止Ｂ细胞ｍＲＮＡ的差异显示情况进行分析，对显示片段进行克隆并行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析，对Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交阳性的ｃＤＮＡ片段进行测序并比较同源性。结果差异显示分析共获得明显差异表达的ｃＤＮＡ片段６２条，选择主要表达于活化Ｂ细胞上的２０条ｃＤＮＡ片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，并逐一对静止和活化Ｂ细胞ＲＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析，其中６条ｃＤＮＡ片段在活化Ｂ细胞中呈Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交阳性且与差异显示情况相符，对它们进行测序，然后通过国际互联网与ＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬ和ＤＤＢＪ的ＤＮＡ数据库比较序列同源性，发现其中４个克隆与已发现的基因具明显同源性，一个克隆是新的，另一个克隆虽然与人Ｔ细胞分泌的趋化因子Ｉ－３０９同源性达９５％，但二者转录本不同。结论通过ＤＤＲＴ－ＰＣＲ分离到两个可能为新的Ｂ细胞活化基因的ｃＤＮＡ片段，这为进一步克隆新的Ｂ细胞活化基因奠定了基础。