腺病毒介导HIF-1基因转染对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的：研究腺病毒介导缺氧诱导因子-1α基因转染对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用。方法：采用纯化培养的新生大鼠心肌细胞建立缺血再灌注损伤模型,实验分6组：正常细胞培养组,缺氧复氧损伤模型组（I／R组）,基因转染小、大剂量组（AdHIF-1α组,MOI50,100）,转染腺病毒空载体组（AdBlank组）,转染HIF-1α核酶基因组（AtHIF-1α组）。测定各组缺氧复氧后细胞损伤指标乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量及细胞活性情况。结果：AdHIF-1α组（MOI50,100）较I／R组、AdBlank组、AtHIF-1α组LDH、MDA明显降低,细胞活性高（P〈0．05）。结论：腺病毒介导HIF-1α基因转染心肌细胞具有抗缺血再灌注损伤、保护心肌的作用。     

重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α对脑缺氧后神经元中缺氧诱导因子-1α的调控

目的探讨重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)转染对缺氧后的大鼠大脑皮层神经元中HIF-1α的调控作用及可能机制。方法 (1)制备大鼠大脑皮层神经元原代培养模型及缺氧模型。重组腺病毒缺氧诱导因子-1α(AdHIF-1α)转染和重组腺病毒空载体(Ad)转染正常及缺氧细胞;将其分为正常对照组(Normal)、缺氧组(Hypoxia)、AdHIF-1α基因转染组、Ad组。(2)荧光显微镜下观察AdHIF-1α/Ad转染情况;采用蛋白印迹(Western blot)法分别在12 h、24 h、48 h及72 h观察各实验组HIF-1α蛋白的表达。结果用Ad/AdHIF-lα转染缺氧的神经元后, 在荧光显微镜下观察转染48 h时荧光表达最明显。Western blot检测经AdHIF-1α基因转染组各时间点HIF-1α的表达明显增加, 12 h有阳性表达, 24 h表达有所增加, 48 h达高峰, 持续到72 h开始下降, 与缺氧组相比差异均有统计学意义(P<0.01, P<0.05), Ad组与缺氧组相比无统计学意义。结论重组腺病毒介导的HIF-1α基因转染能明显提高缺...     

体外转染Klotho基因对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注的影响

目的研究转染Klotho基因对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注的影响。方法培养H9c2(2-1)大鼠心肌细胞,建立模拟缺血再灌注模型,Fermentas转染试剂介导小鼠Klotho基因转染H9c2(2-1)大鼠心肌细胞。实验分4组:对照组(Control组)、缺血再灌注组(I-R组)、转染Klotho基因组(Klotho组)、转染Fermentas转染试剂空载体组(Vehicle control组)。各组进行缺血再灌注后RT-PCR及免疫荧光法检测Klotho mRNA及Klotho蛋白表达,MTT法检测细胞活性,测定上清液乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及Klotho含量。结果 Klotho组较I-R组和Vehicle control组Klotho mRNA、Klotho蛋白表达明显增加,LDH、MDA明显降低,细胞活性高(P<0.01)。结论 Fermentas转染试剂介导的Klotho基因转染H9c2(2-1)大鼠心肌细胞可保护H9c2(2-1)大鼠心肌细胞、减轻H9c2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤。     

