全国第六届组织学与胚胎学青年学术研讨会论文摘要(续)

73.NO诱导血管平滑肌细胞凋亡原癌基因调控的初步研 究田雪梅李进第一军医大学组织学胚胎学教研室 广州 510515 血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖引起的 细胞数量过度增加是动脉粥样硬化发生发展的一个主要病 理特征,而VSMC凋亡又在其中起着重要作用.引起细胞凋 亡的因素有多种,近期发现,广泛存在于心血管系统的一氧 化氮(NO)除已知的多种生物作用外,还具有诱导巨噬细胞、 VSMC凋亡的功能.但是,NO诱导VSMC凋亡的调控机制 尚不十分明确.而bcl-2、p53、bax、c-myc、fas等都是参与细 胞凋亡调控的原癌基因.鉴此,本实验探讨NO诱导VSMC 凋亡与bcl-2、p53、bax之间的关系.方法:采用贴块法培养大 鼠主动脉VSMC,3～8代细胞用于实验.以亚硝基乙酰青霉 胺(SNAP)作为NO供体.构建逆转录病毒载体,将bcl-2基 因转入VSMC,使VSMC中bcl-2蛋白过量表达,通过原位 末端标记和流式细胞术检测VSMC在SNAP作用下的凋 亡.并采用免疫荧光染色,借助粘附式细胞仪(ACAS507)检 测细胞中bcl-2、p53、bax原癌蛋白表达的变化.结果:通过转 染bcl-2基因能使VSMC中bcl-2蛋白过量表达,且能使 SNAP作用下VSMC的凋亡率减少,而细胞中p53、bax蛋 白表达在转染和未转染bcl-2的VSMC中无明显差异.结 论:bcl-2过量表达阻止NO诱导的VSMC凋亡,但此作用 不是通过减少细胞中p53、bax蛋白的表达,而可能是通过增 加Bcl-2/bax比例的方式实现的.     

胱抑素C对氧化型低密度脂蛋白诱导的人血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的： 研究胱抑素C（cystatin C）对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人血管平滑肌细胞（VSMC）的作用，以探讨cystatin C在心血管疾病中的生物学特性。方法：利用ox-LDL诱导人VSMC，MTT法检测ox-LDL诱导时间及浓度对细胞存活率的影响，确定ox-LDL最佳诱导浓度和时间，将对数生长期的人VSMC随机分成正常细胞组、pCDNA3.1-cystatin C转染组、ox-LDL诱导组以及ox-LDL+ pCDNA3.1-cystatin C转染组，检测各组细胞乳酸脱氢酶（LDH）、活性氧（ROS）、三磷酸腺苷（ATP）生成量以及caspase-3活性变化，并通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting法测定各组凋亡相关基因bax、bcl-2和Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。结果：ox-LDL+ pCDNA3.1-cystatin C转染组与ox-LDL诱导组比较，LDH、ROS生成量和caspase-3表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；ATP生成量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR和Western blotting法测定显示ox-LDL诱导组促凋亡基因bax及Bax蛋白表达增加、抗凋亡基因bcl-2和Bcl-2蛋白表达减少，ox-LDL＋pCDNA3.1-cystatin C转染组Bcl-2表达增加、Bax表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：Cystatin C抑制ox-LDL诱导的VSMC凋亡，其机制可能与其上调Bcl-2及下调Bax表达有关。     

IL-6表达增高及TNFα下调参与bcl-2反义寡脱氧核苷酸诱导的细胞凋亡的调控

目的 探讨bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,AS-PS-ODN)诱导细胞凋亡的调控机理。方法 合成bcl-2 AS－PS－ODN作用于小细胞肺癌细胞株NCI－H446，流式细胞仪DNA倍体分析和脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡；多重半定量逆转录－聚合酶链反应检测bcl-2 AS－PS－ODN处理前后bcl-2，c-myc,survivin,bax,s100A2,TNFα，TGFβ1及IL－6等基因mRNA表达的变化。结果 bcl-2 AS－PS－ODN能够诱导NCI－H446细胞凋亡，随着bcl-2 mRNA水平的下降，IL－6表达增高72．71％（P＜0．05），TNFα表达下调65．90％（P＜0．05），而c-myc,survivin,bax,s100A2,TGFβ1等基因的表达无明显变化。结论 IL－6表达增高及TNFα下调参与bcl-2反义寡脱氧核苷酸所诱导的细胞凋亡的调控。     

