ROCK I/II基因下调对TGF-β1诱导的人主动脉平滑肌细胞迁移及增殖的影响

目的：探讨Rho激酶I/II（ROCK I/II）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人主动脉平滑肌细胞（HA-VSMCs）迁移及增殖的影响。 方法：比较转染ROCK I siRNA、ROCK II siRNA、TGF-β1单独处理、转染ROCK I siRNA或ROCK II siRNA后加TGF-β1处理的HA-VSMCs中ROCK I和ROCK II蛋白表达;比较TGF-β1单独处理、转染ROCK I siRNA或ROCK II siRNA后加TGF-β1处理以及用ROCK I抑制剂Y-27632后加TGF-β1处理的HA-VSMCs的迁移与增殖能力。实验均以无处理的HA-VSMCs为空白对照。 结果：与空白对照HA-VSMCs比较,TGF-β1单独处理后HA-VSMCs的ROCK I蛋白表达明显升高（P<0.05）,而ROCK II蛋白表达无明显变化（P>0.05）;ROCK I siRNA或ROCK II siRNA转染后HA-VSMCs中各自靶蛋白表达明显降低（均P<0.05）,TGF-β1诱导的ROCK I蛋白表达升高被ROCK I siRNA转染明显抑制（P<0.05）。与空白对照HA-VSMCs比较,TGF-β1单独处理后HA-VSMCs细胞迁移数明显增加（P<0.05）,该作用被ROCK I siRNA转染及Y-27632处理明显抑制（均P<0.05）,而不被ROCK II siRNA转染影响（P<0.05）;TGF-β1单独处理后HA-VSMCs增殖明显增强（P<0.05）,而无论ROCK I siRNA、ROCK II siRNA转染或Y-27632处理均对TGF-β1的增殖诱导作用无明显影响（均P>0.05）。 结论：ROCK I可能在TGF-β1诱导的HA-VSMCs迁移中起主要作用,而ROCK I和ROCK II可能均不参与TGF-β1诱导的HA-VSMCs增殖。     

ROCKⅠ/Ⅱ在转化生长因子β1诱导的主动脉平滑肌细胞表型转化中的作用

目的:探讨ROCKⅠ/Ⅱ在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC)表型转化中的作用。方法:将HA-VSMC分别转染ROCKI和ROCKII的si RNA后荧光显微镜观察转染情况,并用Western blot方法检测不同处理的HA-VSMC(ROCKI si RNA转染、ROCKII si RNA转染、+TGF-β1、ROCKI si RNA转染+TGF-β1、ROCKII si RNA转染+TGF-β1)中ROCKI和ROCKII蛋白的表达;分别用Western blot和RT-PCR方法检测不同处理的HA-VSMC(+TGF-β1、ROCKI si RNA转染+TGF-β1、ROCKII si RNA转染+TGF-β1、ROCK非特异性抑制剂Y-27632预处理+TGF-β1)中细胞收缩表型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)与合成表型标志物骨桥蛋白(OPN)的蛋白与m RNA表达,均以无处理的HA-VSMC为空白对照。结果:免疫荧光观察与Western blot检测表明两种si RNA均成功转染;TGF-β1处理后,HA-VSMC中ROCKI蛋白表达明显升高(P0.05),但ROCKII蛋白表达无明显变化(P0.05),ROCKI si RNA转染后TGF-β1上调ROCKI的作用被明显抑制(P0.05)。与空白对照组HA-VSMC比较,TGF-β1处理后的HA-VSMC中α-SMA、SM22α的蛋白和m RNA表达明显降低,而OPN蛋白与m RNA表达明显升高(均P0.05),ROCKI si RNA转染或Y-27632预处理后,TGF-β1的上述作用均明显减弱(均P0.05),ROCKII si RNA转染对TGF-β1的上述作用均无明显影响(均P0.05)。结论:TGF-β1可诱导HA-VSMC由收缩表型向合成型表型转化,ROCKI表达的升高可能在这一转化中起主要作用。     