缺氧诱导因子（HIF）-1α介导的辛伐他汀抗大鼠心肌细胞凋亡作用

目的：观察原代心肌细胞模拟缺血／再灌注（I／R）对缺氧诱导因子（HIF-1α）表达的影响以及HIF-1α在辛伐他汀心肌细胞保护中的作用。方法：原代培养心肌细胞,采用Western blot检测HIF-1α在心肌细胞中的表达水平,采用HEPES缓冲液在低氧（10ml／L）条件下培养心肌细胞2h（模拟缺血组,ISC组）,然后以含有100ml／L新生牛血清的DMEM培养液在常规细胞培养箱中继续培养细胞6h（缺血／再灌注组,I／R组）,辛伐他汀预处理（SIM）组是用2μmol／L辛伐他汀预处理心肌细胞后再进行I／R处理。以这种方法模拟细胞在缺血时缺乏血清、糖和氧供的培养条件,再灌注时恢复血清、糖及正常供氧供的条件。接着,运用表达HIF-1α的腺病毒载体在原代心肌细胞中的过表达HIF-1α,采用Western blot检测PARP降解程度方法检测对照腺病毒（AdC）组、对照腺病毒感染细胞进行I／R处理（AdCIR）组、对照腺病毒感染细胞采用2μmol／L辛伐他汀预处理后进行I／R处理（AdCIRS）组和Ad-HIF-1α感染细胞后采用2μmol／L辛伐他汀预处理后进行I／R处理（AdHIRS）组心肌细胞的凋亡程度。结果：模拟I／R诱导HIF-1α表达,原代心肌细胞模拟缺血2hHIF-1α表达是对照组的（3．4±0．8）倍（P〈0．05）;而模拟缺血2h／再灌注6h组HIF-1α达是对照组的（8．9±1．5）倍（P〈0．05）。辛伐他汀抑制I／R诱导的HIF-1α表达增高。采用表达HIF-1α的腺病毒过表达HIF-1α消了辛伐他汀抑制PARP蛋白降解产物的作用。结论：证明I／R可以诱导HIF-1α表达升高,而辛伐他汀可以显著抑制HIF-1表达的升高;辛伐他汀对HIF-1α表达的抑制是其心肌保护作用的机制之一。     

作者单位：030001山西省太原市 山西医科大学基础医学院生理学系,细胞生理学山西省重点实验室通讯作者：贺忠梅,E-mail：hezmei@126.com

目的 探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)稳定表达对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响及可能机制。方法 采用结扎冠脉左前降支45min,再灌注3h的方法,构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型;实验分为假手术组(Sham)、心肌缺血/再灌注组(MI/R)、HIF-1α活化剂DMOG 心肌缺血/再灌注组(D MI/R)、HIF-1α抑制剂YC-1 心肌缺血/再灌注组(YC-1 MI/R);采用全自动生化分析仪测定血清心肌酶(CK-MB,LDH)活性;Western blot检测心脏组织HIF-1α蛋白表达;Evens blue/TTC染色测定心肌梗死面积;TUNEL染色及Caspase-3,8,9活性测定心肌细胞凋亡。结果 (1)与MI/R 组相比,D MI/R 组的HIF-1α蛋白表达量明显增加,心肌酶CK-MB、LDH的活性降低,心肌梗死面积明显减小,并且心肌组织的病理损伤减轻;(2)稳定HIF-1α表达可明显降低心肌细胞凋亡率,且部分逆转了缺血再灌注后心肌组织Caspase-9与Caspase-3的活性升高。结论 HIF-1α稳定表达可抑制线粒体途径介导的心肌细胞凋亡,从而发挥对缺血再灌注损伤的心脏保护效应。     

苯那普利对乳鼠心肌细胞缺氧复氧自由基损伤的保护作用

目的观察苯那普利对乳鼠心肌细胞缺氧复氧自由基损伤的保护作用和作用途径.方法采用纯化的乳鼠心肌细胞复制缺血再灌注模型.实验分为6组:正常对照组、单纯缺氧复氧组、缺氧复氧 苯那普利低剂量组(1×107 mol/L)、缺氧复氧 苯那普利组中剂量组(1×106 mol/L)、缺氧复氧 苯那普利高剂量组(1×105 mol/L)、缺氧复氧 中剂量苯那普利 缓激肽B2受体拮抗剂(HOE140)组(1×106 mol/L).细胞缺氧1 h复氧2 h后取培养液测定乳酸脱氢酶(LDH)的活性,取细胞测定MTT代谢率、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA).结果细胞缺氧复氧时LDH及MDA含量较对照组明显增高(P＜0.01),SOD活性及MTT代谢率较对照组明显降低(P＜0.01);不同剂量的苯那普利组降低LDH和MDA含量,提高SOD活性和MTT代谢率,与缺氧复氧组比较(P＜0.01),并呈剂量依赖性改变;苯那普利与HOE140合用时,与中剂量苯那普利组比较上述指标呈反向变化,差异有统计学意义(P＜0.01).结论苯那普利通过抗自由基达到对缺氧复氧损伤心肌的保护作用,其作用可能与激活激肽-缓激肽释放系统,促进缓激肽的合成有关.     

