三种从琼脂糖凝胶回收DNA片段方法的比较

三种从琼脂糖凝胶回收ＤＮＡ片段方法的比较胡静，温进坤探针制备是进行核酸分子杂交的首要步骤。在制备作为探针的ＤＮＡ片段时，要将经内切酶切割后所生成的载体与插入片段混合物通过凝胶电泳分离后，再把所需的ＤＮＡ片段回收。回收ＤＮＡ片段的方法很多，如透析袋电洗...     

一种改进的质粒DNA提取及回收方法

一种改进的质粒ＤＮＡ提取及回收方法李和伟，王志永，刘彤华（北京协和医院病理科，北京１００７３０）目前已有多种方法从细菌中提取质粒ＤＮＡ￣［１］，其中最常用的是碱裂解法￣［２］，该方法操作简便，所提取质粒ＤＮＡ产量和纯度均较满意。我们在该方法基础上进行...     

一种可用于多DNA片段连接的新SOE-PCR方法

目的通过对重叠延伸PCR技术的改进,建立一种可用于多DNA片段连接的SOE-PCR方法。方法扩增获得相互重叠的1.8、1.1、1.3kb的短片段,以之作为亚片段模板。在SOE-PCR反应体系中加入不同数量用于重叠的亚片段模板及延伸所得目的长片段扩增所需的外引物,同时加入了稀释100倍的内引物,使得亚片段模板在扩增过程中能动态达到最佳重叠延伸浓度。结果获得了特异性强、丰度高的两段连接产物,与原有的SOE-PCR方法相比,大大减小了反应的非特异性条带扩增,产物丰度也优于传统的扩增方法。采用同样方法尝试了单管反应对三个片段进行连接,获得了总长度为4.2kb的长片段,且实验重复性、特异性好。结论本研究以相互重叠的多个短片段为模板,实现多片段的连接和扩增,可降低受模板浓度条件的影响的实验操作难度。多片段连接时减少了操作步骤和突变几率,可广泛用于多DNA片段连接操作。     

人酪氨酸羟化酶催化核心DNA片段的克隆与表达

获得编码人酪氨酸羟化酶催化核心ｃＤＮＡ片段,并观察其表达。方法采用人的全长ＴＨｃＤＮＡ为模板,设计特定的引物进行ＰＣＲ扩增反就并构建真核表达载体－质粒ｐＣＭＶＴＨｃ。在对目的片段测序后,将重组质粒转染到大鼠原代培养骨骼肌细胞内,用免疫组织化学方法检测其表达。     

从琼脂糖凝胶中回收DNA方法的评估

从琼脂糖凝胶电泳分离的条带中回收 DNA,是常用的分子生物学技术。回收的 DNA分子 ,根据目的不同 ,可用于连接重组、序列分析、制备探针等后续工作 [1 ]。目前从琼脂糖凝胶中回收 DNA的方法较多 ,如试剂盒法、电洗脱法、凝胶挖孔等。本研究从敏感性、回收率、经济性等几方面 ,比较了 3种常用的从凝胶中回收 DNA的方法 [2 ] 。1　材料与方法1.1　准备　为比较 3种方法对不同大小 DNA分子的回收效果 ,我们准备了 3种 DNA材料 ,大小分别为 12 0、840 bp和4.8kb。其中 12 0、840 bp片段为 PCR扩增产物[3 ] ;4.8kb的DNA为经 H ind 线性…     

UT—PCR——一种扩增未知序列微量DNA片段的方法

ＵＴ－ＰＣＲ——一种扩增未知序列微量ＤＮＡ片段的方法夏庆杰张思仲肖翠英武辉在致病基因的突变分析、分离克隆等医学分子生物学研究中，常常遇到这样的问题：虽然已经获得感兴趣的某ＤＮＡ片段，但由于量太微而难以继续进行克隆、测序、探针制备等操作。我们介绍一种能...     

