TNF-α对兔胆管成纤维细胞P311/TGF-β1/α-SMA通路的影响及川芎嗪的干预作用

目的:探讨TNF-α对兔胆管成纤维细胞P311/TGF-β1/α-SMA通路的影响及川芎嗪的干预作用。方法:分离、培养正常家兔胆管成纤维细胞并鉴定,将胆管成纤维细胞分别给予TNF-α、TNF-α联合不同浓度的TMP(0.08、0.4、2.0 mg/m L)干预48 h,以无处理的胆管成纤维细胞为空白对照,用CCK-8法检测细胞增殖水平;real-time PCR检测细胞P311、TGF-β1、α-SMA m RNA表达;Western blot检测细胞TGF-β1、α-SMA蛋白表达。结果:与空白对照比较,胆管成纤维细胞经TNF-α处理后,增殖明显增强,P311、TGF-β1、α-SMA m RNA以及TGF-β1、α-SMA蛋白表达明显上调(均P0.05);TMP对TNF-α的上述效应有抑制作用,并且呈现浓度依耐趋势,其中0.4、2.0 mg/m L的TMP有明显作用(均P0.05)。结论:TNF-α可能通过调控P311/TGF-β1/α-SMA信号通路促进胆管成纤维细胞增殖,TMP能抑TNF-α对该通路的活化,故可能对良性胆道狭窄有防治作用。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达的调控机制

目的研究转化生长因子-β1影响瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3、7mRNA表达的调控机制。方法用放线菌酮(CHX)和放线菌素D预处理KFB,以分别阻断KFB内源性蛋白质的合成及mRNA合成。采用逆转录PCR法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达水平。结果经CHX预处理后,KFB的Smad3mRNA表达轻度上调,并完全抑制了TGF-β1对KFBSmad3mRNA的下调作用(P<0.01);而CHX预处理对KFB的Smad7mRNA表达及TGF-β1上调Smad7mRNA的作用并无明显影响。经放线菌素D预处理后,随TGF-β1作用时间延长,KFB的Smad3mRNA表达水平无明显下降。结论TGF-β1对KFBSmad3mRNA表达的调控过程可能还需要细胞合成其他蛋白的参与;但对Smad7mRNA表达的调控则不需要细胞合成其他蛋白参与,KFB细胞中的Smad7可能也是活化的SMADs的直接靶基因。     

黄芪甲苷对紫外线诱导皮肤成纤维细胞表达TGFβ RⅡ与Smad7的影响

目的：探讨黄芪甲苷对紫外线诱导皮肤成纤维细胞TGFβRⅡ、Smad7mRNA以及蛋白质表达的影响。方法：培养原代人皮肤成纤维细胞,UVA及UVB分别照射人成纤维细胞,黄芪甲苷进行干预,MTT法检测细胞增殖活性,以ELISA法检测Smad7的生成量,半定量RT-PCR法检测TGFβRⅡ、Smad7的mRNA表达,Western blot法检测TGFβRⅡ的蛋白表达。结果：不同浓度的黄芪甲苷干预组与正常对照组相比,成纤维细胞增殖活性随浓度增加而增强,药物浓度为40μg/ml时最显著（P〈0.05）;UV辐射组与正常组相比,细胞上清液中Smad7蛋白含量明显增高,细胞内TGFβRⅡ的mRNA和蛋白表达均下降,Smad7mRNA表达增强;黄芪甲苷干预后,细胞上清液中Smad7蛋白含量下降,细胞内TGFβRⅡ的mRNA以及蛋白表达水平明显增高,Smad7mRNA表达下降（P〈0.05）。结论：黄芪甲苷可能通过提高成纤维细胞的增殖活性,上调TGFβRⅡmRNA、蛋白水平以及下调Smad7mRNA、蛋白水平的表达来对抗紫外线抑制TGF-β/Smad信号通路的传导,缓解皮肤光老化进程。     

氧化苦参碱抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成作用机制的初步研究

目的 研究氧化苦参碱抑制体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的作用机制.方法 将不同浓度的氧化苦参碱作用于人瘢痕疙瘩成纤维细胞,分别培养24、48、72h后,采用Western blot检测TGF-β/Smad信号转导通路中信号分子TGF-β1,TβRⅠ,TβRⅡ,Smad3,Smad4和Smad7的表达,对阳性信号分子采用RT-PCR进一步检测其mRNA的表达.结果 Western blot结果显示,不同浓度的氧化苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞中TGF-β1,TβRⅠ,TβRⅡ,Smad4和Smad7蛋白的表达无明显的影响,但是对Smad3蛋白表达具有明显抑制作用;RT-PCR结果显示,Smad3 mRNA的表达也受到明显抑制.结论 氧化苦参碱可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成,作用机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路中Smad3的表达.     

