诺如病毒GⅡ.4型变异株感染流行的研究进展

诺如病毒是-种在全球范围广泛分布并引起急性感染性胃肠炎的病原体^[1].美国每年约有1.79亿例急性胃肠炎感染者,其中超过50％(36％-59％)为感染诺如病毒所致;每年因诺如病毒感染导致住院病例可达70 000例,其中死亡800例,带来医疗负担高达2.84亿美元^[2,3].包括美国在内,许多发达国家已建立了诺如病毒胃肠炎监测系统.本文主要对诺如病毒病原学和流行病学特征以及GⅡ.4型变异株在多国的流行概况进行综述.     

中国7个地区诺如病毒G II．4／Sydney 2012变异株分析

目的　分析2012--2013年冬季中国地区诺如病毒新流行株GII．4／Sydney 2012的衣壳蛋白区核苷酸与氨基酸变异特点。方法　对已获得的22份2012--2013年冬季北京地区GⅡ．4／Sydney2012株进行全衣壳蛋白区基因扩增。从GenBank检索中国其他地区的GⅡ．4／Sydney 2012株衣壳蛋白区核苷酸序列。对获得的GII．4／Sydney 2012株的衣壳蛋白区核苷酸及氨基酸序列与往年GⅡ．4流行株进行系谱分析。结果　获得中国7个地区（北京、上海、江苏、湖州、荆州、香港和台湾）的GⅡ．4／Sydney 2012株资料共38份（至少包含完整VPl核苷酸序列）。GH．4／Sydney 2012株之间VPl核苷酸差异为0．1％～3．3％,氨基酸差异为0～3．1％。系谱分析发现GⅡ．4／Sydney2012株与Apeldoorn 2008和NewOrleans 2009起自共同的分支。中国和悉尼GH．4／Sydney 2012代表株的A、D、E抗原表位氨基酸序列组合有两种：TSRN-GTT-SNT和TSRN-STT-SNT。结论　G II．4／Sydney 2012株已在中国多个地区出现,各地区病毒株同源性较高。G H．4／Sydney 2012株的抗原表位氨基酸组合发生明显改变。     

牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法.方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析,设计高度特异的引物和探针,建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaqMan Real-time RT-PCR).结果 该方法对NV核酸检测高度特异,且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应,最低检出限达102 copies/μl.对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaqMan Real-time RT-PCR进行NV检测,发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者,而粪便标本中两者无明显差别.同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠.结论 研究中建立的TaqMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测,可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法.     

广西壮族自治区首次检出的GⅡ.4型诺如病毒N/S区基因特征

目的 了解广西壮族自治区一起感染性腹泻疫情中GⅡ.4型诺如病毒(Norovirus)的基因特征.方法 采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应,对采集于这起疫情的34份粪便标本进行诺如病毒核糖核酸(RNA)的检测,并对随机选取的1份阳性样本进行N/S区核苷酸序列测定和分析,并构建系统进化树.结果 34份粪便标本中,有29份检测诺如病毒RNA阳性,阳性率为85.3%.随机选取的1株诺如病毒株(LC17株)的N/S区核苷酸序列与GⅡ型所有亚型参考株相比,其与第4亚型(GⅡ.4型)的参考株--Lordsdale/1993/UK株的核苷酸序列同源性为93.3%,在遗传进化树图中,与GⅡ.4型株病毒在一簇.与早年流行的GⅡ.4型流行株同源性为94.7%～96.5%,与国内外2006年流行株同源性为98.2%～98.6%,但与1株广州株相比,同源性仅为94.7%.结论 此次感染性腹泻疫情是由诺如病毒GⅡ.4型感染所致,其病毒基因型在广西壮族自治区是首次发现和报导.GⅡ.4型毒株在不断的进化,并在核甘酸序列特征和毒株地域分布上表现出多样性,需加强对诺如病毒的分子流行病学研究,了解基因型的分布,鉴别其来源和传播途径,对控制诺如病毒感染有重要意义.     

牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法．方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析，设计高度特异的引物和探针，建立以TaMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaMan Real-time RT-PCR)．结果 该方法对NV核酸检测高度特异，且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应，最低检出限达102 copies/μl．对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaMan Real-time RT-PCR进行NV检测，发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者，而粪便标本中两者无明显差别．同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠．结论 研究中建立的TaMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测，可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法．     

一起厨工污染食物引起GⅡ.17型诺如病毒暴发疫情调查

目的调查珠海市某中学一起急性胃肠炎暴发疫情原因。方法开展病例搜索,用描述性流行病学和病例对照研究进行分析。采集样本用多重RT-PCR检测诺如病毒核酸、测定核苷酸序列。结果该校共发生诺如病毒感染性腹泻51例(学生49例、厨工2例),罹患率12.3%(51/416);主要症状为腹痛、恶心、呕吐、腹泻和发热,症状均较轻,呈自限性,病例无班级和宿舍聚集性,无重症病例;食堂就餐是危险因素(OR=8.46);39份标本(病例及厨工肛拭子、食堂食物留样、厨房自来水及学校直饮水)中,有31份检出诺如病毒核酸阳性(GⅡ.17基因型),证实疫情是由GⅡ.17诺如病毒引起急性胃肠炎暴发,污染食物是主要原因。结论冬春季是诺如病毒感染高发季节,学校是发生疫情的主要场所,污染食物是引起暴发的主要原因之一。应开展针对性健康教育,加强食堂监督管理,定期开展体检,杜绝从业人员带病上岗;疫情暴发流行期要加强外环境消毒,及时控制疫情。     

成都市成华区诺如病毒GII.P16-GII.4 Sydney＿2012分子生物学特征

目的 研究2021年引发成都市急性胃肠炎聚集性疫情的诺如病毒GII.P16-GII.4 Sydney＿2012株的遗传进化和分子病原学特征。方法 采集2021年1—12月成都市65起急性胃肠炎聚集性疫情病例粪便及肛拭子样本825份,采用实时荧光定量PCR检测。结果为阳性的样本经由常规RT-PCR对RdRp区和VP1区扩增后测序,以BioEdit、MEGA-X将所得序列与全球各参考株序列比对并构建进化树,对其同源性、氨基酸变异、蛋白质三维结构等基因特征进行分析研究。结果 自上述65起疫情检出7种诺如病毒基因型,其中13起由Sydney＿2012株引起。比对分析结果显示,其同一起Sydney＿2012疫情中标本序列相似性为98.6%～100%,疫情之间序列相似性为96.2%～100%。结论 Sydney＿2012株可能成为成都地区流行的优势株,甚至有引起爆发疫情的可能性。持续加强诺如病毒疫情监测,有助于提升防控预警能力。     

应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒

目的建立基因Ⅱ型诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并应用于临床标本的检测。方法二氧化硅法提取粪便中的病毒RNA,使用针对基因Ⅱ型诺如病毒N/S结构域的引物和探针建立荧光定量PCR方法,对罗城县急性胃肠炎疫情的34份标本进行检测,并与常规RT-PCR和ELISA检测结果比较;还用该法对2006年2月至2007年1月广西急性胃肠炎暴发及散发病例粪便样本305份做了临床检测。结果用实时荧光定量RT-PCR法成功地从罗城疫情样本中检测出基因Ⅱ型诺如病毒,实时荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和ELISA的检出率分别为为85.3%、76.5%和26.5%。而实时荧光定量RT-PCR对114份对急性胃肠炎暴发疫情及191份散发病例样本的基因Ⅱ型诺如病毒检出率分别为56.1%和23.6%。结论诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有快速、灵敏和特异的优点,不但能对标本中病毒浓度进行定量检测,还能鉴别诺如病毒基因型别。同时也发现基因Ⅱ型诺如病毒感染在广西急性胃肠炎暴发疫情和散发病例中较常见。     

