利用2-DE和MALDI-TOP-MS在人大肠癌高低转移潜能细胞株中筛选转移相关蛋白

目的:分析比较人大肠癌不同转移潜能细胞株的差异表达蛋白质图谱,筛选并探讨肿瘤转移相关蛋白与大肠癌发生发展转移的关系。方法:利用双向凝胶电泳(2-DE)联合基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱(MALDI- TOF-MS)技术,分析人大肠癌高转移性细胞株SW620和低转移性细胞株SW480差异表达蛋白质图谱,查询数据库筛选可能的大肠癌转移相关蛋白质并进行免疫组化和Western免疫印迹验证。结果:MalenieⅢ软件分析结果显示2-DE图谱重复性、匹配性较好。两种细胞株有25个蛋白点差异表达(SW620 14个,SW480 11个),经质谱分析及数据库查询鉴定有9个蛋白可能与转移相关。其中AnnexinⅠ、β-半乳糖苷结合蛋白1、钙调蛋白、主要组织相容性复合物Ⅱ类抗原、cofilin、超氧化物歧化酶和Rab相关GTP结合蛋白仅在SW480中表达,可能对大肠癌转移起抑制作用;而人硫氧还蛋白、泛素偶联酶仅在SW620中表达,可能对大肠癌转移起促进作用。选择其中感兴趣的AnnexinⅠ进行验证,其在细胞株的表达结果与2-DE一致。AnnexinⅠ在大肠正常组织不表达,在大肠癌无转移组和转移组中表达上调,三组表达差异...     

两种大肠癌转移性细胞株双向电泳图谱的初步分析

目的 初步分析大肠癌转移过程中差异表达的蛋白质,为阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 以一对来自同一亲本、转移能力不同的人大肠癌细胞株SW620和SW480为实验对象,利用双向电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE),建立并优化两种细胞株的蛋白表达图谱;之后利用Melanieш软件分析与大肠癌转移相关的差异表达蛋白点。结果 两种细胞株的2-DE蛋白表达谱具有良好的重复性和可比性;采用了非线性pH3-10及重叠窄范围的固相pH梯度胶条,提高了2-DE图谱的分辨率;初步选择11个差异表达蛋白点。结论 非线性及重叠窄范围的固相pH梯度胶条可改善2-DE中蛋白分离的效果,初步分离的差异蛋白点为进一步鉴定大肠癌转移相关蛋白及建立大肠癌转移性细胞株的2-DE数据库奠定了基础。     

结肠癌不同转移潜能细胞株SW620及SW480的代谢组学研究

目的：分析不同转移潜能结肠癌细胞株的代谢模式,筛选并探讨差异代谢物与结肠癌转移的关系。方法：利用1H NMR技术,采用PLS-DA模型分析高转移潜能SW620和低转移潜能SW480细胞株的代谢模式,并定量差异表达代谢物。利用Seahorse能量代谢仪分析,进一步探讨代谢能力。结果：不同转移潜能的2株结肠癌细胞的代谢模式能够在第一主成分上明显分开。与原发灶结肠癌细胞SW480相比,具有高转移潜能的SW620细胞中乳酸、琥珀酸、异亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸水平较高（P＜0.05）,乙酸、氧化磷酸胆碱、ATP、肌苷和牛磺酸水平较低（P＜0.05）。转移潜能高的SW620细胞具有更高的糖酵解水平、TCA循环活性、细胞外酸化率和线粒体耗氧率水平。结论：不同转移潜能结肠癌细胞株SW480/SW620的代谢模式具有显著差异,与SW480细胞相比,SW620具有较高的代谢基础潜能,提示其高转移能力的能量需要,也能更快适应其所在微环境,证明转移过程的发生与代谢密切相关。     

两种大肠癌转移性细胞株双向电泳图谱的初步分析

目的初步分析大肠癌转移过程中差异表达的蛋白质．为阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法以一对来自同一亲本．转移能力不同的人大肠癌细胞株SW620和SW480为实验对象．利用双向电泳技术(two—dimensional gel electrophoresis，2-DE)，建立并优化两种细胞株的蛋白表达图谱；之后利用Melanie ш软件分析与大肠癌转移相关的差异表达蛋白点。结果两种细胞株的2-DE蛋白表达谱具有良好的重复性和可比性；采用了非线性pH3—10及重叠窄范围的固相pH梯度胶条，提高了2-DE图谱的分辨率；初步选择11个差异表达蛋白点。结论非线性及重叠窄范围的固相pH梯度胶条可改善2-DE中蛋白分离的效果，初步分离的差异蛋白点为进一步鉴定大肠癌转移相关蛋白及建立大肠癌转移性细朐株的2-DE数据库奠定了基础．     