瘢痕疙瘩中Smads表达的研究

目的 探讨不同类型Smads在瘢痕疙瘩、正常瘢痕和正常皮肤中的差异表达及其意义.方法 采用RT-PCR和Western Blot法分别对10例瘢痕疙瘩、10例正常瘢痕及10例正常皮肤组织,以及体外培养瘢痕疙瘩、正常瘢痕及正常皮肤成纤维细胞中的Smads mRNA及蛋白的表达水平进行检测.用t检验比较其表达差异,P<0.05为差异具有统计学意义.结果 在瘢痕疙瘩组织及瘢痕疙瘩成纤维细胞中,Smad7的mRNA及蛋白水平表达明显低于正常瘢痕(P<0.05)和正常皮肤(P<0.05),而Smad2、3的mRNA及蛋白水平表达以及磷酸化的Smad2、3的蛋白水平表达并无明显改变(P>0.05).结论 在瘢痕疙瘩中,存在有Smad7的表达缺陷,这可能是增高的转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smads信号传导不能被自身负反馈循环终止的重要原因.     

TGF-β1在大鼠睾丸支持细胞的作用及对紧密连接的影响

目的:探讨TGF-β1在大鼠睾丸支持细胞增殖和凋亡中的作用以及对紧密连接相关蛋白基因表达的影响。方法:体外分离和培养大鼠睾丸支持细胞,分空白对照组、TGF-β1受体阻滞剂组、TGF-β1刺激组和TGF-β1+受体阻滞剂组共4组。CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;建立支持细胞原代双室培养模型,应用跨上皮电阻测定法(TER)检测单层细胞两侧跨细胞电阻值;RT-PCR和Western印迹检测支持细胞闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白1(ZO-1)和紧密连接蛋白Ⅱ(ClaudinⅡ)的相对表达量。结果:各组细胞增殖组间差异有统计学意义(F=5.05,P0.05),TGF-β1刺激组与空白对照组相比细胞增殖率增加(P0.05),而TGF-β1+受体阻滞剂组与TGF-β1刺激组相比细胞增殖率降低(P0.05)。各组细胞凋亡率组间差异无统计学意义(F=1.13,P0.05);各组细胞间TER差异有统计学意义(F=38.99,P0.01),与空白对照组比较TGF-β1刺激组TER降低(P0.01),与TGF-β1刺激组比较,TGF-β1+受体阻滞剂组和TGF-β1受体阻滞剂组细胞TER升高(P均0.01);各组支持细胞中ZO-1、ClaudinⅡmRNA及蛋白在各组中的表达量差异均无统计学意义(F_(mRNA)=0.49,0.93,P均0.05;F_(蛋白)=0.28,1.31,P均0.05),而Occludin mRNA及蛋白在各组中的表达量差异均有统计学意义(F_(mRNA)=6.86,F_(蛋白)=6.87,P均0.05);与空白对照组相比,TGF-β1刺激组Occludin mRNA及蛋白表达明显降低(P均0.01),而加入受体阻滞剂后,Occludin mRNA及蛋白表达明显回升(P均0.05)。结论:TGF-β1对睾丸支持细胞的增殖有促进作用,并能通过调节Occludin蛋白的表达而影响大鼠支持细胞间的紧密连接。     

