胶质细胞源性神经营养因子与脊髓再生

前　　言胶质细胞源性神经营养因子 (glial cell line- derivedneurotrophic factor,GDNF)是在 1993年由大鼠胶质瘤细胞系 B49中分离的糖基化的二硫键结合的同二聚体蛋白质 ,含有 134个氨基酸 ,分子量为 33～ 35 k D。因其具有 7个保守的半光氨酸残基 ,并且它们在分子出现的位置与转化生长因子- β(transform ing growth factor- β,TGF- β)超家族的全体成员均相同 ,所以 GDNF被认为是 TGF- β超家族的一员。人和大鼠的 GDNF基因业已被克隆 ,二者的氨基酸序列有 93%的同源性 [1 ] 。 GDNF的受体是多成分的复合物 ,它是由固定于质…     

胶质细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤具有高发生率、高致残率、高生存率、高消耗、青壮年多发等特点。其相关治疗的研究主要是从挽救神经元的迟发型损害和死亡，促进神经元的再生和组织移植替代等方面进行。由于哺乳动物中枢神经系统损伤后期内源性修复能力有限，所以细胞移植可能是更为可行的修复途径。目前细胞移植分为神经干细胞移植、胶质细胞移植、基因修饰的细胞移植等。胶质细胞通过广泛分布的凸起构成神经组织的支架，对神经元胞体和突起有支持作用。出生后保持一定的分裂能力．受到创伤刺激时进行分裂增殖，形成胶质瘢痕。星形胶质细胞一方面位于神经细胞的附近．另一方面附着于毛细血管的终足。参与物质运输和血脑屏障的形成。此外，星形胶质细胞可能在神经元生成、突触网络形成、神经元电活动以及特异性神经系统疾病等过程中发挥着调控作用。基于上述理论．国内外进行了一系列胶质细胞移植修复脊髓损伤的实验研究．现就相关研究进展综述如下。     

星形胶质细胞转分化为神经元在神经再生中的研究进展

<正>星形胶质细胞是广泛存在于中枢神经系统内的一类胶质细胞,在建立和维持正常脑功能以及脑损伤后修复中具有重要作用。近几年发现,特定区域脑损伤后星形胶质细胞发生活化,甚至转分化为神经元谱系,表现出类似于神经前体细胞的特性,这一重要的潜能使得星形胶质细胞成为神经再生领域研究的焦点。本文就星形胶质细胞的基本特性、其转分化为神经元的模型以及介导转分化发生的细胞与分子学     

牙髓再生组织工程中的细胞共培养体系

背景：常规根管治疗去除所有牙髓组织会导致牙的生理功能和组织再生能力丧失,体外培养牙髓干细胞并使之形成牙髓样组织,再移植入髓腔内成为了理想的牙髓再生治疗方法。目的：汇总阐述通过共培养体系诱导牙髓干细胞形成牙髓样组织的研究进展,为牙髓组织再生的干细胞治疗方法提供思路。方法：第一作者于Pub Med、中国知网和万方数据库检索时限为2022年5月以前发表的相关文献。英文检索词为“dental pulp regeneration,dental pulp stem cell,co-culture,tissue engineering,signaling pathway”,中文检索词为“牙髓再生、牙髓干细胞、共培养、组织工程、支架、信号通路”,纳入67篇符合标准的文献进行总结阐述。结果与结论：（1）共培养体系由细胞主体和组合细胞通过不同的组合方式构成。（2）现阶段共培养体系组合方式可分为直接共培养与间接共培养2种,生物支架材料的介入、培养条件的改变等作用又可将共培养结局分为二维和三维再生组织。（3）直接共培养通过细胞间接触构建生理性的细胞外基质以及利于干细胞增殖分化的微环境。（4）间接共培养解决了组...     

