过表达prohibitin促进NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡

目的构建人prohibitin基因真核过表达载体,探讨上调prohibitin对NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡的影响。方法 PCR钓取目的基因prohibitin,与pEGFP-N1-3FLAG真核载体定向连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将阳性重组载体pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin转染NB4-R1细胞,以实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测过表达效果,annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测prohibitin过表达对NB4-R1细胞凋亡的影响。结果 PCR筛选及测序比对,证明成功构建了prohibitin基因过表达载体;对NB4-R1细胞转染率可达70%以上;qRT-PCR结果显示转染pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin过表达载体组(OE)prohibitin mRNA表达水平较空白对照组(CON)和阴性对照组(NC)分别上调(1.64±0.37)倍和(1.58±0.43)倍(P0.05),Western blot结果显示OE组prohibitin蛋白表达水平较CON组和NC组分别上调(1.91±0.33)倍和(1.99±0.37)倍(P0.05);流式细胞术结果表明CON组、NC组和OE组NB4-R1细胞凋亡率分别为(5.88±0.43)%、(6.63±0.46)%和(28.22±1.33)%,OE组较CON组和NC组细胞凋亡率分别增加了(3.80±0.24)倍和(3.39±0.30)倍(P0.05)。结论过表达prohibitin可诱导NB4-R1细胞凋亡。     

PI3K / Akt / mTOR 信号通路介导的N822K 突变对c-KIT 抑制剂诱导的AML 细胞凋亡的影响

目的:研究c-KIT N822K 突变对c-KIT 抑制剂诱导AML 细胞凋亡的影响,并初步探讨相关的分子机制。方法:以c-KIT N822K 突变的Kasumi-1 细胞为实验组,以HL-60、NB4 细胞为非c-KIT N822K 突变的对照组,分别用0、0.04、0.16、0.64 μmol/ L 的c-KIT 抑制剂舒尼替尼处理这三株AML 细胞24 h 后收集细胞,采用Western blot 检测凋亡相关蛋白和PI3K/ Akt/ mTOR 通路蛋白水平,比较各组细胞相关信号通路蛋白的变化。结果:随着舒尼替尼浓度的增加,HL-60 及NB4 细胞中Bax 及CytoC、Caspase-9、Actived-Caspase-3、PARP 蛋白剪切体等促凋亡相关蛋白表达均上调(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达均下调(P<0.01),在具有N822K 突变的Kasumi-1 细胞中这一变化趋势则明显减弱;Kasumi-1 细胞中c-myc 蛋白及PI3K、Akt、4EBP1、mTOR 等PI3K/ Akt/ mTOR 通路蛋白的磷酸化水平均出现剂量依赖性下调(P<0.05),而HL-60 细胞和NB4 细胞则无此变化。结论:N822K 突变引起的c-KIT 结构性激活可影响c-KIT 抑制剂舒尼替尼对Kasumi-1 细胞的凋亡诱导作用,其机制可能与PI3K/ Akt/ mTOR 通路抑制有关。     

胶球藻多糖对RAW264.7细胞凋亡的影响

目的探讨胶球藻多糖对RAW264.7细胞凋亡的影响及其可能机制。方法培养RAW264.7细胞,分为对照组、胶球藻多糖(2mg/ml)组及胶球藻多糖(4mg/ml)组;利用流式细胞仪检测各实验组中细胞的凋亡率;采用Western blot检测各实验组中凋亡相关因子Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xl及Caspase-3蛋白的表达。结果相较于对照组,胶球藻多糖处理组不仅可以诱导RAW264.7细胞发生凋亡,增加促凋亡蛋白(Bad,Bax)的表达及减少抗凋亡蛋白(Bcl-2, Bcl-xl)的表达,而且还能上调剪切型Caspase-3蛋白的水平,且均呈剂量依赖性。结论胶球藻多糖显著促进RAW264.7细胞发生凋亡,其机制可能与Bad、Bax表达上调,Bcl-2、Bcl-xl表达下调及Caspase-3的激活有关。     

