p16基因转染对胰腺癌细胞生长及辐射敏感性的研究

目的 探索p16基因转染对胰腺癌细胞生长辐射敏感性的作用。方法 将外源野生型p16基因连接到pCDNA3.1^＋载体构建pCDNA3.16＋ -p16重组质粒,利用Lipofectamine^TM介导转染胰腺癌JF305细胞,筛选阳性克隆。照射后,RT-PCR检测p16基因表达,Western blot检测蛋白表达;用MTT法测定细胞生长曲线和肿瘤细胞杀伤率。结果 转染p16基因的JF305细胞有外源p16基因的整合及表达,生长速度明显减少,对辐射的敏感性增强。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胰腺癌细胞恶性增殖,提高胰腺癌细胞对辐射的敏感性。     

神经上皮细胞转化基因1对细胞辐射敏感性的影响及其机制探讨

目的 探讨神经上皮细胞转化基因1(Net1)对细胞辐射敏感性的影响及相关的分子作用机制.方法 运用实时荧光定量PCR检测辐射后细胞中Net1基因表达水平的变化;采用RNAi干扰技术抑制细胞中Net1的表达,用克隆形成率分析细胞的辐射敏感性;利用免疫共沉淀技术发现Net1的结合蛋白.结果 电离辐射损伤后,细胞中的Net1 mRNA水平显著上升(t=-10.52,P＜0.05);与对照组相比,siRNA沉默细胞中的Net1表达后明显增加了细胞的辐射敏感性(t=15.31、11.65,P＜0.05);无论在正常状态下还是在细胞受到辐照后,Net1都能与非同源末端连接修复蛋白Ku70、Ku80和DNA-PKcs结合.结论 Net1对细胞的辐射防护作用可能是通过与非同源末端连接修复蛋白相互作用来调控辐射损伤修复实现的.     

人肺腺癌A549细胞低剂量辐射超敏感性及其机制的研究

目的 观察A549细胞的低剂量辐射超敏感性现象,探讨其发生的机制。方法 A549细胞接受0~2 Gy的⁶⁰Coγ射线照射后,流式细胞仪对其分选计数,克隆形成法检测细胞存活分数,Western blot法检测ATM1981Ser-P蛋白表达,Hoechst 33258荧光染色法、AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,PI单染流式细胞仪检测细胞周期。结果 细胞在0~0.3 Gy表现出单位剂量杀伤增强,在0.3~0.5 Gy表现出一定的辐射抗性,0.5 Gy后的区域存活分数随辐射剂量的增加而降低。照射后1 h,ATM激酶在0.2 Gy时开始活化,0.5 Gy时活化达高峰(t=7.96,P<0.05);与0.5 Gy相比1.0和2.0 Gy的活化水平无明显变化(t=0.69、0.55,P>0.05)。照射后24 h,部分细胞发生凋亡,其凋亡曲线与存活曲线相吻合。与未照射组相比,0.1和0.2 Gy组在各时间点(照射后6、12和24 h)的细胞周期无明显变化,而0.3、0.4和0.5 Gy 组,照射后6和12 h细胞发生G₂/M期阻滞(t＝2.87、2.88、4.92和3.70、3.12、8.11,P<0.05),照射后24 h G₂/M期细胞比例下降(t＝3.87、4.77、3.01,P<0.05)。结论 A549细胞存在HRS/IRR现象,其发生可能与ATM激酶、细胞周期变化有关,凋亡是细胞死亡的主要方式。     

小鼠乳腺癌辐射敏感细胞SX-9的ku基因突变与辐射敏感性研究

目的　研究辐射敏感小鼠乳腺癌细胞SX 9的ku70、ku80基因型 ,初步探讨ku基因突变对其辐射敏感性的影响。方法　RT PCR克隆并鉴定ku70 /ku80全长基因 ,并对其全长进行全自动测序。脂质体转染正常人全长ku80cDNA至SX 9细胞 ,克隆形成比较转染了正常ku80基因的SX 9与SX 9以及SR 1细胞存活率。结果　SX 9细胞ku70基因正常 ,而其ku80存在基因突变 ,转染了正常人全长ku80cDNA的SX 9细胞能部分重建其对γ射线的存活率。结论　SX 9细胞ku基因发生突变 ,这可能是其DNA损伤修复缺陷并导致对辐射敏感的分子基础     