人小胶质细胞的分离、纯化、特异分子表达与吞噬功能研究

目的： 探讨人小胶质细胞（microglia）分离、纯化、培养及鉴定的方法，为深入研究小胶质细胞功能建立一种简便的、稳定的细胞模型。方法: 取5个月人工药物引产的胎儿脑组织，将脑组织剪碎、研磨、过滤、离心获取混合胶质细胞悬液，用DMEM/F12完全培养基调整细胞密度为2×1010cells/L，接种于75 cm2培养瓶中（记作first 0d）；7-10 d后，进行第1次纯化。此次纯化采用轻柔摇动法将贴壁不牢的小胶质细胞和少突胶质细胞与底层的星形胶质细胞分离并转入另一培养瓶继续培养扩增（记作second 0 d）；4-5 d后，混合的小胶质细胞和少突胶质细胞汇合成片，采用胰酶-EDTA消化法结合差速贴壁法进行第2次纯化。此次纯化将消化得到的细胞悬液离心和重悬，接种于培养瓶（记作0 h）；2 h后，小胶质细胞贴壁生长，少突胶质细胞依然漂浮在培养上清中，此时通过移走上清以去除少突胶质细胞，即得到高纯度的小胶质细胞；运用激光共聚焦显微镜技术、流式细胞术结合细胞表面或胞内免疫荧光抗体染色技术检测所分离的小胶质细胞CD45，CD11b和CD68的阳性率，以计算其纯度；通过吞噬荧光微球评价其吞噬功能；利用胞膜边缘波动（membrane ruffling）现象结合荧光标记的鬼笔环肽染色技术鉴定其活化水平。结果: 我们所分离的小胶质细胞中，＞98%的细胞表达CD45，CD11b和CD68，并且能够吞噬荧光微球。结论：我们成功地分离和纯化了人小胶质细胞，所得到的小胶质细胞高表达CD45，CD11b和CD68分子，并且具有很强的吞噬功能，为进一步进行其功能和蛋白质组研究奠定基础。     

硫酸软骨素蛋白聚糖与脊髓损伤轴突再生

脊髓损伤后传导束的纤维不能有效再生是脊髓损伤后修复与功能重建的难点之一,其中屏障之一是神经胶质瘢痕,主要由星形胶质细胞和硫酸软骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs）组成,轴突不能穿过神经胶质而再生,屏障导致营养不良,再生受阻。目前有关胶质瘢痕的形成过程与调控、CSPGs参与胶质瘢痕形成的机制、以及如何有效地控制瘢痕的形成从而促进轴突再生,仍存在许多未知领域。     

中药髓复康对损伤后的脊髓神经元的保护作用

为了研究“髓复康”在体外培养中是否具有一定的神经元保护作用 ,本研究采用原代培养胎鼠脊髓神经元 ,分别将高浓度的髓复康 ( 10μl/ ml)、低浓度的髓复康 ( 5μl/ ml)与体外培养 5 d的原代脊髓神经元共同孵育 2 4h,空白对照组不加中药只加入等量的培养液。选用 10 0 μmol/ L的谷氨酸作用于细胞 1h,建立谷氨酸诱导原代脊髓神经元凋亡的细胞培养模型 ,采用酶学方法( MTT法 )评价神经元损伤程度。结果表明 ,髓复康组神经元线粒体内的琥珀酸脱氢酶的活性明显地高于空白对照组 ,组间有极显著的差异 ( P<0 .0 0 1)。提示 ,“髓复康”可以部分地抑制谷氨酸的兴奋性神经毒性作用     