GⅡ-4型诺如病毒ORF2基因克隆及序列分析

目的 获得中国流行株GⅡ-4型诺如病毒(NoV)ORF2基因序列,为进一步研究诊断、疫苗提供基础依据.方法 从GⅡ-4型NoV粪便中提取病毒RNA,经逆转录后PCR并克隆到simple PMD18-T载体获得完整开放读码柜架(ORF2)阅读框序列.结果 获得了正确序列的基因Ⅱ-4,亚型(genogroup Ⅱ-4,GⅡ-4)NOV ORF2基因序列,经软件分析,3株NOV ORF2序列编码的氨基酸大小约为54KD,与VA387(GⅡ-4)氨基酸同源性为92%～93%.ORF2编码的氨基酸序列存在3个相对保守序列.结论 获得GⅡ-4型NoV ORF2基因序列,为进一步表达病毒衣壳蛋白及Nov感染的诊断试剂及防治疫苗药物研制提供基础依据.     

2011-2017年广东省牡蛎中诺如病毒污染状况分析

目的 分析2011—2017年广东省牡蛎中诺如病毒的污染情况,为开展牡蛎中诺如病毒污染状况的风险评估以及采取有效措施减轻污染程度提供科学依据。方法 2011—2017年选取广东省11个牡蛎消费量较大的地级市进行样品采集,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分别进行诺如病毒GI型和GII型检测。结果 共采集牡蛎样品1 298份,检出诺如病毒阳性217份,总阳性检出率为16.72%;其中GII型检出率（14.56% ）高于GI型（7.78%）,差异有统计学意义（P<0.01）。不同季节检出率差异有统计学意义（P<0.01）,以冬季检出率最高（43.40%）。产地为国外的牡蛎检出率（6.72%）低于国内（13.31%）,差异有统计学意义（P<0.01）。流通环节的检出率（18.21%）高于餐饮环节（13.53%）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 广东省流通和餐饮环节中的牡蛎均存在诺如病毒污染,以GII型为主,冬季检出率较高。     

感染性腹泻患者标本中检出GⅡ型诺如病毒

目的为确定引起腹泻的病原体,对腹泻患者标本进行诺如病毒核酸检测。方法应用实时荧光RT—PCR法对5份感染性腹泻患者粪便标本进行GI型和GII诺如病毒RNA检测。结果5份患者粪便标本中,1份检出GII型诺如病毒核酸。结论大连地区的感染性腹泻病例中存在GII诺如病毒感染。     

GⅡ型诺如病毒装甲RNA质控品研制

目的 采用MS2噬菌体装甲RNA技术构建内含GⅡ型诺如病毒RNA的装甲RNA质控品,为诺如病毒核酸检测提供安全稳定的标准品.方法 将MS2噬菌体成熟酶蛋白、包膜蛋白和调节位点基因(PAC基因)及GⅡ型诺如病毒520 bp片段克隆到表达质粒pET30b中,构建重组质粒pET-PAC,pET-PAC转入大肠杆菌BL21(D...     

南京地区诺如病毒GⅡ.Pe-GⅡ.4基因特征

目的研究南京地区诺如病毒GⅡ.Pe-GⅡ.4基因特征和变化规律,了解其进化过程及高变区氨基酸变化情况,预测进化方向及流行趋势,为疫情预警和处置提供科学依据。方法应用荧光定量PCR和一步法RT-PCR,对南京地区2014—2017年分离的10株GⅡ.Pe-GⅡ.4的部分聚合酶—衣壳蛋白区及P2区进行测序,并利用分子生物学软件对序列进行比对分析。结果进化树分析发现,2014—2015年和2016—2017年南京流行株分别位于两个簇。氨基酸分析显示,10株南京流行株同源性达97.3%～100.0%,与21株国内外2011—2017年参考株同源性达97.1%～100.0%。与2008年前驱期澳洲株(KX789174)P2区相比较,10株南京株共19个氨基酸位点发生改变,其中10个位点位于5个抗原表位。南京株2016年后抗原表位A区有氨基酸位点改变。结论 2014—2017年南京地区分离的诺如病毒GⅡ.Pe-GⅡ.4基因型流行株氨基酸同源性较高,但仍呈现出随时间迁移某些抗原位点的氨基酸改变,应持续观察其进化趋势。     