ROCKI/II在转化生长因子β1诱导的主动脉平滑肌细胞表型转化中的作用

目的：探讨ROCKI/II在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人主动脉平滑肌细胞（HA-VSMC）表型转化中的作用。 方法：将HA-VSMC分别转染ROCKI和ROCKII的siRNA后荧光显微镜观察转染情况,并用Western blot方法检测不同处理的HA-VSMC（ROCKI siRNA转染、ROCKII siRNA转染、+TGF-β1、ROCKI siRNA转染+TGF-β1、ROCKII siRNA转染+TGF-β1）中ROCKI和ROCKII蛋白的表达;分别用Western blot和RT-PCR方法检测不同处理的HA-VSMC（+TGF-β1、ROCKI siRNA转染+TGF-β1、ROCKII siRNA转染+TGF-β1、ROCK非特异性抑制剂Y-27632预处理+TGF-β1）中细胞收缩表型标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）与合成表型标志物骨桥蛋白（OPN）的蛋白与mRNA表达,均以无处理的HA-VSMC为空白对照。 结果：免疫荧光观察与Western blot检测表明两种siRNA均成功转染;TGF-β1处理后,HA-VSMC中ROCKI蛋白表达明显升高（P<0.05）,但ROCKII蛋白表达无明显变化（P>0.05）,ROCKI siRNA转染后TGF-β1上调ROCKI的作用被明显抑制（P<0.05）。与空白对照组HA-VSMC比较,TGF-β1处理后的HA-VSMC中α-SMA、SM22α的蛋白和mRNA表达明显降低,而OPN蛋白与mRNA表达明显升高（均P<0.05）,ROCKI siRNA转染或Y-27632预处理后,TGF-β1的上述作用均明显减弱（均P<0.05）,ROCKII siRNA转染对TGF-β1的上述作用均无明显影响（均P>0.05）。 结论：TGF-β1可诱导HA-VSMC由收缩表型向合成型表型转化,ROCKI表达的升高可能在这一转化中起主要作用。     

Smad4 siRNA对乳腺癌细胞侵袭力和MMP-9表达的影响

目的:探讨Smad4特异性小分子干扰RNA(siRNA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭力及MMP-9表达的影响。方法:构建Smad4 siRNA,将细胞分为空白对照组,Smad4 siRNA转染组,TGF-β处理组,Smad4 siRNA转染+TGF-β处理组。首先用Western blot法检测转染Smad4 siRNA后细胞中Smad4蛋白的表达,以及用荧光素酶报告基因法检测TGF-β处理后细胞Smad结合元件(4xSBE)的活性;然后用Transwell小室模型和Western blot法检测各组细胞的黏附侵袭能力以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达水平。结果:转染Smad4 siRNA后,乳腺癌细胞的Smad4蛋白表达及其TGF-β诱导的4xSBE活性增强均被明显抑制(均P<0.05);与对照组细胞比较,细胞经TGF-β刺激后的侵袭能力及MMP-9的表达量均明显增加(均P<0.05),但预先转染Smad4 siRNA的细胞的上述TGF-β刺激作用被明显抑制(均P<0.05),单纯Smad4 siRNA转染对细胞的侵袭能力及MMP-9的表达量无明显影响。结论:Smad4 siRNA能减弱TGF-β诱导的MDA-MB-231细胞的侵袭能力,该作用可能与其抑制MMP-9的表达有关。     

Y-27632 对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨Rho A/ROCK通路特异性阻断剂Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法自小鼠股骨、胫骨骨髓腔分离培养小鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪细胞表面标记检测及细胞成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定小鼠骨髓单个核细胞。将第3代小鼠骨髓间充质干细胞随机分为2组,单纯成骨诱导液对照组、Y-27632干预组。分别于细胞培养后1d、2d、3d、4d收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;成骨诱导后7 d、14 d收集细胞,可见光比色法检测碱性磷酸酶(ALP)变化;成骨诱导后24h收集细胞,western blot法检测Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil-containing protein kinases1,ROCK1)的表达。结果流式细胞术细胞表面标志检测及成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定均证实我们所获细胞为BMSCs。与对照组相比,Y-27632能促进BMSCs增殖,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632能降低ALP表达,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632能明显阻断ROCK1的表达,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 Y-27632阻断Rho A/ROCK信号通路可以促进BMSCs增殖,抑制BMSCs成骨分化。     

Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用

[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制。[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量。设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,Real Time-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标。[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少。siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P0.05)。[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化。     

RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的　探讨RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转分化中的作用。 方法　体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,静止24 h后,采用随机数字表法随机分为以下4组：正常对照组、TGF-β1（10 μg/L）刺激组、TGF-β1（10 μg/L）＋Y-27632（Rock特异性抑制剂,10 μmol/L）组（Y-27632预处理2 h）、Y-27632（10 μmol/L）组。用TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC不同时间,观察α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,E钙黏素（E-cadherin）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达。RT-PCR法检测E-cadherin、α-SMA 和ColⅠmRNA表达。Western印迹法检测RhoA（包括总RhoA及活化的RhoA）、E-cadherin、α-SMA、ColⅠ和波形蛋白（vimentin）表达。活化的RhoA由膜蛋白提取试剂盒提取。 结果 （1）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能诱导RhoA活化,于10 min开始出现活性升高,为对照组的（2.57±0.52）倍（P < 0.05）;1 h达高峰,为对照组的（4.35±0.41）倍（P < 0.05）。（2）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能导致E-cadherin mRNA和蛋白表达下调,α-SMA、ColⅠmRNA和蛋白表达上调,呈时间依赖性。（3）Rock特异性抑制剂Y-27632能显著下调α-SMA、ColⅠmRNA的表达,较TGF-β1刺激组各降低了53.8%和55.7%（均P < 0.05）,并且能下调α-SMA、ColⅠ和vimentin蛋白的表达,较TGF-β1刺激组分别降低了42.6%、60.1%和58.1%（均P < 0.05）,但不能上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。 结论　TGF-β1可通过RhoA-Rock信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。     

TGF-β1/Smad7信号通路在乳腺癌组织中的表达及与细胞增殖和转移的关系

目的 :探讨TGF-β1/Smad7信号通路在乳腺癌组织中的表达及与细胞增殖、转移的关系。方法:留取67例乳腺癌患者肿瘤及癌旁组织,利用实时荧光定量PCR检测乳腺癌及癌旁组织中TGF-β1和Smad7基因表达,培养人乳腺癌Luminal A型细胞株MCF-7,根据转染处理不同分为TGF-β1 si RNA转染组、阴性对照组和空白对照组,MTT法检测不同转染组细胞增殖能力,Transwell细胞侵袭、迁移实验检测不同转染组细胞侵袭和迁移能力,利用实时荧光定量PCR检测不同转染组细胞中TGF-β1、Smad7和EMT相关基因表达。结果:乳腺癌组织中TGF-β1 m RNA相对表达量高于癌旁组织,而Smad7 m RNA相对表达量则低于癌旁组织,差异有统计学意义(P0.05);MTT检测结果显示,TGF-β1 si RNA转染组细胞48、72和96 h时吸光度值均低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05);细胞侵袭实验结果显示,TGF-β1 si RNA转染组每高倍视野细胞数均低于阴性对照组和空白对照组(P0.05);细胞迁移实验结果显示,TGF-β1 si RNA转染组每高倍视野细胞数均低于阴性对照组和空白对照组(P0.05);TGF-β1 si RNA转染组细胞中TGF-β1 m RNA、Vimentin m RNA、Snail-2 m RNA和MMP-9 m RNA相对表达量均低于阴性对照组和空白对照组,而Smad7m RNA和E-cadherin m RNA相对表达量均高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:乳腺癌发生与TGF-β1/Smad7信号通路激活有关,特异性抑制TGF-β1可促进Smad7表达而抑制乳腺癌细胞EMT发生,从而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移过程。     

TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的研究

【摘要】 目的：探讨利用转基因技术构建的转化生长因子β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）和骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7,BMP-7）重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyme stem cells,BMSCs）,诱导其向类髓核细胞分化的可行性。方法：将培养获得的BMSCs分成5组,A：空白对照组,B：免疫荧光对照组,C：TGF-β3单独转染组,D：BMP-7单独转染组,E：TGF-β3+BMP-7共转染组。利用转基因技术构建的TGF-β3和BMP-7重组腺病毒对BMSCs进行转染,荧光显微镜观察其转染效率,培养14d后,再以Western-Blot方法检测A、C、D、E组细胞TGF-β3和BMP-7蛋白分泌情况,以Realtime PCR方法检测各组蛋白聚糖（ACAN）、Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、Ⅹ型胶原（Collagen Ⅹ）、SOX9基因表达水平,明确腺病毒转染后兔骨髓间充质干细胞的分化情况。结果：以TGF-β3和BMP-7重组腺病毒转染兔BMSCs后常规DMEM培养基培养14d,细胞形态出现明显变化,圆形及椭圆形细胞明显增多。Western blot方法检测,共转染组TGF-β3和BMP-7蛋白表达水平明显增高。培养14d时,Realtime PCR检测ACAN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、SOX9基因的表达水平转染组（C、D、E组）较对照组（A、B组）明显升高（P<0.05）,其中Collagen Ⅰ和SOX9表达单独转染组（C、D组）与共转染组（E组）比较差异无显著性（P>0.05）,Collagen Ⅱ表达共转染组较单独转染组明显增高（P<0.05）。TGF-β3单独转染组和共转染组的Collagen Ⅹ基因表达较BMP-7单独转染组和对照组明显降低（P<0.05）。结论：转基因技术重组TGF-β3和BMP-7腺病毒可成功转染兔BMSCs,获得TGF-β3和BMP-7蛋白的表达。TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔BMSCs后,可有效诱导兔BMSCs向类髓核细胞方向分化。     

RhoA/ROCK通路在转化生长因子-β1诱导骨髓基质干细胞向软骨分化中的作用

目的 探讨RhoA／ROCK信号通路在转化生长因子-β1（TGF-β1）体外诱导骨髓基质干细胞（BMSCs）向成软骨细胞表型分化过程中的表达及作用。方法 由小鼠骨髓中分离出BMSCs，体外传代培养，取第3代细胞通过TGF-β1诱导向软骨细胞分化。采用Western-blot和RT-PCR方法分别检测RhoA和ROCK1／2、Ⅱ型胶原在细胞分化过程中的表达及应用Rho激酶抑制剂Y27632后的表达。结果 RhoA和ROCK1／2在分化过程中均有表达。Rho激酶抑制剂Y27632导致诱导后成软骨细胞相关的Ⅱ型胶原表达减少。结论 RhoA／ROCK信号通路可能在BMSCs分化为软骨细胞过程中起着重要调控作用。     

RhoA/Rho激酶信号通路在TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

目的 观察TGF-[1对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到RhoA/Rho激酶信号通路的影响,以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法 原代培养人皮肤成纤维细胞,将第4代细胞用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激后,分不同作用时间(0、3、6、24h)提取细胞内总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度,Western -blot检测α-SMA的表达水平;并用相同的方法检测不同浓度TGF-β1(0、2、10、50 ng/ml)刺激人皮肤成纤维细胞后,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。用RhoA/Rho激酶信号通路阻断剂Y-27632处理后,再用TGF-β1刺激,作为实验组,将未作处理的正常细胞作为空白对照组,Y-27632（10 μmol/L）组作为阴性对照组,只用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激组作为阳性对照组,分别检测α-SMA的表达差异。使用ANOVA对蛋白表达量进行统计学分析,P ＜0.05为差异有统计学意义。结果 10 ng/ml TGF-β1按不同作用时间刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0h为1.0,3h为1.9+0.2、6h为2.1±0.1,24 h为3.1±0.1。24 h较其他3个时间点α-SMA表达量明显上升（n=4,P＜0.05）。不同浓度TGF-β1刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0 ng/ml为1.0,2 ng/ml为1.4±0.2,10 ng/ml为3.2±0.1,50 ng/ml为3.1±0.2。10 ng/ml表达量明显高于0 ng/ml和2 ng/ml(n =4,P ＜0.05),较50 ng/ml差异无统计学意义(n=4,P＞0.05)。用Y-27632（10 μmol/L）处理后,再用TGF-β1刺激,细胞的表型转化明显受到抑制,实验组α-SMA的表达量(1.2±0.2)较阳性对照组(2.9±0.1)明显降低(n=5,P ＜0.05),与空白对照组(1.0)和阴性对照组(1.1±0.1)相比差异均无统计学意义(n=5,P＞0.05)。结论 RhoA/Rho激酶信号通路参与了 TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化过程。     