肠道病毒71型诱导Bax依赖的细胞凋亡

目的研究肠道病毒71型（EV71）诱导细胞凋亡的分子机制。方法采用CCK8比色法检测EVT1感染对于人横纹肌肉瘤细胞RD增殖的影响,通过Hoechst33342染色和Caspase3活性测定检测细胞凋亡特征,用WesternBlot方法检测凋亡相关蛋白Caspase3和8的激活。同时通过免疫共沉淀检测EV71感染后细胞内Bax的活化。结果EV71感染RD细胞可以明显抑制细胞增殖,引起Caspase3、8和PARP蛋白的激活,同时引起Bax蛋白表达增加并发生构象变化。结论EV71通过Bax构象变化诱导Caspase依赖的细胞凋亡。     

microRNA-25在脑缺血/再灌注损伤诱导的细胞凋亡过程中的作用

目的 在体外培养的SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞中,观察microRNA-25（miR-25）对缺血/再灌注（I/R）损伤诱导的细胞凋亡的作用及其可能机制。方法 在体外培养的人SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞中,用氧葡萄糖剥夺/再恢复（OGDR）模拟脑缺血/再灌注损伤。合成miR-25过表达片段,并构建慢病毒载体质粒,用脂质体将载体质粒转导入细胞中。MTT法检测细胞活力、TUNEL法检测凋亡、RT-PCR、Real-time PCR和Western blotting分别检测目的基因mRNA和蛋白的表达情况。 结果 与正常培养组相比,OGDR组中细胞内miR-25表达下调,细胞活力明显下降,凋亡明显增多,同时Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达上调,Bcl-2 mRNA和蛋白表达下调（n=3,P<0.05）;而与OGDR组相比,过表达miR-25组内细胞活力明显升高,凋亡明显减少,同时Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达下降Bcl-2 mRNA和蛋白表达升高（n=3,P<0.05）。结论 I/R损伤后miR-25表达上调可能通过Bax/Bcl-2-Caspase-3途径进而抑制I/R损伤诱导的凋亡,为I/R损伤的临床治疗提供潜在的治疗靶点。     

脑室注射链脲佐菌素对大鼠海马神经元凋亡相关蛋白表达的影响

目的 观察App17肽对脑室注射链脲佐菌素的大鼠海马神经元凋亡相关蛋白表达的影响,探讨胰岛素信号转导通路障碍对神经元存活的作用.方法脑室注射链脲佐菌素(STZ)制作大鼠痴呆模型.3周后,皮下注射App17肽.4周后取脑组织做Bcl-2、Bax、CytoC免疫组织化学染色及Western blotting半定量分析.结果 模型组大鼠海马内Bax、CytoC阳性反应神经元细胞数目多,胞质深染,细胞计数与正常组及治疗组有显著性差异(P＜0.01);模型组大鼠海马内Bcl-2阳性细胞数目少,胞质染色淡,细胞计数与正常组及治疗组有显著性差异(P＜0.01).Western blotting半定量分析可见、Bcl-2、Bax、CytoC出现清晰的条带,组间可见较明显的差异(P＜0.01).结论 脑室注射STZ的大鼠海马内促进凋亡的Bax、CytoC表达增加;抑制凋亡的Bcl-2表达降低.App17肽可影响上述蛋白的表达,使之接近正常.胰岛素信号转导通路对神经元存活有一定作用.     