小胶质细胞极化介导炎症反应在脊髓损伤中的作用

背景:小胶质细胞极化参与脊髓损伤后的炎症反应,并在其中发挥关键作用。相关研究表明,有效诱导小胶质细胞从M1促炎表型向M2抗炎表型极化,可以减轻脊髓损伤后的炎症反应,促进组织的修复再生和神经功能的恢复。目的:文章对小胶质细胞的功能和极化、小胶质细胞极化对脊髓损伤的影响及其潜在调控策略以及脊髓损伤后炎症反应进行综述。方法:检索PubMed、Web of Science和中国知网数据库,英文检索词为“microglia,polarization,spinal cord injury,inflammation”,中文检索词为“小胶质细胞、极化、脊髓损伤、炎症”,按纳入和排除标准共纳入80篇文献进行总结。结果与结论:①由小胶质细胞介导的稳定而持续的炎症反应,对脊髓损伤的预后至关重要。②在生理条件下,小胶质细胞处于M0静止表型,但在脊髓损伤后,小胶质细胞活化,进而极化成M1促炎表型,导致神经组织修复能力降低和出现持续性神经炎症。③在脊髓损伤的炎症反应过程中,调控小胶质细胞向M2表型极化或至少向M2表型倾斜,有利于抑制氧化应激反应、调节突触重塑、促进轴突再生和血管生成,是一种有效的调控策略。④截止到目前的研究表明,间充质干细胞、外泌体、临床药物、天然产物、miRNAs和靶点分子可调控小胶质细胞在M1和M2表型之间的转换,这为脊髓损伤后神经组织的修复提供了一种新的思路,未来需进一步研究小胶质细胞在脊髓损伤过程中调控极化的详细机制。     

一种同时培养原代神经元和原代星形胶质细胞的实验方法

目的 建立一种简便实用的可同时提取原代神经元和原代星形胶质细胞的培养方法.方法 选用出生24 h的SD乳鼠,75％乙醇消毒,断脊法处死.用眼科镊拨开脑膜各层,取出完整大脑.游离海马,剥离血管,木瓜蛋白酶消化,然后吹打、离心、过滤,以合适密度种植于相应培养皿.4h后更换培养基,以后每2天半量换液培养.第5天用免疫荧光法鉴...     

还脑益聪方组分对APP转基因小鼠脑组织炎症因子和氧化应激的影响

目的: 研究中药复方-还脑益聪方(HNYCF)组分对阿尔茨海默病(AD)动物模型脑组织炎症因子和氧化应激相关指标的影响,探讨其治疗AD的作用机制。方法: 选用3月龄APP695V717I转基因小鼠AD模型,随机分成4组:模型组、盐酸多奈哌齐组、HNYCE组分大剂量组和HNYCF组分小剂量组。另设立正常对照组(相同遗传背景的C57BL/6J小鼠)。各组小鼠按相应处理连续灌胃6个月后进行相关指标检测。采用Morris水迷宫和跳台实验观测小鼠学习记忆能力,采用免疫组织化学法检测脑组织核因子κB(NF-κB) 和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达水平,放射免疫法测定脑组织皮层和海马白细胞介素-6 (IL-6)和高敏C-反应蛋白(hs-CRP)的含量,比色法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法测定血清丙二醛(MDA)含量。结果: HNYCF小鼠在Morris水迷宫中穿越平台次数、第4象限游泳时间和路程均较模型组显著增多(P<0.05或P<0.01);HNYCF大剂量组小鼠在跳台实验中潜伏期较模型组显著延长(P<0.01);HNYCF小鼠脑组织NF-κB表达下调,PPARγ表达上调,IL-6含量减少,与模型组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01);HNYCF小鼠血清SOD活性较模型组显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论: HNYCF可以改善APP转基因小鼠的学习记忆能力,其作用机制可能与抗炎、抗氧化作用有关。     