TGF-β1在大鼠睾丸支持细胞的作用及对紧密连接的影响

目的:探讨TGF-β1在大鼠睾丸支持细胞增殖和凋亡中的作用以及对紧密连接相关蛋白基因表达的影响。方法:体外分离和培养大鼠睾丸支持细胞,分空白对照组、TGF-β1受体阻滞剂组、TGF-β1刺激组和TGF-β1+受体阻滞剂组共4组。CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;建立支持细胞原代双室培养模型,应用跨上皮电阻测定法(TER)检测单层细胞两侧跨细胞电阻值;RT-PCR和Western印迹检测支持细胞闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白1(ZO-1)和紧密连接蛋白Ⅱ(ClaudinⅡ)的相对表达量。结果:各组细胞增殖组间差异有统计学意义(F=5.05,P0.05),TGF-β1刺激组与空白对照组相比细胞增殖率增加(P0.05),而TGF-β1+受体阻滞剂组与TGF-β1刺激组相比细胞增殖率降低(P0.05)。各组细胞凋亡率组间差异无统计学意义(F=1.13,P0.05);各组细胞间TER差异有统计学意义(F=38.99,P0.01),与空白对照组比较TGF-β1刺激组TER降低(P0.01),与TGF-β1刺激组比较,TGF-β1+受体阻滞剂组和TGF-β1受体阻滞剂组细胞TER升高(P均0.01);各组支持细胞中ZO-1、ClaudinⅡmRNA及蛋白在各组中的表达量差异均无统计学意义(F_(mRNA)=0.49,0.93,P均0.05;F_(蛋白)=0.28,1.31,P均0.05),而Occludin mRNA及蛋白在各组中的表达量差异均有统计学意义(F_(mRNA)=6.86,F_(蛋白)=6.87,P均0.05);与空白对照组相比,TGF-β1刺激组Occludin mRNA及蛋白表达明显降低(P均0.01),而加入受体阻滞剂后,Occludin mRNA及蛋白表达明显回升(P均0.05)。结论:TGF-β1对睾丸支持细胞的增殖有促进作用,并能通过调节Occludin蛋白的表达而影响大鼠支持细胞间的紧密连接。     

小干扰RNA沉默血管内皮生长因子对ACHN肾癌细胞黏附、侵袭及迁移的影响

目的 观察小干扰RNA (siRNA)沉默血管内皮生长因子(VEGF)对ACHN肾细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 化学合成针对VEGF的小干扰RNA,实验分4组,转染后收集细胞,通过蛋白印迹方法检测VEGF的表达,噻唑蓝(MTT)比色法、细胞黏附实验、划痕实验及Transwell法测定细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭能力.结果 siRNA 1～2组VEGF表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组;在24、48、72 h,siRNA 1～2的增殖抑制率均高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.05),其中以siRNA2组最为显著;与空白对照组比较,siRNA 1～2组的细胞黏附数量明显下降[(81.5±3.1)％比(40.5±2.6)％、P＜0.05,(81.5±3.1)％比(22.5±2.4)％、P＜0.05],其中以siRNA2组最为明显;siRNA1～2组的细胞迁移数量明显下降(162±9比81±5,P＜0.05;162±9比38±4,P＜0.05);siRNA1～2组细胞侵袭能力明显下降(P＜0.05),且siRNA 2组的细胞侵袭能力明显低于siRNA 1组(P＜0.05).结论 VEGF基因在肾细胞癌细胞黏附、迁移和侵袭中发挥着重要作用;以靶向VEGF的siRNA转染肾细胞癌细胞,可抑制肾细胞癌细胞黏附、迁移和侵袭能力.     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

携带siRNA的慢病毒载体抑制自发性高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞S1PR3的表达