TGF-β1对病理性瘢痕成纤维细胞中β-catenin表达的影响及意义

目的 探讨TGF-β/Smad信号转导通路与Wnt/β-catenin信号转导通路在病理性瘢痕发病机制中的作用及相互关系.方法 随机选取瘢痕疙瘩(K组)、增生性瘢痕(H组)和正常皮肤组织(N组)各3例,进行原代成纤维细胞培养,用不同浓度的TGF-β1处理细胞,应用免疫组化技术检测β-catenin在各组中的表达变化.结果 β-catenin在各组中的表达水平随TGF-β1浓度变化,呈先递增后递减趋势,三者β-catenin表达变化幅度为K组＜H组＜N组,K组成纤维细胞与H组成纤维细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05),而N组成纤维细胞与K组、H组成纤维细胞相比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 TGF-β/Smad信号转导通路与Wnt/β-catenin信号转导通路联合作用,导致病理性瘢痕形成.     

右归丸对骨性关节炎模型大鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响

目的分析右归丸对骨性关节炎大鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响。方法将64只成年SD大鼠利用随机数字表法分为4组,每组15只。正常组不做任何处理;模型组、右归丸组、抑制剂组采用经典的Hulth法建立膝骨性关节炎模型,造模6周后,右归丸组灌服20 g/(kg·d)的右归丸;抑制剂组腹腔注射100μg/(kg·d)的TGF-β1/Smads信号通路抑制剂SB431542,同时灌服20 g/(kg·d)的右归丸;模型组灌服等剂量的生理盐水,连续给药8周。末次给药24 h后取关节软骨组织,制作病理切片观察软骨病理改变,采用ELISA法检测软骨组织中肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β水平,免疫组化染色观察软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白与基质金属蛋白酶13(MMP-13)阳性表达,采用RT-PCR法检测软骨组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达,采用Western blot检测软骨组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达。结果与模型组比较,抑制剂组软骨组织Mankin评分降低(P0.05),软骨组织中肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β水平降低(P0.05),Ⅱ型胶原蛋白阳性表达升高(P0.05),MMP-13阳性表达降低(P0.05),TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达升高(P0.05),TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达升高(P0.05)。与抑制剂组比较,右归丸组软骨组织Mankin评分降低(P0.05),软骨组织中肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β水平降低(P0.05),Ⅱ型胶原蛋白阳性表达升高(P0.05),MMP-13阳性表达降低(P0.05),TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达升高(P0.05),TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达升高(P0.05)。结论右归丸对骨性关节炎大鼠软骨组织具有保护作用,其作用机制可能与TGF-β1/Smads信号通路有关。     

膀胱出口部分梗阻中转化生长因子β1/Smads信号通路的激活及低剂量紫杉醇的干预作用

目的探讨膀胱出口部分梗阻(BOO)后转化生长因子β1(TGF-β1)相关的Smads信号通路的激活及低剂量紫杉醇的干预作用。方法雌性Sprague-Dawley大鼠30只,随机分为空白对照组、BOO组和紫杉醇组。BOO组和紫杉醇组行尿道近端梗阻方式制备膀胱出口部分梗阻模型,空白对照组采用假手术方式处理。术后紫杉醇组给予低剂量紫杉醇腹腔注射(0.3mg/kg),每周2次。空白对照组与BOO组以等体积生理盐水同时间腹腔注射。4周后测量膀胱重量,行HE和Masson染色,并计算胶原纤维的含量;透射电镜观察逼尿肌超微结构改变;采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1、Smad 7和α-SMA mRNA的表达;免疫组织化学法检测TGF-β1、磷酸化Smad 2(p-Smad 2)和α-SMA蛋白的表达和分布。结果相比空白对照组,BOO组膀胱重量明显增加,胶原纤维增多,膀胱组织中TGF-β1和α-SMA mRNA表达水平增高(P0.05),TGF-β1、p-Smad 2和α-SMA蛋白表达增高(P0.05)。相比BOO组,紫杉醇组膀胱重量显著降低,胶原纤维面积比值下降(P0.05)。TGF-β1、pSmad 2和α-SMA的表达减少(P0.05),Smad 7表达上升(P0.05)。结论 TGF-β1相关的Smads信号通路的激活可能是BOO后膀胱纤维化的机制之一,低剂量紫衫醇可能通过阻断这一信号通路,在一定程度上有延缓BOO膀胱纤维化进程的作用。     

MicroRNA-200c通过TGF-β/Smad通路抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成