辐射诱导的野生型及突变型PTEN基因重组质粒的构建及鉴定

目的构建辐射诱导人野生型及突变型PTEN基因重组质粒并进行鉴定。方法以HeLa细胞总DNA为模板PCR扩增Egr-1基因启动子辐射敏感区,将PCR产物分别定向插入携带野生型PTEN和突变型PTEN蛋白编码基因的表达载体pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E启动子区,构建具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E。同时,将Egr-1基因启动子辐射敏感区亚克隆入pGL3-Promoter载体中,通过荧光素酶报告实验,验证不同照射剂量、照射后不同时间点下人肝癌SMMC-7721细胞中Egr-1启动子区对X线照射的辐射诱导能力。Western印迹检测X线照射对PTEN蛋白表达的影响。结果凝胶电泳分析证实,PCR扩增出Egr-1基因启动子辐射敏感区,构建出具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E,经不同酶切实验均证实含有与Egr-1辐射诱导区和PTEN基因相同片段大小的条带。荧光素酶报告实验证实,在不同时间点和不同照射剂量照射下,含Egr-1启动子区报告质粒细胞组的荧光素酶活性均明显高于转染空载体细胞,Western印迹检测表明,转染了pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E的细胞组在未接受照射时PTEN蛋白的表达量极低,但在接受8 Gy的X线照射后,PTEN蛋白的表达量明显提高,高于转染了pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E的细胞。结论成功构建了具有辐射诱导能力的含人野生型及突变型PTEN基因的重组质粒,为今后肿瘤的治疗奠定了基础。     

PTEN抑癌基因对 A549肺癌细胞辐射敏感性的影响

目的评价外源性PTEN抑癌基因对人A549肺癌细胞辐射敏感性的影响。方法体外培养A549肺癌细胞株,用脂质体介导法将PTEN导入A549肺癌细胞系,以空载体转染细胞作为对照。然后用MTT法和克隆形成实验测定2种癌细胞对~(60)Co-γ射线的敏感性。并检测肿瘤细胞PKB的表达。结果相同剂量照射下,A549-pBP-PTEN细胞存活与A549细胞相比明显减少,治疗指数分别为1.69;转染PTEN对肿瘤细胞PKB的表达产生抑制。结论外源性野生型PTEN抑癌基因能增强A549肺癌细胞对γ射线的敏感性。     

癌的易感性辐射敏感性与辐射致癌

放射卫生防护标准的制定是基于如下假设,即受照群体中相同年龄、相同性别的个体,在受到相同条件的电离辐射照射后,会产生相同的致癌效应,换言之,是以假设人群中癌易感性和辐射致癌敏感性的“均质”为前提的。而随着研究的逐步深入发现事实并非如此,人群中存在着对癌...     

宫颈癌辐射敏感性相关基因的研究进展

放射治疗前,对宫颈癌患者进行辐射敏感性检测以预测放疗效果的研究在肿瘤治疗中有很好的应用前景。根据细胞基因表达水平预测辐射敏感性及基因治疗逆转宫颈癌放射抵抗成为研究热点。影响宫颈癌辐射敏感性的基因主要有细胞增殖、凋亡基因和肿瘤细胞乏氧相关基因等,而基因芯片法分析多个辐射敏感相关基因,对于预测宫颈癌的辐射敏感性和治疗可能更有意义。     

血根碱对人脑胶质瘤A172细胞生长及放射敏感性的影响

目的 探讨血根碱对人脑胶质瘤A172细胞的生长及放射敏感性的影响.方法 采用MTT法检测血根碱处理后A172细胞的生长和增殖;细胞流式技术测定细胞周期改变以及活性氧(ROS)的变化;磷脂酰丝氨酸外翻分析法检测细胞凋亡;细胞克隆形成法观察血根碱和辐射的联合作用.结果 血根碱明显抑制脑胶质瘤A172细胞的生长,12、24和48 h血根碱处理导致细胞生长抑制的半数抑制浓度(IC50)分别为4.83、3.91和3.25 μmol/L.血根碱可以诱导剂量依赖性的细胞周期S期阻滞.与未处理的对照组相比,5 μmol/L血根碱处理A172细胞24 h后,早期凋亡细胞比例从(2.92±0.83)％增至(60.01±3.73)％,晚期凋亡细胞从(0.64±0.19)％增至(2.70±0.18)％,坏死细胞从(0.52±0.19)％增至(3.93±0.76)％,差异均具有统计学意义(t=55.28、8.32和9.51,P＜0.05).另外,血根碱可以诱导ROS的产生,5μmol/L血根碱处理后ROS水平是对照组的4.1倍,而抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸(NAC)能有效地抑制血根碱的细胞毒作用.采用多靶单击模型拟合曲线发现,与单纯照射组相比,血根碱预处理+照射的联合处理组的放射增敏比(SERD0)达1.48.结论 血根碱可以通过诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡和ROS的产生抑制脑胶质瘤A172细胞的生长,而且在低剂量下,血根碱预处理可增加放射敏感性.     