scFvCD20:sTRAIL蛋白诱导BJAB细胞凋亡的实验研究

研究融合蛋白scFvCD20:sTRAIL诱导B淋巴瘤细胞BJAB凋亡的发生以及凋亡相关蛋白的表达变化。采用PCR、重叠PCR、酶切、连接等方法构建pLentiR.scFvCD20:sTRAIL、pLentiR.ISZ-sTRAIL、pLentiR.scFvCD20及pLentiR.CopGFP慢病毒表达载体,瞬时转染293T细胞获得含有scFvCD20:sTRAIL融合蛋白的细胞培养上清,采用CCK8细胞增殖抑制实验检测scFvCD20:sTRAIL融合蛋白对CD20阳性BJAB细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其对BJAB细胞诱导凋亡,Western blotting检测凋亡过程中内源性及外源性凋亡信号传导途径相关蛋白的变化。结果显示,成功构建了慢病毒表达载体pLentiR.scFvCD20:sTRAIL、pLentiR.ISZ-sTRAIL、pLentiR.scFvCD20及pLentiR.CopGFP,瞬时转染293T细胞后并可获得融合蛋白的表达。与ISZ-sTRAIL比较,融合蛋白scFvCD20:sTRAIL可不同程度地提高对CD20阳性BJAB细胞的生长抑制作用,凋亡细胞增多,其中Bcl-2表达下降、Bax表达升高,Caspase 8、Caspase 9、Caspase 3及PARP被特异性剪切活化。研究表明,融合蛋白scFvCD20:sTRAIL可诱导BJAB细胞凋亡,与bcl-2/bax的表达变化以及Caspase的剪切活化有关。     

GeXP 检测rhIL-24 联合DDP 对人肺腺癌A549 / DDP 细胞凋亡相关基因的实验研究

目的:利用多基因遗传表达分析系统(GeXP)探讨重组人白细胞介素-24(rhIL-24)联合顺铂(DDP)诱导人肺腺癌顺铂耐药株A549/ DDP 细胞6 个凋亡相关基因的变化。方法:用rhIL-24、DDP 及rhIL-24+DDP 干预A549/ DDP 细胞,应用多基因遗传表达分析系统(GeXP)同时检测Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、Rb 与P53 等6 个凋亡相关基因。结果:rhIL-24 蛋白可引起A549/ DDP 细胞Bax 基因、Caspase3 基因、Rb 基因转录上调;Bcl-2 基因、Survivin 基因转录下调,但抑癌基因P53 变化无规律,rhIL-24 联合DDP 后Bax、Survivin、Rb 表达较单独rhIL-24 组变化更加显著。结论:rhIL-24 蛋白可通过上调Bax,下调Bcl-2、Survivin,激活Caspase3,上调抑癌基因Rb 诱导人肺腺癌A549/ DDP 细胞凋亡。     

下调NCAPG表达对Burkitt淋巴瘤Raji细胞的影响及其机制

目的 探讨下调Burkitt淋巴瘤Raji细胞NCAPG表达对细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法 应用shR-NCAPG慢病毒载体转染Raji细胞,qRT-PCR及Western blot验证细胞中NCAPG表达是否下调。应用CCK-8方法检测shR-NCAPG对Raji细胞增殖的影响,流式细胞术Annexin V-PE/7AAD双染检测细胞凋亡。Western blot法检测shR-NCAPG转染前后Bcl-2和Bax的表达变化。结果 shR-NCAPG转染Raji细胞后,NCAPG在基因及蛋白水平表达减少,明显抑制Raji细胞的增殖,增加细胞早期凋亡比例,抑制Bcl-2表达,上调Bax表达。结论 下调NCAPG表达抑制Burkitt淋巴瘤细胞Raji增殖诱导其凋亡,与Bcl-2家族蛋白相关。     