目的:探讨mi croRNA-200c(miR-200c)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的影响,并阐明其涉及的TGF-β/Smad通路机制。方法:将mi R-200c mi mics用oligofectami脂质体转染经TGF-β1诱导的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测细胞增殖变化;3H-脯氨酸掺入法测胶原蛋白水平的变化。相关蛋白表达变化和TGF-β1分泌表达变化分别用Western blot和ELISA法检测。结果:mi R-200c明显抑制经TGF-β1诱导的人瘢痕疙瘩纤维细胞的增殖和胶原合成;mi R-200c能明显减低磷酸化Smad2和Smad3的蛋白表达水平及抑制博莱霉素诱导的TGF-β1分泌。结论:miR-200c能明显抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成,其机制可能与抑制TGF-β/Smad通路相关。     

转化生长因子-β转导通路在良性胆管狭窄形成中的作用

目的 观察转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad/结缔组织生长因子(CTGF)通路中各因子在良性狭窄胆管组织中的表达,探讨其信号转导通路在良性胆管狭窄形成机制中的作用.方法 采用免疫组织化学SABC法和原位杂交法检测TGF-β1,TGF-β受体I(TβR Ⅰ),TGF-β受体Ⅱ(TβRⅡ),Smad4,Smad7,CTGF蛋白以及CTGF mRNA在23例良性胆管狭窄组织及6例正常胆管组织中的表达,分别计算阳性表达率,并分析TGF-β1,Smad4及CTGF之间的相关性.结果 TGF-β1、TβR Ⅰ、TβRⅡ、Smad4、CTGF蛋白和CTGFmRNA在23例胆管良性狭窄患者中的阳性表达率分别为91.3%、82.6%、87.O%、78.3%、82.6%、65.2%,高于其在6例正常胆管中的表达且差异有统计学意义(P＜0.05),Smad7在胆管良性狭窄患者中的阳性表达为70.0%,与正常胆管比较升高但差异无统计学意义(P＞0.05).TGF-β1、Smad4及CTGF在良性狭窄胆管的阳性表达呈正相关.结论 TGF-β1/Smad/CTGF信号转导通路高表达是导致良性胆管狭窄形成的重要因素.     

前列消汤干预TGF-β1/Smad4、Smad 7信号通路调控实验性自身免疫性前列腺炎小鼠前列腺成纤维细胞增殖与凋亡的研究

目的:观察中药方前列消汤干预TGF-β1/Smad4、Smad 7信号转导通路对实验性自身免疫性前列腺炎(EAP)小鼠前列腺成纤维细胞(PrF)增殖与凋亡的调控作用。方法:采用C57BL/6小鼠制备前列消汤含药血清,根据细胞毒性实验结果,以5%、10%、20%的含药血清分别作为低、中、高剂量组进行干预实验。采用"免疫诱导+中医病因造模法"建立湿热证EAP小鼠模型,无菌条件下取出前列腺组织,分离培养PrF,采用差速贴壁法纯化PrF,免疫荧光法检测PrF纯度,纯度达90%以上即以5 ng/ml TGF-β1浓度的培养液刺激进行建模。取建模后对数生长期的PrF随机分为空白组(无血清培养液),模型组,阳性对照组(含TGF-β1浓度5 ng/ml的培养液),前列消汤低、中、高剂量组,每组6个复孔;干预培养24 h后检测各组PrF增殖情况,采用Western印迹检测TGF-β1的表达水平和Smad4、Smad7、p-Smad4、p-Smad7的表达水平,qPCR检测TGF-β1、Smad4、Smad7 mRNA的表达,流式细胞术检测PrF细胞凋亡情况。结果:经TGF-β1诱导后,与模型组比较,阳性对照组PrF细胞增殖明显(P0.05),前列消汤低、中剂量组PrF细胞增殖受抑制(P0.05),前列消汤高剂量组PrF细胞增殖受明显抑制(P0.01);与阳性对照组比较,前列消汤各剂量组PrF细胞增殖明显受到抑制(P0.01),且呈明显的量效关系。与模型组比较,阳性对照组Smad4、p-Samd7和TGF-β1蛋白表达显著增加(P0.05);经前列消汤含药血清干预后,与阳性对照组比较,前列消汤含药血清能显著下调PrF细胞内p-Smad4,TGF-β1蛋白的表达(P0.01),而增加p-Samd7的表达水平(P0.01)。qPCR结果显示,与模型组相比,前列消汤高剂量组Smad4基因表达有显著差异(P0.05),前列消汤低、中、高剂量组Smad7基因表达有显著差异(P0.05);前列消汤低、中、高剂量组TGF-β1基因表达水平显著上调(P0.01);与阳性对照组相比,前列消汤高剂量组Smad4基因表达有显著差异(P0.05),模型组、前列消汤低、中、高剂量组Smad7基因表达有显著差异(P0.01),前列消汤低、中、高剂量组TGF-β1基因表达水平显著下降(P0.01)。与模型组比较,阳性对照组PrF细胞凋亡率无明显差异(P0.05),前列消汤各剂量组凋亡率均显著提高(P0.05),且呈明显的量效关系。结论:经TGF-β1诱导可刺激PrF细胞增殖,上调TGF-β1、p-Smad4的表达,下调p-Smad7的表达。前列消汤可以抑制PrF增殖,且呈明显的量效关系,其机制可能与其降低TGF-β1和p-Smad4的表达、提高p-Smad7的表达从而阻断TGF-β1通过Smad4途径诱导PrF细胞增殖相关。     

