白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/AO_2细胞增殖和凋亡的影响

背景:对白血病患儿在白血病细胞获得耐药、抗凋亡特性的过程中机制的研究目前其少,多数研究集中在正常骨髓间充质干细胞和已建系的基质细胞,而未重视患儿骨髓间充质干细胞与自血病细胞之间的相互作用.目的:课题创新性提出白血病患儿骨髓间充质干细胞可能对白血病细胞株K562/AO_2生长增殖及凋亡产生影响的理论假设.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2007-12/2008-08在广州医学院第一附属医院儿科实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于广州医学院第一附属医院住院的30例自血病患儿,其中急性淋巴细胞白血病患儿22例,急性粒细胞白血病8例,患儿家属对实验均签署知情同意书.K562/AO_2细胞株由天津血液病研究所提供.方法:Ficoll密度梯度法分离培养白血病患儿骨髓间充质干细胞.设立2组:K562/AO_2细胞组单独悬浮培养处于对数生长期的K562/AO_2细胞:K562/AO_2细胞+骨髓间充质干细胞共培养组在骨髓间充质干细胞贴壁呈融合状态时,加入1×10~8 L~(-1)处于对数生长期的K562/AO_2细胞,24 h后去除未黏附的K562/AO_2细胞.主要观察指标:白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/AO_2细胞生长的影响,AnnexinV-FITC法检测阿霉素对K562/AO_2细胞凋亡的影响,流式细胞仪测定不同条件培养下的K562/AO_2细胞周期,Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测不同条件培养下耐药基因mdr1的表达.结果:与单独悬浮培养的K562/AO_2细胞比较,K562/AO_2细胞+骨髓间充质干细胞共培养组的K562/AO_2细胞生长较为缓慢,无明显的对数生长期;早期凋亡细胞数明显减少(P＜0.05);处于G0-G1期的K562/AO_2细胞明显增多,S期细胞减少;K562/AO_2细胞mdr1耐药基因的表达无明显差异(P＞0.05).结论:体外细胞学实验结局证实,白血病患儿骨髓间充质干细胞诱导的K562/AO_2细胞耐药与mdr1基因无关,而是通过黏附作用改变K562/AO_2细胞周期,进而逃避药物的促凋亡作用.     

联合转染mdr1和mcl1基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对mdr1和mcl1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对K562/A02细胞耐药的逆转作用.方法根据mdr1和mcl1基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性shRNA干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染K562/A02细胞,用G418和(或)Hygro B筛选出稳定表达的细胞克隆.用RT-PCR分析mdr1和mcl1 mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术测定细胞P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率.结果成功构建两个基因的shRNA干扰表达质粒.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组mdr1基因和mcl1基因的mRNA相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染后K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对K562/A02细胞耐药逆转率最高,P糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P《0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P《0.01).联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P《0.05).结论转染mdr1或mcl1基因的shRNA干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果.mcl1基因可能与K562/A02耐药相关.     

白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562／A02细胞增殖和凋亡的影响

背景：对白血病患儿在白血病细胞获得耐药、抗凋亡特性的过程中机制的研究目前甚少,多数研究集中在正常骨髓间充质干细胞和已建系的基质细胞,而未重视患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞之间的相瓦作用。 目的：课题创新性提出白血病患儿骨髓间充质干细胞可能对白血病细胞株K562/AO2生长增殖及凋亡产生影响的理论假设。 设计、时间及地点：细胞学体外实验,于2007-12／2008—08在广州医学院第一附属医院儿科实验室完成。 材料：骨髓间充质干细胞来源于广州医学院第一附属医院住院的30例自血病患儿,其中急性淋巴细胞白血病患儿22例,急性粒细胞白血病8例,患儿家属对实验均签署知情同意书。K562／AO2细胞株由天津血液病研究所提供。 方法：Ficoll密度梯度法分离培养白血病患儿骨髓间充质干细胞。设立2组：K562/AO2细胞组单独悬浮培养处于对数生长期的K562／AO2细胞;K562/AO2细胞＋骨髓间充质干细胞共培养组在骨髓间充质干细胞贴壁呈融合状态时,加入1×10^8L^-1处于对数生长期的K562／AO2细胞,24h后去除未黏附的K562／AO2细胞。 主要观察指标：白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562／AO2细胞生长的影响,AnnexinV-FITC法榆测阿霉素对K562／AO2细胞凋亡的影响,流式细胞仪测定不同条件培养下的K562／AO2细胞周期,Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR愉测不同条件培养下耐药基因mdr1的表达。 结果：与单独悬浮培养的K562／AO2细胞比较,K562／AO2细胞＋骨髓间充质干细胞共培养组的K562／AO2细胞生长较为缓慢,无明显的对数生长期;早期凋亡细胞数明显减少（P〈0．05）;处于G0-G1期的K562／AO2细胞明显增多,S期细胞减少：K562／AO2细胞mdr1耐约基因的表达无明显差异（P〉0．05）。 结论：体外细胞学实验结局证实,白血病患儿骨髓间充质干细胞诱导的K562／AO2细胞耐药与mdr1基因无关,而是通过黏附作用改变K562／AO2细胞周期,进而逃避药物的促凋亡作用。     