三氧化二砷诱导Raji细胞凋亡过程中端粒酶活性和hTERT、bcl-2基因表达的研究

目的：研究三氧化二砷（As2O3）诱导Raji细胞凋亡并初步探讨端粒酶活性、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因及bcl-2基因表达之间的关系。 方法： 通过姬姆萨染色来观察细胞的凋亡；以RT-PCR分析bcl-2、hTERT基因的mRNA表达水平；利用半定量多聚酶链反应-酶联免疫反应(PCR-ELISA)方法检测As2O3处理Raji细胞前后端粒酶活性的改变。 结果： 2 μmol/L As2O3能诱导Raji细胞凋亡，2 μmol/L As2O3作用于Raji细胞8 h、12 h、24 h hTERT mRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异（P＜0.05）， 12 h、24 h bcl-2 mRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异。2 μmol/L As2O3作用48 h后，Raji细胞中端粒酶活性即出现下降，作用72 h、96 h，端粒酶的活性明显受到抑制，吸光度分别为0.829、0.328、0.291，分别与空白对照组比较有显著差异（P＜0.05）。结论： As2O3诱导Raji细胞凋亡过程中，端粒酶活性下调与hTERT、bcl-2基因mRNA表达下降有关。     

hTERT 基因反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的研究

目的 在体外实验中，探讨hTERT反义核酸诱导卵巢癌细胞发生凋亡的可能性，揭示该凋亡发生与bcl-2和bax之间的关系。方法采用TUNEL染色法，定性、定量地研究hTERT反义核酸与卵巢癌细胞凋亡的关系；通过免疫组织化学法检测凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果hTERT反义核酸在体外能诱导卵巢癌细胞发生凋亡。下调bcl-2的表达，增强bax的表达。结论诱导卵巢癌细胞发生凋亡是hTERT反义核酸抗卵巢癌作用的机制之一。hTERT反义核酸可能通过下调bcl-2的表达及增强bax的表达诱导卵巢癌细胞发生凋亡。     

三氧化二砷诱导卵巢癌细胞凋亡的研究

目的在体外实验中,探讨三氧化二砷(As2O3)诱导卵巢癌细胞发生凋亡的可能性,揭示该凋亡发生与bcl-2和bax之间的关系。方法采用TUNEL染色法,定性、定量地研究As2O3与卵巢癌细胞凋亡的关系;通过免疫组织化学法检测凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果As2O3在体外能诱导卵巢癌细胞发生凋亡,下调bcl-2的表达,增强bax的表达。结论诱导卵巢癌细胞发生凋亡是As2O3抗卵巢癌作用的机制之一,As2O3可能通过下调bcl-2的表达及增强bax的表达诱导卵巢癌细胞发生凋亡。     

FRMD8抑制肺癌细胞的增殖与迁移

目的 探讨FERM domain-containing protein 8（FRMD8）在肺癌发生发展中的作用。 方法 用Western blotting检测肺癌组织及相应癌旁正常组织中FRMD8的表达情况;敲低FRMD8后平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,MTT法检测细胞增殖情况;过表达FRMD8后流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测过表达FRMD8后某些细凋亡相关蛋白表达变化;过表达及敲低FRMD8后Transwell细胞迁移实验检测对A549细胞迁移能力的影响。 结果 1. 与正常组织相比,肺癌组织中FRMD8表达下调（P＜0.05）; 2. FRMD8敲低,细胞克隆形成能力及增殖速度提高; 3. FRMD8可诱导细胞凋亡,并影响细胞凋亡相关基因的表达或活化： FRMD8过表达可下调Caspase-3、8和bax表达,而p53、激活型Caspase-3、8以及bcl-2 的表达上调; 4. FRMD8过表达抑制细胞迁移能力（P＜0.01）,而敲低FRMD8则促进细胞迁移（P＜0.001）。 结论 FRMD8可抑制肺癌的发生发展,并具有肿瘤抑制子的功能。     