TGF-β/Smads通路关键蛋白在5种前列腺癌细胞株中表达的鉴定及意义

目的:对多种不同人前列腺癌细胞株TGF-β/Smads信号通路的"开放"或"关闭"状态进行鉴定,初步探讨此通路在前列腺癌侵袭、转移中的作用及可能的机制。方法:用Western印迹法检测LNCaP、PC-3、DU145及AR-CaP亚细胞系IF11、IA8细胞中TGF-β/Smads通路的关键蛋白TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)、Smad2/3、磷酸化Smad2(p-Smad2)、Smad4的差异表达。结果:TβRⅡ在PC-3、DU145、IF11、IA8中表达较高,在LNCaP中表达极低;Smad2/3在所有细胞中表达均较高,但活性成分p-Smad2仅在PC-3、DU145中表达;Smad4在LNCaP、PC-3、DU145中表达较高,IF11、IA8中表达缺失。结论:不同转移潜能的前列腺癌细胞株TGF-β/Smads通路的"开闭"状态存在差异,仅PC-3、DU145细胞处于开放状态;前列腺癌细胞可能通过不同的方式改变TGF-β/Smads通路状态参与晚期肿瘤的侵袭、转移过程。     

MicroRNA-200c通过TGF-β/Smad通路抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成

目的:探讨microRNA-200c(miR-200c)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的影响,并阐明其涉及的TGF-β/Smad通路机制。方法:将miR-200c mimics用oligofectami脂质体转染经TGF-β1诱导的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测细胞增殖变化;3H-脯氨酸掺入法测胶原蛋白水平的变化。相关蛋白表达变化和TGF-β1分泌表达变化分别用Western blot和ELISA法检测。结果:miR-200c明显抑制经TGF-β1诱导的人瘢痕疙瘩纤维细胞的增殖和胶原合成;miR-200c能明显减低磷酸化Smad2和Smad3的蛋白表达水平及抑制博莱霉素诱导的TGF-β1分泌。结论:miR-200c能明显抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成,其机制可能与抑制TGF-β/Smad通路相关。     