江苏省近期急性胃肠炎暴发中诺如病毒分子特征分析

目的 了解江苏省胃肠炎暴发疫情中诺如病毒(NoV)感染状况,并对其病原分子流行病学特征进行初步研究.方法 收集江苏省2012年10月至2013年3月7起胃肠炎暴发疫情患者肛拭子标本共67份,采用实时荧光RT-PCR定性检测,NoV阳性标本用RT-PCR扩增其聚合酶区及VP1区基因片段进-步测序分型.结果 7起疫情均为NoV感染引起的暴发,检测阳性率为67.2％(45/67).全部45株阳性毒株序列分析表明7起疫情中除-起是由GⅡ.3型感染引起外,其余6起均由新GⅡ.4感染引起,其中38株毒株与2012年澳大利亚参考株GⅡ.4/Sydney株同源性均在99％以上.进-步对6株新型Sydney变异株的衣壳蛋白VP1区扩增测序,并与9株近年流行株的VP1区氨基酸序列比对,发现该6株毒株的VP1区部分氨基酸已出现突变,而氨基酸位点的突变是与病毒抗原性密切相关.结论 江苏省7起疫情暴发聚集且感染毒株型别单-,说明已出现新NoV变异株,其原型株GⅡ.4/Sydney已在国外多地引起暴发和流行,提示该毒株将是今后防控监测的重点.     

GⅠ和GⅡ型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测

目的 建立应用Allglo探针同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重荧光反转录\聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法 设计针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒开放阅读框架ORF1及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系;对该方法的特异性、抗干扰性、灵敏度进行评估,对96份临床粪便标本进行检测、测序分析.结果 该方法特异性强,与轮状病毒、扎如病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应;同一体系下GⅠ或GⅢ型诺如病毒相互之间没有干扰;最低检测限均为10 copies/μL;对96份临床粪便标本进行检测,结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100％,且测序结果显示目标序列正确.结论 本研究建立的Allglo探针法检测GⅠ和G Ⅱ型诺如病毒技术特异性好,灵敏度高,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查.     

南宁市婴幼儿散发性腹泻中诺如病毒基因Ⅱ组4型变异株的流行特征

目的了解南宁市婴幼儿散发性腹泻病例中诺如病毒(Norovirus,NV)基因Ⅱ组(GenogroupⅡ,GⅡ)4型变异株的组成和流行特点。方法采集2010年1月~2011年12月南宁市某医院门诊354例婴幼儿腹泻病例的粪便标本,应用实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测NV核酸及其基因组,阳性标本进行核苷酸序列测定和遗传进化分析。结果 354份标本中,NV核酸检测阳性101份,阳性率28.5%,全部属于GⅡ。对测序成功的84株NV的核苷酸序列进行分析,77.4%属于GⅡ.4型(65株),其余为GⅡ.2型(7株)、GⅡ.14型(4株)、GⅡ.7型(3株)、GⅡ.3型(2株)、GⅡ.6型(2株)和GⅡ.12型(1株)。65株GⅡ.4型中,60株(92.3%)为2006b变异株,5株(7.7%)为2010变异株。结论 GⅡ.4型是南宁市婴幼儿中NV所致散发性腹泻的最主要基因型,其中2006b变异株占优势。首次在本地区检测到2010变异株,且该毒株的流行呈上升趋势。有必要加强监测,以及时掌握GⅡ.4型变异株的流行变迁。     

北京市市售花蛤诺如病毒和轮状病毒检出情况及基因特征分析

目的 了解北京市市售花蛤诺如病毒和轮状病毒检出情况,分析其基因特征.方法 2014年11月-2015年10月,采集北京市三个水产品销售市场新鲜花蛤各24件.用两种方法对花蛤鳃和肠内容物进行病毒浓缩,提取核酸后用实时荧光RT-PCR法检测诺如病毒GⅠ/GⅡ组和A组轮状病毒核酸.用半巢式RT-PCR方法,扩增诺如病毒阳性样...     