四环素调控表达的反义bcl-2对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC生长和凋亡的作用

目的 研究由四环素调控的反义bcl-2的表达对人神经母细胞瘤细胞系SK－N－MC细胞的生长和凋亡的作用并初步探讨其相关机制。方法 非定向克隆构建携带反义bcl-2 cDNA片段的由四环素调控表达的真核细胞表达载体PUCCOMB1^CMV/Asbcl-2;应用脂质体Lipofectamine^TM介导转染SK－N－MC细胞,同时以空载体转染细胞作为对照。MTT法研究细胞的生长和增殖状况,提取DNA梯带和应用流式细胞术检测凋亡细胞。逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）研究细胞凋亡中bcl-xL/bcl-xS基因在mRNA水平上表达的变化。Western杂交检测bcl-2及其上下游相关基因caspase-3、PARP的变化。结果 转染反义bcl-2的细胞生长增殖缓慢,在去血清培养的相同的时间内其凋亡细胞数也明显多于对照组细胞,提前出现DNA梯带。在细胞的凋亡过程中检测到非活性caspase-3酶原蛋白减少并检测到bcl-2、PARP蛋白的降解产物条带。但bcl-xL/bcl-xS基因在mRNA水平上表达无明显变化。结论 反义bcl-2 mRNA可抑制SK－N－MC细胞的生长和增殖,促进去血清培养所诱导的SK－N－MC细胞的凋亡。大细胞凋亡过程中caspase-3被激活,bcl-2和PARP蛋白被裂解,但bcl-xL/bcl-xS在反义bcl-2 mRNA诱导的SK－N－MC细胞的凋亡过程中无变化。     

白藜芦醇诱导KG-1细胞凋亡作用机制的初步研究

通过观察白藜芦醇诱导人急性白血病细胞株KG-1凋亡的作用,检测bcl-2、caspase-3的表达,探讨白藜芦醇诱导白血病细胞凋亡的作用机制。采用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;瑞-吉染色、透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡与周期分布;半定量RT-PCR检测bcl-2 mRNA、caspase-3 mRNA表达水平。结果显示白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(P<0.01),与对照组相比,实验组使细胞发生S期阻滞(P<0.01),促进细胞凋亡(P<0.01),使bcl-2的表达下调,上调caspase-3的表达(P<0.05)。结论:白藜芦醇能诱导KG-1细胞凋亡,其机制可能与下调bcl-2、上调caspase-3表达水平有关。     

蝌蚪提取液对HL—60细胞相关癌基因表达的影响

目的：研究蝌蚪提取液（T871－3）对白血病细胞的作用机制。方法：利用细胞形态学观察,细胞化学、TUNEL法等技术,并采用原位mRNA杂交和完整细胞原位斑点印迹技术,观察T871－3诱导HL－60细胞分化和凋亡过程中c-myc,c-myb,bcl-2癌基因表达的变化。结果：1．T871－3能抑制TH－60细胞分裂增殖。2．T871－3在低浓度时诱导HL－60细胞向单核／巨噬样细胞方向分化,高浓度时诱导细胞凋亡。3．T871－3诱导HL－60细胞分化的过程中伴随着c-myc,c-myb癌基因表达的下调,诱导HL－60细胞凋亡的过程伴随着c-myc,bcl-2癌基因的表达的下调,结论：T871－3可能通过调节癌基因的表达发挥其诱导HL－60细胞分化和调亡的作用。     

雌激素诱导的合成型血管平滑肌细胞凋亡与p38通路激活及肌细胞增强因子-2的表达

目的 探讨雌激素诱导合成型血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的分子机制.方法 体外培养第3代的雌性大鼠VSMCs分为3组:17β-雌二醇(E2)组、p38通路阻断(SB E2)组和对照组.药物处理72h后,ELISA法检测细胞内核小体以检测VSMCs凋亡率, Western blotting检测p38总蛋白、磷酸化p38(p-p38)的变化及肌细胞增强因子-2(MEF2)的表达,免疫组织化学染色确认MEF2的定位和表达.结果 ELISA检测显示,E2组VSMCs凋亡率明显高于对照组,而SB E2组无明显变化.Western blotting显示,E2组p38、p-p38和MEF2均明显增高,而SB E2组p38表达无明显变化,p-p38和MEF2明显降低.免疫组织化学染色显示,MEF2主要定位于细胞核,各组表达水平与Western blotting结果一致.结论 雌激素可能通过激活p38通路上调MEF2的表达,诱导VSMCs凋亡.     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。 目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。 方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。 结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72 h表达最强,感染率达80%,96 h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