FTO基因对人脑胶质瘤A172细胞放射敏感性的影响及其机制

目的 通过改变人脑胶质瘤细胞系A172中脂肪量与肥胖相关基因(FTO)的表达,研究FTO基因对细胞放射敏感性的影响及其机制.方法 按FTO表达情况将细胞分为正常表达组(A172)、低表达对照组(A172/NC)、低表达组(A172/siRNA)、高表达对照组(A172/PC)和高表达组(A172/FTO).Western blot法检测受X射线照射后A172组内FTO蛋白的表达水平;克隆集落形成实验检测5组细胞的放射敏感性;免疫荧光法和Western blot法检测FTO对受照后A172细胞内DNA损伤及损伤修复相关蛋白的影响.结果 A172细胞内FTO蛋白表达水平与照射剂量和照后时间有关;A172/siRNA组和A172/FTO组的放射增敏比(SER_D0)分别为1.829、0.812;抑制FTO表达能使γ-H2AX foci数目增加(t=-21.884,P<0.05),Ku80和p-p95/NBS1蛋白下调(t=24.731、23.293,P<0.05),Rad50蛋白表达上调(t=3.140,P<0.05);FTO高表达后DNA损伤修复相关蛋白表达结果与前面相反(t=0.642、-8.364、26.829,P<0.05).结论 FTO是一种辐射抗性基因.改变FTO表达能显著改变A172细胞的放射敏感性,其机制可能与FTO能调控电离辐射引起肿瘤细胞的原发性损伤、改变照射后DNA损伤修复有关.     

Ku蛋白表达与鼻咽癌细胞放射敏感性 关系初探

目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1（鼻咽高分化鳞癌细胞株）、CNE-2（鼻咽低分化鳞癌细胞株）中DNA依赖蛋白激酶（DNA—PK）的调节亚基Ku70、Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数，并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值，以及四氮唑蓝比色分析法（MTT法）检测^60Co γ射线4Gy照射后的细胞群体生长情况，以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术（RT-FQ-PCR）检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平Ku70、Ku80基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高，MID值分别为2．78、1．61，SF2值分别为0．627、0．341；4Gy照射后的存活率分别为88．2％、72．3％；RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有Ku70、Ku80基因的表达，其相对表达量之比分别为1．76±0．54（P=0．07）、13．82±3．78（P=0．004），Ku80基因在CNE-2细胞中存在剂量依赖关系。结论实验验证了CNE-2比CNE-1对射线更敏感，Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。     

印记基因PHLDA2过表达对骨肉瘤细胞的放射增敏作用及机制研究

目的 探讨印记基因PHLDA2过表达对骨肉瘤放射敏感性的影响及相关分子机制。方法 通过基因转染技术,将真核表达质粒pEGFP-C3-PHLDA2导入骨肉瘤U2OS细胞,经G418持续筛选获得稳定高表达PHLDA2蛋白的亚克隆细胞。实验分为3组：不转染的空白对照组,U2OS;稳定转染pEGFP-C3质粒的阴性对照组,U2OS-neo;pEGFP-C3-PHLDA2质粒的稳定转染组,U2OS-PHLDA2。采用CKK8比色法测定4和8 Gy X射线照射后细胞的增殖活性;克隆形成实验观察0~8 Gy照射后细胞的存活能力;Annexin V/PI染色法检测8 Gy照射后的细胞凋亡;Western blot测定蛋白的表达变化。建立人骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,观察10 Gy照射后PHLDA2基因的体内增敏效应。结果 经筛选获得的骨肉瘤亚克隆U2OS-PHLDA2细胞中PHLDA2蛋白表达上调（t=13.73,16.28, P<0.05）。与U2OS和U2OS-neo组相比,PHLDA2高表达组在4和8 Gy的增殖能力明显降低（t=5.00~8.23,P<0.05）,2~8 Gy的克隆形成能力明显降低（t=－2.52~－1.26,P<0.05）;同时照后裸鼠移植瘤的生长抑制作用显著提高（t=3.27、2.91,P<0.05）。8 Gy照后,PHLDA2高表达组的凋亡率为（17.97±1.69）%,高于U2OS组的（6.47±1.01）%和U2OS-neo组的（7.15±0.96）%（t=10.11、9.61,P<0.05）;同时Caspase-3活性明显提高（t=11.26、10.72,P<0.05）。结论 外源性PHDLA2基因在U2OS细胞中稳定过表达能够提高骨肉瘤对X射线的敏感性,其机制可能是通过增强Caspase-3的活性、促进射线诱导的细胞凋亡作用实现的。     