电针对受损展神经小胶质细胞分型的影响

目的:探讨电针治疗对Beagle犬展神经损伤模型中小胶质细胞表型的影响。方法:健康成年Beagle犬随机分为4组:正常对照组、假手术组、损伤组及电针处理组,每组各5只。其中假手术组仅暴露分离展神经;损伤组制作模型后于电针刺激组接受电针刺激时仅进行束缚;电针处理组模型建立后进行电针刺激。实验连续2周。运用Western blot检测展神经小胶质细胞亚型M1型标志分子[诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素1β(IL-1β)]及M2型标志分子[精氨酸酶(arginase)和脑源性神经营养因子(BDNF)]的表达水平。结果:损伤组iNOS的表达较正常对照组明显增加(P0.05);而电针处理组经电针治疗较损伤组iNOS表达明显降低(P0.05);损伤组和电针处理组IL-1β的表达较正常对照组均增加(P0.05),其中与损伤组相比,电针处理组IL-1β表达降低(P0.05)。损伤组和电针处理组arginase表达较正常对照组均增加(P0.05),其中电针处理组的arginase表达较损伤组增加(P0.05);同时BDNF在损伤组和电针处理组的表达均增加(P0.05),电针处理组的BDNF表达较损伤组增加(P0.05)。结论:展神经损伤后,电针治疗能降低小胶质细胞M1型标志分子表达水平,同时增加M2型标志分子表达水平。     

Role of microglia in neuronal degeneration and regeneration

Microglial cells, the resident macrophage population of the central nervous system (CNS), actively scan tissue under both normal and pathologic contexts. Their resulting engagement can become either neuroprotective or neurotoxic, leading to amelioration or aggravation of disease progression. In this review, we focus on the molecular signaling molecules involved in microglial responses and discuss observations demonstrating the diverse effects of microglia in animal models of CNS diseases.     

New neurons for the injured brain: mechanisms of neuronal regeneration in adult teleost fish

In contrast to mammals, teleost fish exhibit an enormous potential to continuously produce new neurons in many areas of the adult brain, and to regenerate neural tissue after brain injury. The regenerative capability of the teleost fish brain is based upon a series of well-orchestrated individual processes, including: elimination of damaged cells by apoptosis, removal of cellular debris by the action of microglia/macrophages, proliferation of endogenous neural precursor cells, radial glia-mediated migration of their progeny to the site of the lesion, neuronal differentiation, promotion of cellular survival, and integration of the new neurons into existing neural circuits. Combination of a well-defined cerebellar lesion paradigm with differential proteome analysis has demonstrated that identification of the multitude of proteins mediating the regenerative potential of the adult fish brain is feasible in the foreseeable future. A molecular understanding of brain regeneration in fish could help investigators to define novel strategies to stimulate endogenous neural precursor cells in the mammalian brain to undergo neurogenesis, thus forming the basis of a neuronal replacement therapy for brain injury or neurodegenerative diseases.     

中药复方液对麻黄素仔鼠肝组织结构和抗氧化酶活性的影响

目的 探讨中药复方液对麻黄素致损伤的影响。 方法 采用递增剂量连续腹腔注射浓度为2.0g/L、3.0g/L和4.0g/L的麻黄素溶液,在注射麻黄素1h 后再分别灌胃,浓度为20.0g/L、30.0g/L和40.0g/L的中药复方液。分别于灌胃中药5、10、15d后,用比色法测定仔鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量,用显微镜观察肝组织结构,用免疫组织化学法检测肝组织c-Fos蛋白的表达。 结果 麻黄素组仔鼠10d、15d 时肝组织SOD、CAT的活性低于对照组,MDA含量高于对照组 (P<0.05或 P<0.01),肝组织有不同程度的损伤,肝组织c-Fos蛋白表达强度高于对照组 (P<0.05或P<0.01);中药组仔鼠肝组织SOD、CAT活性升高,MDA含量降低(P<0.05或P<0.01),肝组织损伤明显减轻,肝组织c-Fos蛋白的阳性表达强度减弱(P<0.05或P<0.01)。结论 麻黄素对肝组织有明显的损伤效应,中药复方液可提高细胞抗氧化活性,具有抗炎、抗氧化和保护肝细胞等作用,能有效减轻麻黄素对肝组织的损伤。     

Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling

ABSTRACT: BACKGROUND: Microglia are resident brain macrophages that can phagocytose dead, dying or viable neurons, which may be beneficial or detrimental in inflammatory, ischaemic and neurodegenerative brain pathologies. Cell death caused by phagocytosis of an otherwise viable cell is called 'primary phagocytosis' or 'phagoptosis'. Calreticulin (CRT) exposure on the surface of cancer cells can promote their phagocytosis via LRP (low-density lipoprotein receptor-related protein) on macrophages, but it is not known whether this occurs with neurons and microglia. METHODS: We used primary cultures of cerebellar neurons, astrocytes and microglia to investigate the potential role of CRT/LRP phagocytic signalling in the phagocytosis of viable neurons by microglia stimulated with LPS (lipopolysaccharide) or nanomolar concentrations of amyloid-beta peptide1-42 (Abeta). Exposure of CRT on the neuronal surface was investigated using surface biotinylation and western blotting. A phagocytosis assay was also developed using BV2 and PC12 cell lines to investigate CRT/LRP signalling in microglial phagocytosis of apoptotic cells. RESULTS: We found that BV2 microglia readily phagocytosed apoptotic PC12 cells, but this was inhibited by a CRT blocking antibody or LRP-blocking protein (Receptor-Associated Protein: RAP). Activation of primary rat microglia with LPS or Abeta resulted in loss of co-cultured cerebellar granule neurons, and this was blocked by RAP or antibodies against CRT or against LRP, preventing all neuronal loss and death. CRT was present on the surface of viable neurons, and this exposure did not change in inflammatory conditions. CRT antibodies prevented microglia-induced neuronal loss when added to neurons, while LRP antibodies prevented neuronal loss when added to the microglia. Pre-binding of CRT to neurons promoted neuronal loss if activated microglia were added, but pre-binding of CRT to microglia or both cell types prevented microglia-induced neuronal loss. CONCLUSIONS: CRT exposure on the surface of viable or apoptotic neurons appears to be required for their phagocytosis via LRP receptors on activated microglia, but free CRT can block microglial phagocytosis of neurons by acting on microglia. Phagocytosis of CRT-exposing neurons by microglia can be a direct cause of neuronal death during inflammation, and might therefore contribute to neurodegeneration and be prevented by blocking the CRT/LRP pathway.     

免疫调节剂对致痫大鼠脑内神经元及小胶质细胞内谷氨酸和蛋白激酶C免疫反应的影响

为了探讨免疫调节作用对癫痫发病的影响与相关机制,应用免疫细胞化学技术研究免疫调节剂干预戊四氮(pentyle-netetrazol,PTZ)致痫时,大鼠脑内及培养的小胶质细胞内谷氨酸(Glu)和蛋白激酶C(PKC)的表达变化。结果显示:在体实验中大鼠大脑皮质及海马,Glu和PKC在生理盐水对照组(NS组)、戊四氮组(PTZ组)、左旋咪唑+戊四氮组(LMS+PTZ组)、地塞米松+戊四氮组(DEX+PTZ组)均有不同的表达,且二种物质变化趋势基本一致。其中PTZ组较NS组表达增强,LMS+PTZ组进一步增强,DEX+PTZ组较PTZ组和LMS+PTZ组明显减弱。离体实验中,PTZ作用小胶质细胞2h即可引起Glu和PKC表达增多,6h达峰值,12h表达有所减弱,且PTZ组Glu和PKC表达较NS组明显增多,免疫增强剂(levamisole,LMS)可进一步增强Glu和PKC的表达;免疫抑制剂(dexamethasone,DEX)则下调其表达。以上结果提示免疫调节剂可能通过作用于神经元和小胶质细胞内Glu和PKC的表达而共同影响癫痫的发病机制和发病状态。     