过表达Rip2对人胰腺癌细胞Panc-1凋亡的影响

目的:观察受体相互作用蛋白2(Rip2)对人胰腺癌细胞Panc-1凋亡的影响。方法:采用Jet PRIME试剂分别将pEGFP-C2和pEGFP-Rip2质粒转染入Panc-1细胞,实验分为对照组、pEGFP-C2组和pEGFP-Rip2组。转染后培养细胞48 h,采用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞Rip2水平及凋亡相关蛋白Bax、胞浆细胞色素c(Cyt-c)和Bcl-2蛋白表达;比色法检测细胞caspase-3的活性。结果:转染pEGFP-Rip2细胞Rip2蛋白表达明显增加。流式细胞术检测表明,p EGFP-Rip2组的细胞凋亡率明显高于对照组和pEGFP-C2组。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-Rip2组的Bax和胞浆Cyt-c蛋白表达明显升高,而Bcl-2蛋白水平则显著降低。并且,pEGFP-Rip2组细胞caspase-3活性明显高于对照组和pEGFP-C2组。结论:过表达Rip2能诱导Panc-1细胞凋亡,其作用机制可能与Rip2上调Bax以及胞浆Cyt-c蛋白表达,下调Bcl-2蛋白水平,增加caspase-3活性,从而激活内源性凋亡途径有关。     

Apoptotic effect of mtrix metalloproteinases 9 in the development of diabetic retinopathy

Objective: To explore the potential regulatory mechanism of MMP9 in the development of DR. Methods: Plasmids pcDNA-MMP9 and pcDNA-Ang2 were transfected into primary rat retinal Müller cells (RMCs) using Lipofectamine 2000. Cell viability and apoptosis were respectively determined by MTT assay and flow cytometry. Moreover, the interaction between MMP9 and Ang2 was explored. Besides, RMCs were treated with MMP-9 under normal glucose and high glucose condition for 2d. Besides, the expression levels of apoptotic proteins, like MMP9, Ang2, Bax2, Bcl2, cleaved PARP and cleaved caspase3 were determined by Western blot. Results: The cell viability of siRNA-MMP9 group was significantly increased while decreased in MMP9 overexpression group when compared to control group, respectively. The apoptotic cells in MMP9 overexpression group significantly increased while decreased in siRNA-MMP9 group when compared with control group. MMP9 expression was significantly regulated by Ang2 whereas no significant changes occurred in Ang2 expression when MMP9 expression changed. Moreover, MMP9 expression in HG group significantly increased while there were no significant differences between NG group and control group. Besides, the expression of Bax2, Bcl2, cleaved PARP and cleaved caspase3 in HG group increased while there were no significant differences between NG group and control group. Conclusion: Our findings indicate that MMP9 may play an important role via inducing cell apoptosis in the development of DR via regulating by Ang2 or targeting apoptotic proteins, such as Bax2, Bcl2, cleaved PARP and cleaved caspase3.     

过表达PGRN抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤

目的:探讨颗粒体蛋白前体(progranulin,PGRN)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺泡上皮A549细胞和HPAEpi C细胞增殖、凋亡及炎症的影响。方法:实验分为4组:对照(control)组为正常培养的细胞;LPS组用LPS(10 mg/L)处理;PGRN+LPS组在转染pc DNA3.1-PGRN质粒后加入LPS处理;pc DNA3.1+LPS组在转染pc DNA3.1-EGFP质粒后加入LPS处理。MTT试剂盒检测细胞活力;Brd U掺入实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-q PCR和Western blot分别检测PGRN的mRNA和蛋白表达;Western blot检测caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p65和p-IκB-α的蛋白水平。结果:与对照组相比,LPS组的细胞增殖率下降(P0.05),凋亡率上升(P0.05),caspase-3和Bax的蛋白表达上调(P0.05),Bcl-2的蛋白表达下调(P0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达上调(P0.05),p65和p-IκB-α的蛋白水平增加(P0.05),与LPS组相比,PGRN+LPS组的细胞增殖率上升(P0.05),凋亡率下降(P0.05),caspase-3和Bax的蛋白表达下调(P0.05),Bcl-2的蛋白表达上调(P0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达下调(P0.05),p65和p-IκB-α的蛋白水平降低(P0.05)。结论:PGRN过表达可以减轻LPS诱导的A549细胞和HPAEpi C细胞增殖、凋亡异常及炎症因子产生等损伤,这可能与PGRN参与调控NF-κB信号通路有关。     