线粒体DNA片段诱导小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化

目的 探讨线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）片段的恶性转化效应和转化机制。方法 采用基因转入技术，观察经ｍｔＤＮＡ片段转染后小鼠胚胎成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３）在裸小鼠体内的成瘤能力，并对形成的肿瘤进行病理观察；同时应用荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）方法，观察ｍｔＤＮＡ片段在ＮＩＨ３Ｔ３细胞核内的整合情况。结果 转染后１周，１８％～２０％的ＭＩＨ３Ｔ３细胞核中发现有目的基因探针的阳性杂交信号；转染后２周的培养细胞     

脑膜炎奈瑟菌DNA片段的引物设计及其临床应用

用聚合酶链反应(PCR)检测脑膜炎奈瑟菌,在染色体DNA中的保守区域选择一段核苷酸作为靶DNA,用PCR技术进行扩增.引物的核苷酸序列为20个碱基对,其GC比值在引物1、2分别是55%和50%,符合设计要求.将此片段94C变性,55C退火,72℃延伸35个循环可将极微量细菌扩增到能通过电泳凝胶检测出特异性产物.本方法快速、敏感、特异地检测脑膜炎奈瑟菌,具有重要的应用价值.     

7型腺病毒疫苗株DNA左侧17.5 mu片段克隆及4.8 mu片段核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒疫苗株ＤＮＡ左侧０～１７５ｍｕ片段克隆,分析０～４８ｍｕ片段（末端倒置重复序列、包装信号位点和Ｅｌａ区）核苷酸序列。方法从Ａｄ７疫苗株感染的Ａ５４９细胞提取Ａｄ７ＤＮＡ,将其０３～１７５ｍｕ片段克隆到质粒ｐＡｄ７Ｔ,并用自动和银染方法测序。结果获得了Ａｄ７疫苗株左侧１７５ｍｕ片段克隆,测定了左侧１７３７ｂｐ核苷酸序列,其中Ｅｌａ区所编码的６３００、２４０００、２８０００等３个蛋白的ＤＮＡ序列,与Ｇｏｍｅｎ株的同源性分别为９８９％、９７３％和９７５％,推导编码氨基酸的同源性分别为９６６％、９６５％和９６９％。这３个蛋白与Ｇｒｉｄｅｒ株的同源性分别为１００％、９９７％、和９９７％;推导编码氨基酸的同源性分别为１００％、９９１％和９９２％。结论Ａｄ７疫苗株左侧１７３８ｂｐ核苷酸与Ａｄ７Ｇｏｍｅｎ株和Ｇｒｉｄｅｒ株相应片段,具有高度的同源性。     

粒体DNA片段诱导小鼠胚胎 成纤维细胞恶性转化

Objective　To investigate the malignant transforming effect and mechanism of mitochondrial DNA (mtDNA) fragments. Methods　Tumorigenicity of mtDNA-transformed mouse embryonic fibroblast (NIH3T3) in nude mice was studied using transgenic techniques. Transformed tumors were detected by pathological examination and hybridization signals of mtDNA probe were analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques. Results　Hybridization signals were observed on the nuclei of 18%～20% NIH 3T3 cells 1 week after mtDNA fragments transforming. Tumor from mtDNA-transformed NIH 3T3 cells was developed in all 8 nude mice (8/8) respectively 2 weeks after the transformation. The pathological characteristics of the tumors developed were similar to that of fibrosarcoma. Conclusions　Auto-integration of mtDNA fragments into nuclear genome is a new factor involved in carcinogenesis.     

TRAIL及其5种受体DNA片段的扩增与序列分析

目的：制备TRAIL及其5种受体的特异性基因探针。方法：以PHA刺激人外周血淋巴细胞(PBL)增殖，从而诱导TRAIL及其受体的mRNA转录水平提高，然后用RT-PCR方法扩增出TRAIL及其5种受体的DNA基因片段，并采用基因测序法确证所得基因片段序列的正确性。结果：获得了TRAIL及其5种受体的DNA基因片段。结论：所用方法正确，为研究TRAIL及其受体调控细胞凋亡的机制提供了有价值的工具。     