人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响

本研究比较K562细胞与正常人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后细胞增殖、化疗敏感性及MDR1变化，以寻找白血病耐药与造血微环境的关系。对悬浮培养和与MSC黏附培养的K562细胞绘制细胞生长曲线；用流式细胞术测定细胞周期并观察化学药物对细胞存活率和凋亡的影响；用RT-PCR技术检测MDR1基因表达。结果表明：与悬浮培养比较，黏附培养K562细胞增殖受抑，G0／G1期细胞比例增加（P〈0．05），S期细胞比例下降（P〈0．05），G2／M期细胞比例增加（P〈0．01）。在柔红霉素（DNR）诱导的凋亡中，黏附培养组K562细胞凋亡受阻（P〈0．05）。黏附培养未诱导K562细胞MDR1基因表达，也未使K562／ADM细胞的MDR1基因表达发生改变。结论：K562细胞与MSC黏附接触共培养，可导致K562细胞生长抑制，并产生化疗耐药，其机制可能与MDR1无关。     

CD44基因沉默对K562/A02细胞逆转耐药及生物学活性的研究

本研究旨在探讨CD44基因表达抑制对白血病多药耐药细胞株K562/A02耐药性及生物学活性的影响。根据CD44基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,将其插入质粒表达载体中,获得针对CD44mRNA的特异性siRNA真核质粒(pGCsiRNA-CD44),转染K562/A02细胞。用实时荧光定量RT-PCR检测K562/A02细胞CD44、mdr-1和bcl-2mRNA的表达;用MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术(FACS)检测细胞周期;Hochest33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果表明:针对CD44基因的siRNA真核质粒可有效沉默K562/A02细胞的CD44基因:与对照组相比,转染了4条pGCsiRNA-CD44质粒的K562/A02细胞CD44表达均明显受抑,以转染了siCD44-1的细胞中抑制最强。转染pGCsiRNA-CD44质粒48小时后,K562/A02细胞CD44mRNA表达水平下降64.1%(p0.05),同时mdr-1与bcl-2mRNA的表达量较对照组分别下降了25.6%与50.8%;K562/A02细胞IC50为(17.97±1.61)μg/ml,无义序列质粒转染后阿霉素对K562/A02细胞的IC50为(16.95±1.72)μg/ml,pGCsiRNA-CD44转染后IC50明显降低为(8.77±1.63)μg/ml(p0.01)。转染48小时后,G0/G1期细胞比例提高了10.7%;细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论:特异性CD44siRNA可显著抑制K562/A02细胞CD44基因的表达,抑制细胞增殖,诱导其凋亡,并有效逆转K562/A02细胞的多药耐药性。     

联合转染mdrl和mcll基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对 mdrl 和 mell 基因的短发夹 RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对 K562/A02细胞耐药的逆转作用。方法根据 mdrl 和 mell 基因表达序列设计有效的 RNA 干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性 shRNA 干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染 K562/A02细胞,用 G418和(或)Hygro B 筛选出稳定表达的细胞克隆。用RT-PCR 分析 mdrl 和 mcll mRNA 的表达;MTT 法检测阿霉素对 K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术测定细胞 P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率。结果成功构建两个基因的 shRNA干扰表达质粒。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染 K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组 mdrl 基因和 mell 基因的 mRNA 相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染后 K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对 K562/A02细胞耐药逆转率最高,P 糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P<0.01)。联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论转染 mdrl 或 mell 基因的 shRNA 干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转 K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果。mell 基因可能与 K562/A02耐药相关。     