目的:筛选出能够高效特异性沉默自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)内1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)基因表达的siRNA慢病毒载体,并观察其对SHR CCSMC ROCK1、ROCK2、e NOS表达的影响。方法:以大鼠S1PR3基因mRNA序列作为干扰靶点,设计并合成3对靶向S1PR3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及1对阴性对照序列,构建并包装成慢病毒载体。体外培养SHR CCSMC及魏-凯二氏大鼠(WKY)CCSMC,随机分为A组(SHR对照组)、B组(携带阴性对照病毒的SHR CCSMC转染组)、C~E组(分别携带靶向S1PR3基因siRNA 1~3号靶点慢病毒的SHR CCSMC转染组),F组(WKY对照组),以感染复数(MOI)=60转染SHR CCSMC,转染后观察细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,并用RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中S1PR3、ROCK1、ROCK2、e NOS mRNA及蛋白的表达情况。结果:经基因测序证明慢病毒载体构建成功。荧光显微镜下观察B~E组细胞转染效率均80%。与A组相比,B组S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均无明显改变(P均0.05),C、D、E、F组的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均较A组显著下降(P均0.05),其中E组抑制作用最为明显,使S1PR3 mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(34.2±2.9)%、(77.7±4.7)%;ROCK1 mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(33.3±1.4)%、(51.1±7.3)%;ROCK2 mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(30.8±3.6)%、(58.32±5.5)%。A组e NOS mRNA及蛋白表达分别与B、C、D、E比较无明显差异(P均0.05),但较F组显著降低(P0.05);与F组比较,E组S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均无明显改变(P均0.05),A、B、C、D组的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白表达均显著高于F组(P均0.05),A、B、C、D、E组e NOS mRNA及蛋白表达均较F组显著降低(P均0.05)。结论:本研究构建的3条携带不同位点的S1PR3基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR CCSMC内S1PR3基因的表达,并能有效抑制SHR CCSMC中上调的Rho A/Rho激酶信号通路,其中携带siRNA3慢病毒载体的抑制效率最高。     

饰胶蛋白聚糖基因转染对大鼠肾系膜细胞转化生长因子βⅠ、βⅡ型受体表达的影响

目的探讨饰胶蛋白聚糖(DCN)拮抗肾小球硬化进展的作用是否与其抑制系膜细胞(MsC)转化生长因子βⅠ、βⅡ型受体(TGF-βRⅠ、TGF—βRⅡ)表达有关。方法经外源性TGF-βⅠ刺激培养的大鼠肾MsC，采用RT—PCR、Western印迹法检测其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的表达。用脂质体介导法将DCN基因转染MsC，经筛选和鉴定，用RT—PCR、Western印迹法和免疫荧光法分别观察DCN基因转染对TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ表达的影响。结果经外源性TGF-βⅠ刺激的正常MsC，其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ基因转录及蛋白表达均明显升高，且呈时间依赖性，于作用24h达高峰。与转染空载体的MsC(1P-1)相比，转染。DCN基因的MsC克隆(3D-5，7D-1)的TGF-βRⅠmRNA表达分别为对照组的20％和32％，TGF-βRⅡmRNA表达分别为对照组的64％和59％；TGF-βRⅠ蛋白表达分别为对照组的34％和25％，TGF-βRⅡ蛋白表达分别为对照组的49％和57％。同时转染DCN基因也能阻止MsC对外源性TGF-βⅠ刺激所致的两种受体表达升高作用。结论过表达DCN基因的MsC，其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和蛋白表达水平均明显降低，这可能是DCN拮抗由TGF-β介导的肾小球硬化发生的重要机制之一。     

下调星形细胞上调基因1表达对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的:探讨下调星形细胞上调基因1(AEG-1)对乳腺癌细胞凋亡的影响。方法:通过脂质体介导的方法,将乳腺癌MCF-7细胞分别转染AEG-1siRNA(AEG-1siRNA)和阴性对照siRNA(阴性对照组),以无处理的MCF-7细胞为空白对照组。验证转染效果后,分别采用流式细胞术与Westernblot检测各组细胞的凋亡以及凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9的表达。结果:与空白对照组细胞比较,AEG-1siRNA组MCF-7细胞AEG-1蛋白表达明显降低、细胞凋亡率明显升高、caspase-3和caspase-9蛋白表达明显上调(均P0.05);阴性对照组与空白对照组间以上各项指标均无统计学差异(均P0.05)。结论:下调乳腺癌细胞AEG-1的表达能促进caspase-3和caspase-9的表达,从而诱导乳腺癌细胞凋亡,因此,AEG-1在乳腺癌细胞中可能起了抑制细胞凋亡的作用,机制可能与其调节凋亡相关蛋白的表达有关。     