高低转移人大肠癌细胞系基因表达谱差异

目的 用自制肿瘤转移相关基因cDNA微阵列研究人大肠癌高转移细胞系Lovo、SW620及低转移细胞系SW480、LS174T的基因表达谱差异,筛选与大肠癌转移相关的特异基因。方法 分别提取4种大肠癌细胞系及对照的正常大肠上皮组织的mRNA,逆转录成cDNA探针,经cy3和cy5标记后分别与含有399个肿瘤转移相关基因的微阵列杂交,用专用软件分析杂交信号强度。结果 高转移细胞系与低转移细胞系的基因表达谱有显著差异,其中有104个基因的表达值有意义,包括上调基因44个、下调基因60个。结论 大肠癌转移是由其发生过程中多个基因表达的复杂变化决定的,高转移细胞系与低转移细胞系比较存在差异的基因可能与高转移特性有关。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的 了解大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)线粒体DNA的突变,克隆突变的大肠癌线粒体DNA(mtDNA)基因,构建pcDNA3.I(+)-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞,以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法 提取大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)mtDNA,扩增D-LOOP区,产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果 检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD-LOOP区至表达质粒pcDNA3.1(+),并导入NIH3T3细胞中。结论 线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在大肠癌细胞株中突变率较高。     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因,为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术,以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象,构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行差异筛选,对所得的差异片段进行测序和同源性分析,利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减文库分别含有235和232个白色克隆,90%以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选。共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因,GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

MicroRNA-499—5p通过靶向FOX04和PDCD4促进大肠癌细胞侵袭和肿瘤转移

MitroRNAs（miRNAs）通过过直接与靶分子的信使RNA（mRNA）相互作用，调节肿瘤的演进与侵袭。我们运用来自大肠癌患者原发病灶的低转移潜能细胞系SW480和来自同一患暂一年后转移淋巴结组织的高转移潜能细胞系SW620鉴定出参与肿瘤转移的miRNA分子，SW480和SW620细胞系是已经过验证的研究大肠癌转移的很好的体外模型。     

可视化观察Tiam-1基因沉默对人大肠癌细胞株SW480转移的影响

目的 应用整体可视化成像技术观察Tiam-1基因沉默对人大肠癌细胞株SW480转移特性的影响.方法 将绿色增强荧光蛋白(EGFP)标记的人大肠癌细胞株SW480/EGFP 与SW480/EGFP /Tiam-1-经裸鼠尾静脉注射和结肠原位接种,分别建立可视化转移动物模型,比较两种细胞株成瘤与转移特性的差别.结果 SW480/EGFP 与SW480/EGFP /Tiam-1-细胞均稳定表达EGFP;SW480/EGFP /Tiam-1-的Tiaml基因干扰率达70%;SW480/EGFP /Tiam-1和SW480/EGFP 比较体外增殖能力无显著差异(P＞0.05),但体内增殖能力差异显著(P＜0.05);SW480/EGFP /Tiam-1转移率明显降低.结论 Tiaml基因可能在人大肠癌侵袭转移中发挥重要作用.     

海马注射淀粉样蛋白β大鼠与正常大鼠脑蛋白质组双向电泳图谱比较

目的 比较海马注射淀粉样蛋白β(Aβ)大鼠与正常大鼠脑蛋白质组双向电泳(2-DE)图谱差异,从蛋白质水平初步探索阿尔茨海默病(AD)发病机制。方法 以固相pH梯度等电聚焦为第1向,SDS-PAGE垂直电泳为第2向进行2-DE。以图像分析软件ImageMaster 2D-Elite分析电泳图谱。结果 海马注射Aβ大鼠与正常大鼠脑组织2-DE图谱分别检出496和491个蛋白点。对2张电泳图进行匹配后,发现有11个蛋白点仅在海马注射Aβ大鼠脑蛋白2-DE图谱中表达,而有6个蛋白点只在正常对照大鼠检测到。部分蛋白在2组大鼠脑组织中含量发生了明显变化。结论 初步建立了AD动物模型比较蛋白质组学的技术方法;差异点的发现为深入理解AD发病机制及研发新药提供了有益的线索。     