依达拉奉通过microRNA-25抑制高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

目的:探讨依达拉奉通过微小RNA-25(microRNA-25,miR-25)对高糖诱导的人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法:将SH-SY5Y细胞用含高浓度葡萄糖的DMEM培养基和依达拉奉的联合培养液共同培养24 h。MTT比色法测定SH-SY5Y细胞存活率;DCFH-DA荧光探针法检测SH-SY5Y细胞中活性氧簇(ROS)的水平;采用流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡率;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平;实时定量PCR检测细胞中miR-25的表达水平。为进一步阐明依达拉奉抑制高糖诱导的神经细胞凋亡的作用靶点,我们将miR-25抑制剂应用于细胞,之后采用caspase-3凋亡试剂盒检测细胞的凋亡率。结果:与对照组相比,高糖诱导后细胞存活率明显降低,细胞中的ROS水平和细胞凋亡率明显升高,Bax的表达明显增加,Bcl-2的表达明显降低,miR-25的表达水平也明显降低。给予依达拉奉治疗之后,细胞存活率明显升高,ROS含量和细胞凋亡率明显降低,Bax的蛋白水平明显降低,Bcl-2蛋白水平明显升高,miR-25的表达水平亦明显升高。进一步给予miR-25抑制剂后,caspase-3的水平明显升高,此时同时给予依达拉奉后并不能抑制高糖引起的神经细胞的凋亡。结论:依达拉奉对高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用,其作用靶点可能是miR-25。     

独蒜兰乙酸乙酯萃取物通过内源性线粒体通路诱导白血病K562细胞和HL-60细胞凋亡

目的:探讨独蒜兰乙酸乙酯萃取物对人慢性粒细胞白血病K562细胞和急性髓性白血病HL-60细胞增殖及凋亡的影响以及诱导凋亡的途径。方法:采用XTT法、台盼蓝拒染法、Annexin V-FITC/PI双染法、PI染色法、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和Western blot法研究不同浓度独蒜兰乙酸乙酯萃取物对上述2种白血病细胞增殖、凋亡、细胞周期和凋亡相关蛋白表达等方面的影响。结果:独蒜兰正丁醇萃取物对K562细胞活力几乎没有抑制作用,而乙酸乙酯萃取物能显著抑制K562和HL-60细胞的活力和增殖。乙酸乙酯萃取物对于HL-60细胞作用24 h的半数抑制浓度(IC_(50))为(42.14±2.54)mg/L,对于K562细胞的IC_(50)为(51.28±3.12)mg/L。Annexin V-FITC/PI和DAPI染色结果显示,乙酸乙酯萃取物呈剂量依赖性诱导2种细胞凋亡,且50 mg/L的乙酸乙酯萃取物作用后K562细胞的凋亡率为33.1%,而HL-60细胞的凋亡率为63.1%,说明HL-60细胞对乙酸乙酯萃取物更加敏感,伴有典型的细胞核凋亡形态学改变。PI染色结果显示HL-60细胞和K562细胞都被阻滞于G_2期。Western blot结果显示,随着药物浓度的升高,细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达降低,而促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和活化的多腺苷二磷酸核糖聚合酶的表达逐渐升高,内源性线粒体凋亡的特征胞浆中细胞色素C和凋亡诱导因子表达也逐渐升高。结论:独蒜兰乙酸乙酯萃取物能显著抑制K562和HL-60细胞增殖,并通过触发内源性线粒体凋亡通路诱导这2种细胞凋亡。     