调控Cox-2基因表达与食管癌细胞放射敏感性机制的初步探讨

目的 通过调控环氧合酶-2(Cox-2)基因表达来探讨影响食管癌细胞放射敏感性的机制.方法 通过构建C ox-2特异性siRNA,转染EC9706细胞,调控细胞内Cox-2表达,检测不同辐射剂量后MMP-2 、Bcl-2 mRNA、AKT蛋白和磷酸化AKT的表达,以及观察集落形成、细胞增殖、细胞凋亡、体外细胞侵袭能力,结果采用单因素方差分析进行统计学处理.结果 2和4 Gy照射后,上调组Bcl-2 mRNA表达量升高(F=3.36、4.32,P＜0.05);下调组MMP-2 mRNA表达量降低(F=3.86、8.09,P＜0.05),Bcl-2 mRNA表达量降低(F=3.73、5.64,P＜0.05),Bax mRNA表达量升高(F=7.03、7.42,P＜0.05).而各组细胞总AKT蛋白和磷酸化AKT蛋白印迹呈现上调组最强印迹,下调组最浅印迹.下调组细胞随照射量的增加凋亡率上升陡度最大,且差异有统计学意义(F=317.40,P＜0.05).G0～G1期细胞比例逐渐升高,S和G2～M期细胞比例逐渐降低,细胞增殖抑制率明显升高,体外侵袭实验穿透细胞数下降陡度最大.结论 调控C ox-2基因表达影响食管癌细胞放射敏感性的机制可能是,下调细胞内Cox-2 mRNA表达继而下调MMP-2、Bcl-2 mRNA表达,上调Bax表达,导致肿瘤细胞的侵袭及转移能力的降低,促进其向G0 ～G1期细胞转换,诱导细胞凋亡.同时使AKT和磷酸化AKT(pAKT)水平下降,影响PI3 K/Akt信号转导途径降低其放疗抗拒的能力.     

榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞放射敏感性影响及其机制的研究

目的 探讨榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响及其分子机制。方法 克隆形成实验检测10、20 μg/ml榄香烯乳对人肺腺癌A549细胞的放射敏感性影响。细胞分为空白对照组、单纯照射组(4 Gy X射线照射)、单纯药物组(给予10、20 μg/ml榄香烯乳);联合照射组(给予10、20 μg/ml 榄香烯乳24 h后4 Gy X射线照射)。Western blot检测DNA-PKcs、Bcl-2及P53蛋白的表达变化,并分析DNA-PKcs与Bcl-2、P53表达之间的相关性。结果 10 μg/ml榄香烯乳的放射增敏比SER_D0、SER_Dq 为1.54±0.20和1.43±0.15;20 μg/ml榄香烯乳SER_D0、SER_Dq 为1.63±0.32及1.75±0.19。与单纯照射组相比,10、20 μg/ml榄香烯乳联合照射组细胞的DNA-PKcs蛋白表达明显减少(t=7.52、8.33, P<0.05),Bcl-2蛋白表达明显减少(t=10.74、11.33, P<0.05),P53蛋白表达明显增加(t=-9.25、-7.66P<0.05)。DNA-PKcs与P53蛋白表达显著负相关(r=-0.569,P<0.05),与 Bcl-2蛋白表达显著正相关(r=0.755, P<0.05)。结论 榄香烯乳可增加人肺腺癌A549细胞的放射敏感性,其机制与下调DNA-PKcs表达抑制DNA双链损伤修复和上调p53,下调Bcl-2表达促进细胞凋亡有关。     