亚硒酸钠对K562/ADR多药耐药的逆转作用及其机制

本研究探讨亚硒酸钠对白血病耐药细胞株K562/ADR细胞的多药耐药性的逆转作用及其逆转机制。用噻唑蓝（MTT）法检测亚硒酸钠对K562/ADR细胞的生长抑制作用及其对K562/ADR细胞耐药性的逆转作用;应用流式细胞仪检测亚硒酸钠对K562及K562/ADR细胞凋亡率的影响;用半定量RT-PCR法检测K562/ADR细胞中mdr1和bcl-2基因的表达情况。结果表明,10μmol/L亚硒酸钠可以明显增加K562/ADR细胞对阿霉素敏感性,其耐药逆转倍数为2.31;早期凋亡率在10μmol/L亚硒酸钠作用于K562细胞48小时是升高的;而中、晚期凋亡率在亚硒酸钠5、10μmol/L作用48、72小时时均明显升高;两种浓度亚硒酸钠在作用48小时可使K562/ADR细胞早期凋亡率增加,作用48、72小时可使K562/ADR的细胞中、晚期凋亡率增高,10μmol/L的亚硒酸钠所致凋亡率高于5μmol/L,作用72小时的凋亡率高于48小时;亚硒酸钠可使K562/ADR细胞mdr1 mRNA及bcl-2mRNA表达下降。结论：亚硒酸钠可部分逆转K562/ADR细胞的耐药性,其机制可能是增加K562/ADR细胞凋亡率,下调mdr1 mR-NA和bcl-2 mRNA的表达。     

三氧化二砷对K562/ADM耐药细胞凋亡抑制的逆转作用

目的:研究三氧化二砷(As2O3)诱导白血病K562/ADM耐药细胞凋亡的分子机制。方法:采用MTT比色法检测K562/ADM耐药细胞增殖活性,细胞形态学和annexinV /PI双染色检测细胞凋亡,RT-PCR检测mdr1、bcl-2和caspase-3基因mRNA的表达水平,流式细胞法(FCM)测定P-糖蛋白(P -glycoprotein,P-gp)和bcl-2蛋白表达及caspase-3活性。结果:As2O3显著抑制K562/ADM耐药细胞的增殖;经 As2O3处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变,annexinV /PI双染显示凋亡细胞明显增加;mdr1mRNA表达和P-gp合成明显降低,凋亡抑制基因bcl-2mRNA及其蛋白bcl-2表达下调, caspase-3mRNA表达和caspase-3活性显著增强。结论:As2O3诱导K562/ADM耐药细胞凋亡,其主要机制可能为As2O3抑制 mdr1和bcl-2基因表达,逆转耐药白血病细胞因bcl-2和P-gp高表达所介导的凋亡抑制。     

硼替佐米体外诱导K562细胞凋亡的作用不受骨髓间充质干细胞的影响

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米在有或无骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells)条件下对白血病细胞株K562促凋亡作用,以及对MSC和K562细胞的黏附分子VCAM-1表达的影响.建立MSC和K562细胞的共培养体系,以终浓度为50 mnol/L的绷替佐米处理K562细胞4-24小时,应用Annexin-V/PI双染法检测K562细胞凋亡,半定量RT-PCR检测VCAM-1 mRNA的表达.结果显示,硼替佐米可诱导K562细胞凋亡,并呈现时间依赖性;共培养组调亡细胞比例与单独培养组相比无显著差异;K562细胞与MSC共培养可诱导K562细胞表达VCAM-1,MSC在共培养前后表达VCAM-1无明显变化.硼替佐米作用24小时后,K562细胞表达VCAM-1消失,MSS表达VCAM-1明显下降.结论:硼替佐米在MSC存在的情况下依然可诱导白血病细胞凋亡,提示硼替佐米可拮抗MSC对白血病细胞的保护作用.     

葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂PDMP对K562/A02细胞柔红霉素耐药逆转的研究

本研究旨在探讨葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)抑制剂D,L-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol(PDMP)hydrochloride对K562/A02细胞株柔红霉素(daunorubicin,DNR)耐药的逆转作用及其逆转机制。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度PDMP对K562细胞和K562/A02细胞的增殖抑制效应及其对K562/A02细胞DNR耐药逆转作用;用流式细胞术检测PDMP对K562/A02细胞内DNR浓度及细胞凋亡率的影响;半定量RT-PCR和Western blot方法检测K562及K562/A02细胞mdr1、GCS基因的表达以及PDMP对K562/A02细胞两种基因表达的影响。结果表明:DNR对K562和K562/A02细胞的IC50分别为0.23±0.02和7.15±0.24μg/ml,当PDMP≤20μmol/L时,对K562及K562/A02细胞株无明显生长抑制作用;20μmol/L和10μmol/L PDMP均能增加K562/A02细胞对DNR的敏感性,其耐药逆转倍数分别为2.59和1.69;两种浓度PDMP作用于耐药株48小时后能增加细胞内DNR浓度(p0.05)和细胞凋亡率(p0.01)。20μmol/L PDMP处理K562/A02细胞48小时后可在mRNA和蛋白水平下调GCS和mdr1基因的表达(p0.01)。结论:PDMP可以增强K562/A02细胞对DNR的敏感性,其机制可能与增加细胞内药物浓度及细胞凋亡率、下调GCS和mdr1基因表达有关。     

黑色素瘤抗原基因3在K562细胞内质网应激反应性凋亡中的表达及意义

本研究旨在探讨黑色素瘤抗原基因-3（melanoma antigen gene-3,MAGE-3）在内质网应激反应性凋亡中的表达及意义.应用Ca^2＋荧光指示剂Fura-2/AM通过荧光分光光度计测定白血病细胞系K562及其多药耐药细胞株K562/A02经thapsigargin作用前后细胞内Ca^2＋浓度（[Ca^2＋]i）变化;Western blot检测GRP78蛋白表达变化;荧光显微镜观察细胞凋亡形态变化;TUNEL法检测细胞凋亡率;RT-PCR检测MAGE-3基因mRNA水平表达变化.结果显示：①毒胡萝卜素（thapsigargin）诱导K562和K562/A02细胞[Ca^2＋]i出现不同程度的升高并呈一定的浓度依赖性,同时诱导GRP78蛋白表达增加以及K562和K562/A02细胞典型的凋亡改变,细胞凋亡率亦呈一定的浓度依赖性;在静息状态下K562/A02细胞[Ca^2＋]i较K562细胞明显增高;②毒胡萝卜素诱导K562和K562/A02细胞凋亡过程中,MAGE-3 mRNA表达明显下调;此外,与K562细胞比较,K562/A02细胞MAGE-3 mRNA表达明显上调.结论：①毒胡萝卜素在一定浓度范围内可诱导K562及其多药耐药细胞株K562/A02发生内质网应激反应性凋亡,并可能与MAGE-3表达下调有关或MAGE-3基因可能参与此凋亡途径的调控;②MAGE-3可能具有抗凋亡活性,K562/A02细胞多药耐药性可能与细胞[Ca^2＋]i增高和MAGE-3表达上调有关.     

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。     

细胞内钙与K562/A02细胞多药耐药相关性的研究

本研究旨在探讨白血病耐药细胞的发生及其逆转机制与细胞内钙离子浓度的关系。用甲基四唑蓝法(MTT)测定柔红霉素 (daunomycin ,DNR)的细胞毒性 ,用Fura 2 /AM方法测定耐药细胞株K5 6 2 /A0 2及其敏感株K5 6 2的静息 [Ca2 ]i水平 ,并观察了柔红霉素及耐药调节剂汉防己甲素 (Tetrandrine,Tet)、屈洛昔芬 (droloxifene,DRL)单独或联合应用后细胞内游离钙离子浓度的变化。结果表明 :1μmol/LTet,5 μmol/LDRL均能增加DNR对耐药细胞系K5 6 2 /A0 2的细胞毒作用 ,IC50 (半数抑制量 )分别为 ( 7.2 8± 2 .0 6 ) μg/ml,( 7.5 8± 3.4 4 ) μg/ml,逆转倍数为 2 .94和 2 .82倍。两药联合作用明显增强 ,IC50 为 ( 1.6 6± 0 .4 1) μg/ml,逆转倍数达 12 .9倍。静息状态下K5 6 2 /A0 2细胞的游离钙离子浓度显著高于K5 6 2细胞。 1μmol/LTet,5 μmol/LDRL单独作用于K5 6 2 /A0 2细胞引起 [Ca2 ]i的明显升高 ,两者联合应用有拮抗作用。结论 :K5 6 2 /A0 2细胞内Ca2 浓度的增高可能是导致其耐药的原因之一 ,但耐药调节剂Tet,DRL对耐药细胞 [Ca2 ]i的影响在其逆转耐药中的作用有待进一步研究     