重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs及其转录增强因子TAZ mRNA表达变化的研究

目的 探讨Ad-hTGF-β1转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)并诱导其向成软骨细胞分化的可行性及其相关转录因子TAZ mRNA表达的变化.方法 全骨髓法获取和培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第三代细胞接种于细胞培养板.实验分成三组:Ad-hTGF-β1转染组、Ad-EGFP转染组、空白对照组,前两组分别使用含Ad-hTGF-β1与Ad-EGFP的无血清培养基,空白对照组使用不做任何处理的完全培养基.7 d后,运用实时荧光定量PCR与Western blot检测TGF-β1的表达,利用免疫组织化学方法与Western blot检测CollagenⅡ的表达,采用实时荧光定量PCR检测TAZ mRNA的表达.结果 转染后7 d,实时荧光定量PCR结果显示TGF-β1表达量的平均相对比值分别为:Ad-hTGF-β1转染组0.863、Ad-EGFP转染组0.183、空白对照组0.180;TAZ表达量的平均相对比值分别为:Ad-hTGF-β1转染组0.810、Ad-EGFP转染组0.416、空白对照组0.366.TGF-β1和TAZ的表达差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot和免疫组化发现Ad-hTGF-β1转染组的细胞内Collagen Ⅱ表达呈强阳性,而Ad-EGFP转染组及空白对照组细胞内的Collagen Ⅱ表达很弱.结论 Ad-hTGF-β1能够成功且稳定的诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化.同时,在骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化过程中,转录增强因子TAZ的mRNA水平随之上调,认为TGF-β1可能通过TAZ的作用促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化.     

核心岩藻糖基转移酶siRNA抑制肾小管上皮细胞转化生长因子β-Smad2/3通路活化

目的 探讨α-1,6核心岩藻糖基转移酶（FUT8）小分子干扰RNA（siRNA）对肾小管上皮细胞转化生长因子（TGF）β-Smad2/3信号通路的影响。 方法 HK-2细胞共分为6组：正常组、阴性对照组、TGF-β1组、TGF-β1加FUT8干扰组、TGF-β1加阴性对照组、FUT8干扰组。利用外源性TGF-β1激活HK-2细胞TGF-β-Smad2/3信号通路。应用siRNA技术沉默FUT8。用免疫荧光方法测定细胞表面核心岩藻糖链表达;用免疫沉淀、凝集素免疫印迹以及免疫双染的方法测定FUT8基因沉默后TGF-βⅡ型受体（TGF-βRⅡ）、TGF-βⅠ型受体（ALK-5）的核心岩藻糖基化变化,并检测Smad2/3蛋白表达和磷酸化（p）-Smad2/3蛋白表达及其核转位的变化。 结果 与正常组及阴性对照组相比,加入5 μg/L的TGF-β1孵育HK-2细胞48 h,能显著上调 TGF-βRⅡ和ALK-5蛋白表达水平（P < 0.05）,导致p-Smad2/3表达水平明显升高（P < 0.05）,并促使其发生核转位。HK-2细胞表面存在核心岩藻糖链表达。与正常组及阴性对照组相比,TGF-β1孵育后,TGF-βRⅡ与ALK-5两种受体的核心岩藻糖链均显著升高（P < 0.05）,FUT8 siRNA能显著抑制TGF-βRⅡ与ALK-5核心岩藻糖链表达（P < 0.05）,从而抑制p-Smad2/3表达升高（P < 0.05）及其核转位,但不影响TGF-βRⅡ和 ALK-5的蛋白表达（P > 0.05）。 结论 在肾小管上皮细胞中,TGF-βRⅡ和ALK-5蛋白翻译后的核心岩藻糖基化修饰是它们发挥生物学功能所需要的,阻止TGF-βRⅡ和ALK-5的核心岩藻糖基化,能抑制TGF-β-Smad2/3信号转导通路的活化。     

siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响

[目的]探讨siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响。[方法]采用弯曲鼠尾法建立椎间盘退变模型。处死动物。取退变椎间盘组织分离培养髓核细胞。P1髓核细胞分为4组,分别为空白对照组、TRAIL-siRNA转染组(siTRAIL组)、TNF-α处理组(TNF-α组)和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组(TNF-α+siTRAIL组)。采用MTT法检测P1髓核细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]相较于空白对照细胞,TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05);TNF-α处理引发髓核细胞增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表达的影响(P0.05)。[结论] TRAIL siRNA转染可沉默TRAIL表达,从而逆转TNF-α诱导大鼠髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡和Caspase-3表达。