过表达miR-29c靶向抑制AKT2增强肝癌HepG2细胞放射敏感性的实验研究

目的 探讨miR-29c靶向AKT2对肝癌细胞HepG2放射敏感性的影响。方法 RT-PCR检测人正常肝THLE-3细胞和肝癌HepG2细胞中miR-29c表达。给予不同剂量（0、2、4、6和8 Gy）的X射线照射后,RT-PCR检测HepG2细胞中miR-29c表达变化。经生物信息学预测并采用双荧光素酶报告基因实验和Western blot检测miR-29c与AKT2的靶向关系。采用脂质体2000将miR-29c mimic/AKT2基因重组质粒和miR-29c inhibitor/慢病毒载体AKT2 shRNA转染至HepG2细胞中,并给予不同剂量X射线照射后,克隆形成实验和MTT实验检测miR-29/AKT2对HepG2细胞存活率和细胞活力的影响。结果 与THLE-3细胞相比,HepG2细胞中miR-29c明显降低,差异有统计学意义（t=17.816,P<0.05）;HepG2经2、4、6和8 Gy X射线照射后,细胞存活率较THLE-3细胞显著降低（t=4.541、6.823、7.218、9.363,P<0.05）,HepG2细胞中miR-29c表达显著下降（t=5.599、9.262、10.470、10.873,P<0.05）。miR-29c过表达可降低HepG2细胞存活率和细胞活力（t_存活率=4.307、7.668、7.668、6.894,P<0.05;t_细胞活力=3.443、8.116、13.434,P<0.05）;反之,抑制miR-29c表达则升高HepG2细胞存活率和细胞活力（t=4.003、6.713、7.141,P<0.05;t_细胞活力=4.282、5.113,P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验表明,AKT2是miR-29c的靶基因,Western blot检测结果显示,miR-29c可负向调控AKT2蛋白表达。沉默AKT2后,HepG2细胞的存活分数及细胞存活率趋势与miR-29c过表达相一致;反之,AKT2过表达则与抑制miR-29c表达相一致。结论 miR-29c可通过靶向AKT2增加肝癌细胞HepG2放射敏感性。     

慢病毒介导的DKC1基因沉默对人宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响

目的 探讨降低角化不良蛋白基因（DKC1基因）表达对人宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响。方法 以慢病毒为载体通过shRNA技术建立DKC1基因低表达的细胞模型,并利用RT-PCR、Western blot验证干扰效率。将细胞分为干扰组、空白对照组和阴性对照组,通过端粒重复序列扩增酶联免疫吸附试验（TRAP-ELISA法）检测端粒酶活性,实时PCR检测相对端粒长度,克隆形成实验计算克隆形成率,并利用单击多靶模型拟合细胞存活曲线、计算放射生物学相关参数（D₀、D_q、N、SF₂）及放射增敏比（SER）。结果 以慢病毒为载体的DKC1干扰序列（Lv-shDKC1）转染HeLa细胞后,与空白对照组相比,干扰组DKC1 mRNA及蛋白表达水平均明显下降,其表达抑制率分别为（71.330±4.112）%（t=25.53,P<0.05）、（35.520±3.804）%（t=4.833,P<0.05）。与空白对照组及阴性对照组相比,干扰组端粒酶活性从0.900±0.044、0.897±0.031降到0.713±0.021（F=31.44,P<0.05）,相对端粒长度从4.233±0.306、4.633±0.379降到2.667±0.404（F=39.15,P<0.05）,而空白对照组及阴性对照组间端粒酶活性和相对端粒长度差异均无统计学意义（P>0.05）。干扰组存活分数（SF₂）（0.571±0.006）明显低于空白对照组（0.861±0.009）及阴性对照组（0.807±0.002）（F=1 812,P<0.05）,SER为1.508。结论 干扰DKC1的表达对人宫颈癌HeLa细胞有放射增敏作用,可通过抑制端粒酶活性、缩短相对端粒长度而发挥放射增敏作用,有望成为新的放射增敏靶点。     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制。方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin。酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性。结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin 蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t₁=10.63,P<0.001;t₂=3.75 ,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D₀、D_q无明显变化,而pGenesil2-survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性。结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性。