靶向抑制存活素基因对大肠癌细胞SW80侵袭和转移的实验研究

目的 构建靶向存活素(survivin)基因的短发夹干扰RNA(shRNA)表达载体,导入人大肠癌细胞SW480中,研究靶向抑制survivin基因对SW480细胞侵袭和转移的影响.方法 根据siRNA设计原则,在survivin序列中选取设计含19个核苷酸(19 nt)的靶序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制survivin基因的sihNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin;采用Lipofectamine 2000TM转染试剂将干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-survivin导入到大肠癌细胞SW480中;用Western blotting从蛋白水平检测干扰效果;分别采用肿瘤侵袭粘附实验和明胶酶谱分析法检测pRNAT-U6.1/Neo-survivin对SW480细胞的侵袭和转移潜能的影响.结果 Survivin基因的蛋白表达均得到显著抑制;沉默SW480的survivin基因可以显著抑制SW480细胞的侵袭和转移潜能,而且survivin基因表达被抑制后,SW480细胞分泌基质金属蛋白酶明显减少.结论 Survivin基因可能在SW480的侵袭和转移潜能中起重要作用,沉默SW480的survivin基因可以显著抑制其侵袭、转移和基质金属蛋白酶分泌,因而survivin影响SW480的侵袭和转移可能与调控基质金属蛋白酶分泌密切相关.     

环氧化酶2基因异常表达与大肠癌转移的关系

目的 研究环氧化酶2在人大肠癌细胞系及大肠癌组织中的异常表达与意义。方法 培养不同转移能力的人大肠癌细胞系SW480和SW620细胞，收集50例大肠癌石蜡组织，50例淋巴结转移性大肠癌石蜡组织：分别用免疫组织化学、Real-time PCR的方法研究环氧化酶2在不同转移能力人大肠癌细胞系及原发人大肠癌组织和大肠淋巴结转移组织中的表达。结果 环氧化酶2蛋白在SW480和SW620细胞株中均阳性表达；环氧化酶2mRNA在SW620比SW480细胞中表达增高，表达量的平均倍比关系为2．268。环氧化酶2蛋白在淋巴结转移癌组的异常表达高于原发大肠癌石蜡组织，相关性具有统计学意义（P〈0．05）。结论 环氧化酶2异常表达可能与大肠癌淋巴结转移相关。     

具有肝转移倾向的结肠癌细胞亚系的筛选与鉴定

目的 筛选人结肠癌SW480细胞中具有特定肝脏转移倾向的亚克隆,比较它与母系生物学特性的差异,为结肠癌肝转移机制的研究提供基本的实验材料.方法 采用外科原位接种、组织块细胞培养法从裸鼠体内获得SW480细胞系中具有肝脏转移倾向的亚克隆SW480/M5;体内体外实验验证它与母系细胞在生物学特性上的差异.结果 体内实验证明SW480具有广泛转移的潜能,而SW480/M5细胞只具有向肝脏转移的潜能;SW480/M5细胞原位瘤的质量较SW480细胞大且皮下瘤生长速度较快:体外实验证明SW480/M5细胞的克隆形成能力,体外增殖能力、体外运动及侵袭能力较SW480细胞强,而对FN的粘附能力较SW480细胞弱.结论 从结肠癌细胞系SW480中筛选出的细胞亚系SW480/M5转移方向明确,是结肠癌肝转移机制研究的理想细胞模型.     

高低转移人大肠癌细胞系基因表达谱差异

目的 用自制肿瘤转移相关基因cDNA微阵列研究人大肠癌高转移细胞系Lovo、SW620及低转移细胞系SW480、LS174T的基因表达谱差异，筛选与大肠癌转移相关的特异基因。方法 分别提取4种大肠癌细胞系及对照的正常大肠上皮组织的mRNA，逆转录成cDNA探针，经cy3和cy5标记后分别与含有399个肿瘤转移相关基因的微阵列杂交．用专用软件分析杂交信号强度。结果 高转移细胞系与低转移细胞系的基因表达谱有显著差异，其中有104个基因的表达值有意义，包括上调基因44个、下调基因60个。结论 大肠癌转移是由其发生过程中多个基因表达的复杂变化决定的，高转移细胞系与低转移细胞系比较存在差异的基因可能与高转移特性有关。     

热休克蛋白27在大肠癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

目的 探讨热休克蛋白27(HSP27)表达与大肠癌淋巴结转移的关系.方法 应用免疫组化方法检测68例临床大肠癌组织标本中Hsp27的表达情况.应用RT-PCR、Western blotting和免疫组化方法检测不同转移潜能大肠癌细胞株中Hsp27 mRNA和蛋白的表达情况.结果 在大肠癌组织中,热休克蛋白27的表达率与年龄、性别、淋巴结转移、临床分期无相关性(χ2test,P＞0.05),但其过表达和大肠癌淋巴结转移显著负相关(Fisher's exact test,P=0.035).应用RT-PCR、Western blotting和免疫组化方法检测结果显示Hsp27基因和蛋白在高淋巴结转移潜能的SW620细胞中呈低表达,在低淋巴结转移潜能的SW480细胞中呈高表达.结论 Hsp27和大肠癌肿瘤细胞的转移行为可能为负相关,可能在阻止其转移中发挥重要作用.