过氧化物酶体增生物激活物受体γ诱导的平滑肌细胞凋亡过程中相关基因p53和bcl-2表达的变化

目的：观察氧化修饰的低密度脂蛋白（ox-LDL）、过氧化物酶体增生物激活物受体γ（PPARγ）的两种激动剂噻唑烷二酮类（TZDs）的药物ciglitazone和15脱氧-前列腺素J₂（15d-PGJ₂）、PPARγ抑制剂PGF_2α诱导血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡过程中，对凋亡相关基因p53和bcl-2表达的影响。方法：将不同浓度ox-LDL、ciglitazone和15d-PGJ₂与原代培养的SD大鼠VSMC孵育。加入PPARγ的抑制剂PGF_2α，用流式细胞仪测定细胞凋亡率。用免疫组织化学方法观察凋亡相关基因蛋白P53和Bcl-2的表达。结果：ox-LDL和ciglitazone、15d-PGJ₂可诱导VSMC凋亡，PPARγ的抑制剂PGF_2α抑制其凋亡。此过程中，P53表达随诱导剂浓度的增加而表达增加，加入PGF_2α后，P53蛋白的表达又降低，差异有显著性（P<0.05）；凋亡相关基因bcl-2的变化也有显著意义。结论：PPARγ的活性改变了凋亡相关基因的表达；凋亡相关基因p53和bcl-2参与了PPARγ诱导的平滑肌细胞凋亡过程。     

TSC-36/FRP inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and migration

OBJECTIVE: In-stent restenosis is a vascular proliferation/migration disorder characterized by hyperplasia of vascular smooth muscle cells (VSMCs). Because mounting evidence suggests that the therapeutic potential of anti-proliferation and anti-migration therapy, we investigated possible inhibitory effects of the matricellular protein TGF-beta-stimulated clone 36 (TSC-36) on vascular smooth muscle cell proliferation and migration in vitro and in vivo. METHODS: Human umbilical artery smooth muscle cells (SMCs) were treated with inducting agents daidzein or estradiol. TSC-36 expression was detected by nested competitive PCR and in situ hybridization. TSC-36 was expressed in Origami (DE3) cells. The recombinant protein was used to immunize rabbits to produce polyclonal antibodies. VSMCs were treated with various concentrations of recombinant TSC-36 (rTSC-36) protein and daidzein. The MTT assay was used to analyze for cell proliferation. A transwell system was used to detect cell migration. Flow cytometry was used to detect cell phase. A rat carotid artery balloon injury model was duplicated. The rats were treated with daidzein or solvent control. Animals were sacrificed 5 weeks later, and injured arteries were taken for pathology and histology. RESULTS: TSC-36 mRNA and protein expression was induced in SMCs. Cell proliferation and migration were inhibited by rTSC-36. rTSC-36 caused accumulation of SMCs in G2 phase. The inducting agent daidzein decreased neo-intima proliferation. TSC-36 mRNA and protein expression was induced and expressed in the neo-intima. CONCLUSION: TSC-36 can be induced in VSMCs and inhibits VSMCs proliferation in vitro and in vivo.     

Aging reduces susceptibility of vascular smooth muscle cells to H₂O₂-induced apoptosis through the down-regulation of Jagged1 expression in endothelial cells

In addition to excessive proliferation, reduced apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMCs) plays a key role in aging-exaggerated neointima formation after vascular injury. Our previous studies have shown that impaired expression of Jagged1 in the endothelium may be a key event that leads to enhanced VSMC proliferation in the elderly. Here, we are the first to investigate whether the expression of Jagged1 in endothelial cells (ECs) may regulate apoptosis of VSMCs. We discovered that VSMCs co-cultured with senescent ECs exhibited decreased susceptibility to H?O?-induced apoptosis compared with those co-cultured with young ECs. Senescent ECs also displayed lower Jagged1 expression compared to young ECs, which was more evident after H?O? stimulation. Overexpression of Jagged1 in senescent ECs significantly promoted H?O?-induced apoptosis in the co-cultured VSMCs, whereas silencing Jagged1 expression in young ECs reduced H2O2-induced apoptosis in the co-cultured VSMCs. Our studies also revealed that Jagged1 expressed in ECs exerted its pro-apoptotic activity by lowering expression of the anti-apoptotic protein Bcl-2. These results demonstrate that aging reduces the susceptibility of co-cultured VSMCs to H?O?-induced apoptosis through impaired Jagged1 expression in ECs.     