Hsp90靶向抑制多肽P7与多西他赛联用对肺腺癌细胞系A549的协同抗肿瘤作用

目的研究热休克蛋白90(Hsp90)双功能靶向抑制多肽LPLTPLP(P7)与临床化疗药物多西他赛(DTX)联用对肺腺癌细胞系A549的影响。方法以DTX与P7单独或联合使用对A549细胞进行处理,48 h后,用CCK-8法评价细胞活性;通过流式细胞计量术检测DTX与P7单独或联合使用后的A549细胞凋亡率;用蛋白免疫印迹技术检测DTX与P7单独或联合使用对A549细胞凋亡以及耐药相关蛋白表达的影响。结果DTX与P7对细胞存活具有协同抑制作用;联合用药组细胞凋亡率为25.8%,显著高于DTX组(P<0.05);联合用药组凋亡相关蛋白Bcl-2、PARP显著下调(P<0.05);cleaved-PARP显著上调(P<0.05);耐药蛋白主要穹窿蛋白(MVP)显著下调(P<0.05)。结论DTX协同靶向性多肽P7能显著提高A549细胞的凋亡率,其机制可能与降低凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平、失活DNA修复酶PARP及降低耐药蛋白MVP表达有关。     

SREBP-2沉默抑制衣霉素诱导的软骨细胞内质网应激

目的:探究固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)对衣霉素诱导的软骨细胞内质网应激(ERS)的影响。方法:分离人正常软骨细胞和骨关节炎(OA)软骨细胞培养,衣霉素和SREBP-2 siRNA分别处理正常软骨细胞。24 h后,实时荧光定量PCR检测对微小RNA-185(miR-185)表达的影响,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,Western blot法检测对SREBP-2、CHOP、p-e IF2α和ATF4等ERS相关蛋白,Bcl-2、Bax和caspase-3等凋亡相关蛋白水平的影响;caspase-3活性试剂盒检测对细胞caspase-3活性的影响。结果:与对照组相比,OA组和衣霉素组SREBP-2表达增加,miR-185表达降低(P0.05)。SREBP-2 siRNA转染可明显阻断衣霉素引起的miR-185降低(P0.05)。miR-185过表达能够下调SREBP-2蛋白水平(P0.05)。与对照组相比,OA组和衣霉素组CHOP、pe IF2α和ATF4的蛋白水平明显上调,Bcl-2表达下调,Bax和caspase-3表达增加(P0.05);SREBP-2沉默处理则显著逆转上述蛋白表达(P0.05)。细胞凋亡率与上述细胞凋亡相关蛋白的变化趋势一致(P0.05)。与衣霉素组相比,SREBP-2 siRNA转染明显下调caspase-3活性,miR-185抑制则明显逆转上述作用(P0.05)。结论:SREBP-2沉默可通过上调miR-185抑制衣霉素诱导的软骨细胞ERS和细胞凋亡。     

补肾阴及补肾阳法对化疗诱导的卵巢早衰大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平及卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的:观察化疗诱导的卵巢早衰大鼠接受补肾阴法和补肾阳法干预后,其外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)水平及卵巢颗粒细胞凋亡情况。方法:48只雌性SD大鼠随机分成对照(control)组、环磷酰胺(CTX)组、环磷酰胺+补肾阴(CTX+kidney yin)组、环磷酰胺+补肾阳(CTX+kidney yang)组。ELISA法检测各组大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平;末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测卵巢颗粒细胞凋亡;Western blot法检测卵巢Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:CTX组大鼠外周血TNF-α、IFN-γ表达水平上升,卵巢颗粒细胞凋亡明显,卵巢中Bax蛋白明显增多,而Bcl-2蛋白明显减少。经本实验中补肾方药治疗后,外周血TNF-α、IFN-γ水平下降,颗粒细胞凋亡程度减轻,Bax蛋白减少,Bcl-2蛋白增多,部分指标变化以CTX+kidney yin组较为明显。结论:补肾阴及补肾阳法可通过调控颗粒细胞凋亡相关的Bax、Bcl-2蛋白及外周血TNF-α、IFN-γ的水平,抑制卵巢颗粒细胞凋亡,恢复卵巢功能、增强储备能力。