肿瘤相关成纤维细胞培养液上清促进肿瘤细胞增殖和血管生成的研究

目的 探讨在体外实验条件下,肿瘤相关成纤维细胞如何通过旁分泌机制促进肿瘤细胞的增殖和血管生成.方法 分别提取原代卵巢癌相关成纤维细胞(TAFs)与正常卵巢相关成纤维细胞(N Fs)的培养液上清(CM);实验组为2ml TAFs-CM处理卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105/孔),对照组为2 ml NFs-CM处理卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105/孔),空白组为正常培养的卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105个/孔),干预组为在实验组中加入20 μmol转化生长因子-β(TGF-β)特异性小分子抑制剂SB-431542(10 μmol/ml);应用流式细胞仪分析各组细胞生长周期;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达,Western blot法检测各组细胞TGF-β1、α-SMA、VEGF蛋白的表达.结果 实验组卵巢癌细胞增殖较对照组显著增加(细胞S期比例:实验组22.10±1.84比对照组12.77±1.43,P＜0.05);而加入SB431542干预后则可明显抑制促增殖作用(细胞S期比例:干预组12.33±1.12比实验组22.10±1.84,P＜0.05);RT-PCR提示实验组PCNA、α-SMA、VEGF mRNA较其他组表达显著上调(P＜0.05),Western blot结果提示实验组TGF-β1、α-SMA、VEGF蛋白表达亦显著上调(P＜0.05),在加入SB-431542后以上基因及蛋白的表达均受到抑制(P＜0.05).结论 卵巢癌相关成纤维细胞可以通过旁分泌机制促进卵巢癌细胞的增殖,并上调血管生成相关基因及蛋白的表达,而通过抑制TGF-β信号通路作用后则可以有效抑制这类作用.     

Smad锚着蛋白在糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化中的作用及机制研究

目的 研究Smad锚着蛋白(SARA)在高葡萄糖诱导的HK-2细胞转分化中的作用及相关机制.方法 用高浓度葡萄糖(30 mmol/L D-葡萄糖)刺激HK-2细胞,分别采用细胞免疫荧光、Western印迹及实时定量PCR等方法检测HK-2细胞波形蛋白(vimentin)、紧密连接蛋白(ZO-1)、SARA、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2及Smad3的表达.分别转染全长SARA质粒[SARA (WT)]及敲除SBD结构域的SARA质粒[SARA(dSBD)],检测转染后高糖诱导的HK-2细胞Vimentin、ZO-1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3表达的变化.结果 高糖刺激时,HK-2细胞出现转分化 ;ZO-1蛋白和mRNA表达呈时间依赖性下调 ;vimentin蛋白和mRNA表达呈时间依赖性上调,而SARA蛋白和mRNA表达呈时间依赖性下调 ;TGF-β1、Smad3蛋白和mRNA表达呈时间依赖性上调 ;Smad2 mRNA表达呈时间依赖性上调,而其蛋白表达呈时间依赖性下调 ;Smad2和Smad3磷酸化,Smad3活化时间更长.与高糖刺激组相比,转染全长SARA质粒[SARA (WT)]过表达SARA使HK-2细胞ZO-1表达上调(P＜0.05) ;vimentin表达下调(P＜0.05) ;Smad2蛋白表达上调,但mRNA表达无明显变化 ;Smad2活化时间延长.转染SARA(dSBD)质粒对高糖诱导的HK-2细胞ZO-1、vimentin、Smad2的表达无影响,对Smad2和Smad3的磷酸化亦无明显影响.结论 高糖诱导的HK-2细胞转分化过程中,TGF-β1信号通路活化,SARA的表达下调.过表达SARA可能通过上调Smad2的蛋白表达,延长Smad2活化时间,从而抑制TGF-β1信号传导,进而抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化进程.     

加味当归补血汤对肾小管上皮细胞TGF-β1／SMADs信号转导通路的影响

目的：观察加味当归补血汤对转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的小鼠肾小管上皮细胞Smad3、Smad4、Smad7信号通路的影响，探讨该方防治肾间质纤维化的细胞分子生物学机制。方法：原代培养BalB／C小鼠肾小管上皮细胞．用TGF-β（1ng／ml）刺激24h，加味当归补血汤及洛汀新含药血清干预。共分6组：正常组、模型组、加味当归补血汤低中高剂量组（含药血清浓度分别为2．5％、5％、10％）、洛汀新组，观察各组细胞形态学变化，检测细胞Smad3、Smad4、Smad7的mRNA和蛋白质表达情况（PT—PCR、Western-Blotting）。结果：（1）TGF-β1刺激后，肾小管上皮细胞部分形态发生变大，伸长，呈梭形，经中药加味当归补血汤和洛汀新干预后，细胞形态又恢复正常；（2）TGF-β1刺激肾小管上皮细胞后，Smad3、Smad4 mRNA和蛋白质表达显著增加，Smad7 mRNA和蛋白质则显著减少（P〈0、05～0、01）；（3）各浓度加味当归补血汤能显著下调异常增高的Smad3，上调Smad7的基因和蛋白质表达水平（P〈0．05～0．01），能显著下调Smad4基因表达。结论：加味当归补血汤防治肾间质纤维化可能与调控肾小管上皮细胞TGF-β1／Smads信号转导途径相关。     