晚期糖基化终末产物和汉防己甲素对K562及K562/A02细胞增殖的影响

本研究旨在探讨晚期糖基化终末产物(AGE)对K562及K562/A02细胞增殖的影响及汉防己甲素(Tet)对AGE诱导细胞增殖的干预作用,并初步探讨其可能机制。用CCK8法观察AGE对K562及K562/A02细胞增殖及Tet对AGE诱导细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率及晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达,并用半定量RT-PCR检测RAGE mRNA相对表达水平。结果显示:AGE可促进K562及K562/A02细胞增殖,呈浓度依赖性,0-48 h内细胞增殖随时间延长而增强,72 h增殖仍明显高于对照组;AGE上调两种细胞RAGE mRNA及其蛋白的表达,具有浓度依赖性;Tet与AGE共作用于K562及K562/A02细胞48 h,可通过诱导细胞凋亡抑制AGE促细胞增殖的作用,且呈浓度依赖性,但Tet对AGE诱导RAGE mRNA及其蛋白表达的增加未见明显影响。结论:AGE可促进K562及K562/A02细胞增殖,其机制可能与上调细胞RGAE mRNA及其蛋白的表达有关;Tet可抑制AGE诱导的K562及K562/A02细胞增殖,其机制可能与改变AGE诱导的RGAE mRNA及其蛋白表达增加无关。     

汉防己甲素联合屈洛昔芬逆转K562/A02细胞耐药与诱导凋亡相关性的研究

本研究旨在探讨汉防己甲素(tetrandrine，Tet)联合屈洛昔芬(droloxifene，DRL)对耐药细胞系K562／A02的逆转作用与诱导凋亡有无相关性。采用Annexin V/PI法测定耐药调节剂汉防己甲素、屈洛昔芬单独或联合应用后细胞凋亡的情况。结果发现0.62ug/ml汉防己甲素或1/94ug/ml屈洛昔芬单独作用于K562细胞48小时后均可诱导一定比例的细胞凋亡，作用呈时间依赖性，两者联合应用作用增强。0.62ug/ml汉防己甲素或1.94ug/ml屈洛昔芬单独作用于K562／A02细胞均不能诱导细胞凋亡，两者联合应用72小时可诱导小部分细胞凋亡。结论：汉防己甲素，屈洛昔芬逆转耐药的机理与诱导K562／A02细胞凋亡无关。     

骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖及凋亡的影响

本研究比较K562细胞与相同数量以及不同数量的人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后K562细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化,以探讨MSC对人白血病K562细胞生长的影响。通过建立正常人骨髓MSC的体外培养体系及其与K562细胞共培养的体系测定K562细胞的生长曲线;将不同数量的MSC与K562细胞共培养测定K562细胞的增殖率曲线;应用流式细胞术检测K562细胞周期以及凋亡的变化。结果显示：与单独K562细胞培养相比,K562细胞与相同数量MSC共培养后,生长受抑;K562细胞与不同数量MSC共培养后,MSC对K562细胞的抗增殖作用呈剂量依赖性;细胞周期分析发现,K562细胞与MSC共培养后,G0／G1期以及G2／M期的细胞增加,S期的细胞减少。共培养24、48、72小时后流式细胞仪检测发现,K562细胞的凋亡率下降。结论：正常人骨髓MSC能使导致K562细胞生长抑制,阻止K562细胞周期的运行,凋亡率下降,且在一定范围内,随着MSC数量的增加,对K562细胞的抗增殖作用增强。     