广东省某农村学校因生活用井水被GⅡ-4型诺如病毒污染引起胃肠炎暴发调查

目的通过对1起农村学校诺如病毒感染引起的胃肠炎暴发调查,分析感染传播途径,为农村及集体单位饮用水管理提供依据。方法采用主动搜索、问卷调查等方法对2009年9月广东省某农村中学急性胃肠炎暴发进行调查,采用描述性流行病学方法进行分析;采集病例肛拭子、井水及自来水用RT-PCR方法进行诺如病毒核酸检测和测序分析。结果广东省某农村学校胃肠炎暴发的指示病例发病时间为2009年9月4日,疫情历时8d,共搜索到病例108例,罹患率1.8%(108/5854);病例以学生为主(占85.2%,92/108),另有15名教师及1名校门卫发病;临床症状主要表现为腹泻(99.1%,107/108)、腹痛(82.4%,89/108)和呕吐(72.2%,78/108),82名病例病程中位数2d(P25～P75为2～3d),无住院病例;病例在班级及宿舍分布未见明显空间聚集性;学生是否在学生食堂就餐罹患率分别为1.7%(90/5418)、3.0%(2/66),教师是否在教师食堂就餐罹患率分别为7.7%(11/143)、3.5%(5/142),学生及教师有无在学校就餐罹患率差异无统计学意义(χ2=0.1、1.6,P﹥0.05);生活使用井水人群罹患率(2.0%,47/2324)是使用自来水人群罹患率(1.0%,14/1367)的2倍(RR=2.0,95%CI1.1～3.6)。采集9份现症病例肛拭子标本进行诺如病毒核酸RT-PCR检测,6份标本呈阳性;采集消毒前井水及井水末梢水各1份和自来水1份,其中2份井水诺如病毒核酸检测均呈阳性,自来水诺如病毒核酸检测为阴性。选取3份肛拭子阳性标本和1份井水进行序列测定,4份标本核酸相似性为100%,经与GenBank进行BLAST比较属于诺如病毒GⅡ-4群。结论广东省某农村学校发生1起GⅡ-4型诺如病毒感染的胃肠炎暴发,主要传播途径是因生活使用的井水受到诺如病毒污染,加强农村及集体单位饮用水管理是当前各级政府及相关部门重中之重工作。     

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒

目的建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法。方法设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系。引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒。将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测。结果显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测。灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒。利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价。结果表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好。结论本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测。     

海岛地区腹泻病例中诺如病毒基因序列分析

目的了解海岛地区病毒性腹泻病原中诺如病毒的流行状况,对优势流行株进行基因序列分析。方法对舟山市监测医院疑似病毒性腹泻粪便样本经酶联免疫吸附法(ELISA)筛选轮状病毒,对阴性样本采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增诺如病毒RNA聚合酶与主要衣壳蛋白基因,PCR扩增产物进行测序反应,序列结果与GenBank已公布的序列进行比对,测其同源性;并绘制成系统发生树进行进化分析。结果在35份诺如病毒扩增阳性样本中挑选病毒载量最高的Hu/Zhejiang/9/2006/CHN株进行测序,并与Hunter株、Farming Hill株等进行比对并绘制系统发生树。Hu/Zhejiang/9/2006/CHN株属于诺如病毒GⅡ-4群,与Hunter株和Lanzhou株形成的分支较接近,RNA聚合酶有部分序列与这2株完全相同。结论舟山市(海岛地区)病毒性腹泻病原中存在诺如GⅡ-4群,采用GDD基序分析有利于更好地发现新的变异株的存在,为病毒性腹泻的病原学和基因学研究提供依据。