转化生长因子-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达的影响

研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3、7mRNA表达的影响。方法：用RT-PCR法分别检测TGF-β1不同浓度(0，5，50，500pmol／1：Smad3 mRNA 24h，smad7 mRNA 90min)和TGF-β1(500pmol／1)作用不同时间(Smad3 mRNA：1，2，4，24，48h；Smad7 mRNA：0．5，1，1，5，2，4，24h)对Smad3、7mRNA表达的影响。结果：Smad3 mRNA水平随TGF-β1浓度的增加而呈浓度依赖性下降；5pmol／lTGF-β1就能使Smad7 mRNA水平明显地升高，并随TGF-β1浓度加大而略有改变；随作用时间延长，Smad3mRNA水平逐渐下降，在作用48h后下降到最低，呈时间依赖性。而Smad7 mRNA水平在细胞受到TGF-β1刺激后l20min即达到最高值。结论：TGF-β1能使KFB细胞Smad3 mRNA发生配体依赖性的下调，而使Smad7 mRNA表达迅速增加。     

Smad4在TGF-β诱导人胆管癌细胞上皮-间质转化中的作用

目的 探讨Smad4在TGF-β诱导人胆管癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用.方法 用转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理RBE人胆管癌细胞系24h后,观察其形态变化,采用Western Blotting检测TGF-β1处理0h、12h、24h、48h后RBE细胞N-钙黏蛋白(N-cadherin)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达.通过RNA干扰技术建立稳定干扰Smad4表达的细胞系,在无TGF-β1处理或TGF-β1处理24h后,观察Smad4干扰组与野生型组和空载体组细胞的形态差异,Western Blotting检测各组N-cadherin和E-cadherin的表达水平.结果 TGF-β1诱导RBE细胞的形态由上皮样向间质样转变,促进 N-cadherin表达增加和E-cadherin表达降低.在无TGF-β1处理时,Smad4干扰组细胞比野生型组和空载体组细胞的形态更趋于上皮样,E-cadherin表达水平也显著高于野生型组和空载体组(P＜0.05).在TGF-β1处理24h后,Smad4干扰组细胞形态的间质样变化程度、N-cadherin表达量明显低于野生型组和空载体组(P＜0.05);野生型组和空载体组细胞E-cadherin的表达缺失,而Smad4干扰组细胞仍表达较高水平的E-cadherin,两者间差异显著(P＜0.05).结论 TGF-β依赖Smad4介导人胆管癌细胞发生上皮-间质转化.     

淫羊藿和女贞子配伍对绝经后骨质疏松症大鼠TGF-β1/Smads信号通路的实验研究

目的 研究淫羊藿和女贞子配伍对绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMOP）大鼠转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β1/Smads信号通路的影响。方法 将48只SPF级8月龄雌性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、淫羊藿组、女贞子组、淫羊藿和女贞子配伍组（配伍组）、雷洛昔芬组。对大鼠行双侧卵巢切除术造模,术后1周开始给予相应的药物治疗至术后13周结束。运用酶免法检测血清TGF-β1含量、蛋白免疫印迹法（western blot,WB）和免疫荧光法（immunofluorescence staining,IF）检测骨组织中TGF-β1、p-Smad2/3和Smad7蛋白表达,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）法检测骨组织中TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达。结果 与模型组比较,淫羊藿、女贞子配伍组能增加大鼠血清TGF-β1含量（P<0.05）,上调骨组织中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表达和TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达（P均< 0.01）,下调骨组织中Smad7的mRNA和蛋白表达（P均< 0.01）,且配伍组对上述指标的调节作用优于淫羊藿或女贞子单用。结论 淫羊藿和女贞子配伍可以调节PMOP大鼠TGF-β1/Smads信号通路中细胞因子的表达,从而调节骨代谢。