HBV DNA PreC/C和BCP片段基因多态性研究

目的　研究乙肝患者HBVDNA核苷酸 (nt) 1735～ 196 5片段突变及其临床意义。方法　PCR扩增HBVDNAnt 1735～ 196 5片段 ,将产物进行HBVDNA测序。结果　在 6 8例乙肝患者中 ,nt 1735～ 196 5突变阳性率为 4 8 5 % ,检出点突变总数 16 8个 ,频率前 10位的是nt 176 4 (5 8.8% )、176 2 (44.1% )、1799(2 0.6 % )、176.6 (14.7% )、1896 (13.2 % )、175.4 (8.8% )、1899(8.8% )、176 8(7.4 % )、1814 (7.4 % )及 1913(7 4 % )。同时 ,首次检出nt 190 7、192 2、192 3位点突变。 5 4例慢性肝炎和 10例肝炎肝硬化患者HBVDNAnt 1896、176 4、176 2位点突变阳性率分别为 16.7%、35.2 %、35.2 %和 30.0 %、6 0.0 %、6 0. 0 % ,两者差异有统计学意义 (P <0.0 1)。结论　该研究提示 :(1)PreC C与BCP区基因突变可能与肝实质纤维化相关 ;(2 )HBVDNA突变发生率较高 ,且位点众多 ,基因测序对芯片探针设计有着十分重要的指导价值和临床意义     

大片段DNA的扩增

多聚酶链反应(PCR)近来已发展成一种标准的实验技术,并在分子生物学各个领域得到普及。然而该技术仍有两方面的局限性,一是与其它多聚酶相比,Taq多聚酶保真性相对较低。二是不能对3 kbp以上的DNA片段进行有效扩增。这就限制了体外致突变大结构的扩增以及含有未知长度内含子的真核基因DNA的扩增。     

一种改进的检测Y染色体DNA方法

作者用含有人类α样着丝粒重复家族顺序的DNA探针Y97,通过Southern分析检测Y染色体所特有的5.skb EcoRI片段。     

一种简单快速的用于分子克隆的DNA回收方法

一种简单快速的用于分子克隆的ＤＮＡ回收方法苏应斌，莫道君，伍欣星，赵文先（湖北医科大学病毒所分子生物室，武汉４３００７１）分子克隆中用于连接和转化的ＤＮＡ主要来自电泳琼脂糖凝胶中回收纯化的ＤＮＡ片段。已建立了许多回收ＤＮＡ的方法，如：低融点琼脂糖凝胶...     

同源无启动子DNA片段抑制人胰腺癌细胞株整合基因的表达

目的观察仅转染无启动子绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA全长片段能否使整合有GFP基因的胰腺癌细胞内GFP表达降低。方法用pEGFP—C1质粒转染人胰腺癌细胞株PANC-1,G418筛选及流式细胞术分选建立GFP蛋白高表达的稳定细胞株。用PCR方法从pEGFP—C1扩增出GFP基因全长cDNA并将其克隆至无启动子的复制型质粒PUC19,得到重组质粒即PUC—GFP。实验分为4组：空白对照组、空质粒组（PUC组）、GFP重组质粒干扰组（PUC—GFP组）、GFP小RNA干扰组（siGFP组）。分别用稳定表达GFP和未经处理PANC-1细胞进行实验。用Western印迹、流式细胞术与倒置荧光显微镜检测重组质粒对细胞内稳定表达的GFP的影响及对GFP阴性细胞pEGFPC1质粒瞬时转染后绿色荧光表达强度的影响。结果PUC—GFP可使稳定细胞株内的GFP表达下降,并且呈剂量依赖性。PUC—GFP组绿色荧光强度减弱程度和空白对照及空质粒组差异有统计学意义（P〈0．05）和siGFP组差异无统计学意义（P〉0．05）。转染后第4天GFP表达降低并可持续至第6天,第4天后PUC—GFP组和siGFP组对GFP的抑制差异无统计学意义（P〉0．05）。PUC—GFP与pEGFP—C1共转染GFP阴性PANC-1细胞株可使pEGPC1的瞬时转染效率降低。这两种情况下,荧光降低程度均和转染PUC—GFP的量呈正相关。结论仅转染无启动子的某个特定基因的全长cDNA能使哺乳细胞内相应同源性基因的表达降低。DNA干扰可用于哺乳动物细胞。