小胶质细胞体外吞噬模型的建立及相关炎症因子的研究

目的: 建立以细胞凋亡信号－磷脂酰丝氨酸(PS)介导的小胶质细胞体外吞噬模型,研究小胶质细胞发挥吞噬功能时炎症因子的表达变化。方法: 用N-乙基马来酰胺(NEM)预处理红细胞,随后整合氧化PS,制备含氧化PS信号的红细胞凋亡模型,并测定小胶质细胞对整合氧化PS信号红细胞吞噬率的变化。同时, real-time PCR检测小胶质细胞中炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达情况,研究小胶质细胞吞噬功能与炎症功能之间的关系。结果: 小胶质细胞对整合氧化PS红细胞的吞噬率显著高于对照组(P<0.01),同时炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平明显减少。结论: 成功制备小胶质细胞体外吞噬凋亡细胞模型,小胶质细胞的吞噬作用可能是自身炎症因子IL-1β和TNF-α在转录水平上降低的诱因。     

Effects of a traditional Chinese herbal preparation on osteoblasts and osteoclasts

Background

Bone formation and resorption is a balanced and continuous process. When osteoclastic bone resorption exceeds osteoblastic bone formation, bone density decreases, which can lead to osteoporosis. Er-Zhi-Wan (EZW), a famous traditional Chinese formulation, has been developed as a restorative formula for hundreds of years, which contains two herbs viz. Herba Ecliptae and Fructus Ligustri Lucidi. EZW is widely used to prevent and treat various kidney diseases for its actions of nourishing the kidney yin and strengthening tendon and bone. The objective of current study was to investigate the effects of EZW on proliferation and differentiation of osteoblasts and osteoclasts in vitro using a serum pharmacological method.

Methods

The rats were orally administered EZW (0.45, 1.8 and 7.2 g kg⁻¹) for total seven doses and twice a day, and then the different concentrations of EZW-containing serum were prepared. The proliferation of primary cultural osteoblasts, UMR106 and RAW264.7 cells and differentiation of osteoclasts were determined after these cells were treated with different concentrations of EZW-containing serum for a period of time.

Results

The serum from rats treated with EZW for 4 days did not facilitate proliferation of primary cultural osteoblasts and UMR106 cells, but evidently inhibited both proliferation of RAW264.7 cells and differentiation of osteoclasts from RAW264.7 cells induced by receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANK-L) and macrophage-colony stimulating factor (M-CSF).

Conclusion

Antiosteoporotic activity of EZW is carried out mainly via restraint of osteoclastic bone resorption, which is in accordance with the traditional Chinese medicine theory on nourishing the kidney yin. Therefore EZW has favorable potency to develop a new anti-osteoporotic agent in clinic.     

联合培养体系中对骨髓间充质干细胞Bmi-1表达的影响**☆

背景：血管内皮细胞能够促进骨髓间充质干细胞向成骨方向转变,并为干细胞的生长增殖提供营养支持。 目的：观察人脐静脉血管内皮细胞在联合培养体系中对人骨髓间充质干细胞的形态、生长、细胞分化及其Bmi-1基因表达的影响。 方法：在建立细胞联合培养体系基础上,设立单纯骨髓间充质干细胞培养组、骨髓间充质干细胞与脐静脉血管内皮细胞联合培养组,分别于第4,6,8,10天在相差显微镜下观察形态变化、细胞计数绘制生长曲线并采用实时荧光定量PCR检测单独培养的人骨髓间充质干细胞组及联合培养组中人骨髓间充质干细胞的Bmi-1基因表达情况。 结果与结论：在各时间点与单纯骨髓间充质干细胞培养组相比较,联合培养组中干细胞的形态呈多样化,后期部分细胞之间出现了连接,成骨分化明显。联合培养组的细胞数量以及Bmi-1表达量各时间点均显著高于单纯骨髓间充质干细胞培养组。联合培养相容性良好。提示脐静脉内皮细胞对体外联合培养体系中骨髓间充质干细胞具有促进增殖的作用;能促进骨髓间充质干细胞Bmi-1基因的表达,对细胞衰老和增殖能力有显著影响。