PLK1基因沉默对K562/A02细胞周期、增殖和耐药性的影响

为了探讨小干扰RNA(siRNA)对K562/A02细胞Polo样激酶1(PLK1)基因的抑制作用及其对细胞周期、细胞增殖和耐药性的影响,将构建的针对PLK1mRNA的siRNA真核质粒,导入K562/A02细胞,用RT-PCR和Western-blot方法分析PLK1基因在转染前后的表达差异;台盼蓝拒染试验检测细胞存活率;流式细胞术(FACS)检测细胞周期和细胞内阿霉素(ADM)的积累量;MTT试验检测细胞对ADM的药物敏感性。结果显示,与对照组相比,转染24和48小时后,siRNA-PLK1质粒转染组的PLK1mRNA下降(34.7±2.1)%和(56.6±1.5)%,蛋白水平下降(49.9±3.2)%和(62.1±1.7)%;转染24和48小时后,细胞存活率下降了30%和59%;转染48小时后,G2/M期细胞比例提高了2.77倍,同时细胞内ADM积累量显著提高;对ADM药物敏感性的相对率为73.8%。结论:PLK1基因沉默能有效抑制K562/A02细胞生长,使细胞周期停滞在G2/M期,同时使得细胞内ADM积累量提高,对ADM敏感性增强。     

小檗胺逆转K562/A02细胞耐药性及其机制

为了探讨钙调素拮抗剂小檗胺 (berbamine,BBM )逆转多药耐药的可能性及其机制 ,采用人红白血病细胞K5 6 2及其阿霉素 (ADR)诱导的耐药细胞K5 6 2 /A0 2与不同浓度ADR和BBM共培养后 ,经MTT比色法计算半数抑制浓度 (IC50 )、耐药倍数和增敏倍数 ;用流式细胞术检测细胞内ADR相对含量和P gp表达水平 ;用半定量RT PCR检测mdr1mRNA和抗凋亡基因survivinmRNA表达。结果显示 ,ADR对K5 6 2和K5 6 2 /A0 2的IC50 分别为1 16± 0 .0 9μmol/L和 37.4 7± 1.76 μmol/L ,K5 6 2 /A0 2对ADR的耐药倍数是K5 6 2的 32 .30倍。 5 μmol/L ,10μmol/L和 2 0 μmol/LBBM增加K5 6 2 /A0 2细胞对ADR的敏感性 ,并呈剂量依赖性 ,增敏倍数分别达 2 .0 1,9.6 8和4 1.18倍 (P值均 <0 .0 1)。5 μmol/L或 10 μmol/LBBM作用 2小时 ,使K5 6 2 /A0 2细胞内ADR相对含量增加到1 4 1和 1 5 2倍 (P <0 .0 1) ;作用 72小时使K5 6 2 /A0 2细胞P gp表达分别下降 4 .12 % ( P <0 .0 5 )和 2 7.0 9% (P<0 .0 1) ,且下调mdr1mRNA和survivinmRNA表达。结论 :BBM提高耐药细胞K5 6 2 /A0 2胞内的ADR浓度 ,下调mdr1mRNA、P gp及survivinmRNA的表达 ,使其对ADR的敏感性显著增高 ,从而逆转耐药性。     

去铁胺对白血病细胞K562/A02的影响及机制研究

本研究旨在探讨铁螯合剂去铁胺对人白血病耐阿霉素细胞K562/A02的影响及其作用机制。采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度去铁胺作用48小时对K562/A02细胞增殖的抑制效应;流式细胞术检测去铁胺25、50、100和200μmol/L作用K562/A02细胞48小时后细胞的凋亡率;半定量RT-PCR检测各组细胞凋亡基因BAX、BCL-2以及多药耐药基因1(MDR1)mRNA表达变化;Western blot检测各组细胞P-糖蛋白(P-gp)表达变化。结果显示,随着去铁胺药物浓度的增加,细胞活力逐渐下降,凋亡率明显增加,呈剂量依赖性;随着去铁胺浓度增加,BAX表达水平逐渐升高,但MDR1 mRNA与P-gp的表达受到显著抑制。结论:去铁胺可以通过螯合细胞内铁,影响细胞DNA的合成;同时去铁胺可抑制阿霉素诱导的MDR1、P-gp表达,增加白血病细胞对化疗药物的敏感性,进而诱导凋亡。