氧化型胆固醇下调血管平滑肌细胞金属蛋白酶组织抑制剂基因表达

目的:研究氧化型胆固醇对血管平滑肌细胞MMP-9及TIMP-1表达的影响。方法:离体培养兔主动脉血管平滑肌细胞,分别用胆固醇、Triol与25-OH负载细胞,狭缝杂交测定TIMP-1mRNA表达,细胞免疫化学测定MMP-9与TIMP-1蛋白表达。结果:Triol与25-OH(1 mg/L,24 h)抑制TIMP-1 mRNA及蛋白表达,对MMP-9蛋白表达无影响。结论:氧化型胆固醇可以下调血管平滑肌细胞TIMP-1基因表达。     

apelin-13下调caveolae可促进血管平滑肌细胞增殖

背景：结合课题组以往研究成果,提出caveolae可能参与apelin-13促血管平滑肌细胞增殖的假设。 目的：实验观察细胞膜特殊凹陷结构caveolae参与G蛋白偶联受体APJ的内源性配体apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用。 方法：采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用MTT方法观察血管平滑肌细胞增殖,Western Blotting方法观察信号蛋白表达,免疫共沉淀技术检测信号分子复合物的形成。 结果与结论：①caveolae结构破坏剂β-环糊精(5 mmol/L,25 h)可明显增强apelin-13诱导的血管平滑肌细胞增殖。②apelin-13(0,1,2,4,8 µmol/L)刺激血管平滑肌细胞,caveolin-1的表达下调,在1 µmol/L时下调明显。③β-环糊精        (5 mmol/L)破坏caveolae后,可使apelin-13下调caveolin-1表达的作用增强。④对照组(体积分数为0.1%胎牛血清孵育)及处理组(apelin-13刺激)caveolin-1与PI3K及ERK1/2均有复合物形成,在apelin-13刺激的情况caveolin-1-PI3K复合物减少、caveolin-1-ERK1/2复合物减少,即apelin-13可能促进caveolin-1与PI3K及ERK1/2解离。结果提示细胞膜特殊凹陷结构caveolae参与apelin-13促血管平滑肌细胞增殖作用。     

腺病毒介导Gax基因对血清刺激后兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:通过腺病毒介导人生长终止特异性同源异形盒基因(Gax)转染体外兔血管平滑肌细胞(VSMCs),观察人Gax基因过表达对血清刺激后兔VSMCs增殖和凋亡的影响,为Gax基因成为理想的静脉桥再狭窄基因治疗的候选基因提供实验基础。方法:Ad5-hGax重组腺病毒载体转染兔VSMCs后,采用Western blot检测不同时间细胞中hGax蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hGax对血清刺激后兔VSMCs的体外增殖抑制情况;转染72 h后流式细胞术检测Ad5-hGax诱导血清刺激后VSMCs的凋亡率。结果:转染后1 d、3 d、5 d,Ad5-hGax组细胞中的hGax蛋白均有明显表达;MTT法检测显示hGax基因过表达能明显抑制血清刺激后兔VSMCs的增殖;流式细胞术检测显示转染72 h后,hGax过表达能显著诱导血清刺激后兔VSMCs的凋亡。结论:hGax基因过表达能有效抑制血清刺激后VSMCs的增殖,并促进其凋亡,为腺病毒介导Gax基因治疗静脉桥再狭窄提供重要的实验基础。     

辛伐他汀抑制胎牛血清及PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖及对抑癌基因PTEN表达的影响

目的:观察辛伐他汀(simvastatin)对血清及血小板源生长因子(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的抑制作用及simvastatin对细胞周期和G₁/S周期转换重要调节基因PTEN蛋白表达的影响。方法:[³H]-胸腺嘧啶核苷酸掺入测定VSMCsDNA合成,流式细胞仪检测细胞周期情况,Western印迹杂交法检测PTEN蛋白表达。结果:Simvastatin以剂量依赖关系抑制血清及PDGF-BB诱导的VSMCs[³H]-胸腺嘧啶核苷酸掺入,使G₀/G₁期细胞比例明显增多,S期细胞比例显著减少,并上调PTEN蛋白表达,而3羟3甲戊二酰辅酶A代谢产物甲羟戊酸能抑制simvastatin上调PTEN的表达。结论:Simvastatin抑制血清及PDGF-BB诱导的VSMCs增殖阻滞细胞周期可能与上调PTEN表达有关,且simvastatin调节PTEN的表达可能通过抑制甲羟戊酸的合成而实现。