HIF-1α在七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注致线粒体功能损伤中的作用研究

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注致线粒体功能损伤中的作用。方法取Langendorff离体灌注模型成功的大鼠心脏88例,采用随机数字表法分为4组(n=22):对照组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)、七氟醚后处理组(Spost组)和HIF-1α抑制剂2ME2组(2ME2组)。Western blot测定HIF-1α表达水平;电镜观察线粒体超微结构;汉莎氧电极法测定线粒体3态呼吸(State3)、呼吸控制比(RCR);ATP试剂盒检测ATP含量;线粒体膜电位检测试剂盒检测膜电位变化。结果与I/R组比较,Spost组HIF-1α表达上调,State3、RCR、ATP、膜电位升高(P0.05)。结论 HIF-1α表达上调改善线粒体功能是介导七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的重要调控机制。     

缺氧诱导因子-1α对SD大鼠心室肌细胞缺血再灌注损伤的短暂保护作用

目的探讨缺氧诱导因子(HIF)-1α在SD大鼠心室肌细胞在缺血再灌注损伤(IRI)过程中的作用。方法原代培养心室肌细胞,继而用脂质体转染pc DNA3.1-full length HIF-1α和空载至心室肌细胞;建立体外心肌细胞IRI模型;分成处理后培养6 h和5 d两个检测体系;MTT法检测细胞活性,Western印迹和免疫细胞化学法检测相关蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果心室肌细胞缺血再灌注(IR)后细胞活性下降,凋亡率上调。在转染pc DNA3.1-full length HIF-1α质粒后,细胞活性明显增加,bcl-2和血管内皮生长因子(VEGF)表达上调,凋亡受到抑制;转染pc DNA3.1-full length HIF-1α组培养5 d后虽然HIF-1α仍高表达,但VEGF和bcl-2表达量下降,细胞活性下降,凋亡率升高。结论大鼠心室肌细胞IR后活性下降,凋亡增加;短时间内HIF-1α可在一定程度上保护细胞,增强细胞活性,抑制凋亡;但长期作用后,HIF-1α对IRI的心肌细胞并未起到保护作用。     

缺氧—复氧对培养的大鼠心肌细胞损伤与细胞凋亡的影响

目的探讨培养的大鼠心肌细胞在缺氧（缺血）和缺氧－复氧（再灌注）状态下心肌细胞损伤和细胞凋亡情况。方法采用１～３天新生ＳＤ大鼠,常规方式的培养心肌细胞,给予模拟缺氧（缺血）液、模拟复氧（再灌注）液以及干预因素（终浓度为２００Ｕ／ｍＬ的ＳＯＤ）处理,分为缺氧－复氧损伤组（Ｈ／Ｒ组）、缺氧－复氧损伤组＋ＳＯＤ（Ｈ／Ｒ＋ＳＯＤ组）、缺氧预处理组（ＨＰ组）和正常对照组（Ｃｏｎｔｒｏｌ组）,进行以下指标观察：     

α-硫辛酸通过mTOR通路抑制缺血再灌注诱导的PC12细胞自噬性凋亡

目的研究α-硫辛酸(LA)对PC12细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制。方法传代培养PC12细胞,PC12细胞缺氧/复氧(氧糖剥夺4 h,复氧18 h)模拟缺血再灌注损伤模型。实验分为正常组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+α-LA、缺氧/复氧+自噬抑制剂巴弗洛霉素(Baf)A1组。CCK8筛选α-LA的有效作用浓度;流式细胞术检测细胞凋亡变化;Western印迹检测细胞促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、酶切caspase-3、自噬标志分子SQSTM-1/P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ及mTOR通路的表达变化。结果缺氧/复氧显著降低PC12细胞的存活率(P<0.05),Western印迹结果显示Bax、酶切caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平均显著升高(P<0.05),P62和p-mTOR的表达水平降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,给予α-LA和Baf A1均能显著降低缺氧/复氧诱导的凋亡水平(P<0.05)。结论α-LA通过抑制缺氧/复氧诱导的过度自噬进而减少过度自噬诱导的细胞凋亡。