TRPC6在TGF-β1诱导的体外培养肾小球足细胞损伤中的表达及其高表达对nephrin、desmin表达的影响

目的体外研究经典瞬时受体电位通道6(TRPC6)在TGF-β1诱导的肾小球足细胞损伤中的表达变化及其高表达对足细胞nephrin、desmin表达的影响。方法以肾小球足细胞株(MPC5)为研究对象,以不同质量浓度(0、4、8、12 ng/ml)TGF-β1刺激足细胞,干预72 h后用免疫荧光、Real-time PCR、Wstern blot检测TRPC6的分布及m RNA和蛋白表达。再将MPC5细胞分组,应用12 ng/ml TGF-β1处理各组细胞,分别于0、24、48、72 h应用免疫荧光、Real-time PCR、Western blot检测TRPC6的分布及m RNA和蛋白表达。用脂质体法将小鼠TRPC6真核表达载体p EX-3-TRPC6及对照质粒空载体p EX-3-NC转染足细胞,48 h后应用Western blot检测转染后TRPC6蛋白水平评估传染效率;同时应用免疫荧光、Real time RT-PCR及Western印迹方法检测转染后nephrin、desmin分布及表达的变化。结果与正常对照组相比,倒置显微镜下TGF-β1干预后足细胞足突融合、回缩,当TGF-β1增加至16 ng/ml时足突甚至消失。TGF-β1作用能使足细胞TRPC6表达及分布发生变化,当TGF-β1质量浓度为4 ng/ml,干预72 h后与对照组相比TRPC6 m RNA和蛋白含量即升高,但差异无统计学意义,当TGF-β1质量浓度提高到为8、12 ng/ml时TRPC6 m RNA和蛋白含量明显升高(P0.05),并呈剂量依赖性。应用12 ng/ml干预24 h,与对照组相比,TRPC6m RNA和蛋白含量即升高,但差异无统计学意义,当干预时间延长至48、72 h时TRPC6 m RNA和蛋白含量明显升高(P0.05),并呈时间依赖性。p EX-3-TRPC6转染48 h后足细胞TRPC6蛋白表达水平明显增高(P0.05),nephein分布未发生变化,但表达量在m RNA及蛋白水平分别下降25%及42%左右(P0.05),desmin分布发生改变,表达量在m RNA及蛋白水平分别升高132%及116%左右(P0.05)。结论 TGF-β1可诱导足细胞TRPC6分布变化且表达上调,TRPC6高表达可影响nephrin、desmin表达及desmin的分布,这可能是TRPC6参与足细胞损伤的机制之一。     

TRPC1在TGF-β1诱导支气管上皮细胞间充质转化中的作用

目的:探究经典瞬时受体电位通道1(TRPC1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)间充质转化(EMT)中的作用。方法:以16HBE细胞株为研究对象,免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测16HBE细胞EMT过程中TRPC1 mRNA和蛋白的表达;Western blotting检测TRPC1阻断剂和siRNA干扰对16HBE细胞EMT的影响。结果:(1)TGF-β1刺激后细胞形态明显改变,E-钙黏蛋白表达减少(P0.01),而α-SMA蛋白表达增加(P0.05)。(2)TRPC1广泛存在于16HBE细胞,且TGF-β1刺激后TRPC1 mRNA和蛋白的表达增加(P0.05)。(3)与TGF-β1组相比,阻断剂和TGF-β1共同作用组或siRNA和TGF-β1共同作用组细胞形态改变受抑制,E-钙黏蛋白和α-SMA蛋白表达受抑制(P0.05)。结论:TGF-β1诱导16HBE细胞发生EMT,其机制可能与其上调16HBE细胞TRPC1有关。     

氯喹对体外活化肝星状细胞自噬与胶原代谢的影响

目的:研究不同浓度的自噬抑制剂氯喹(CQ)对活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响及可能机制。方法:应用转化生长因子β1(TGF-β1)活化HSC-T6细胞,给予CQ干预24 h。实验分组为:control组、TGF-β1组、TGF-β1+CQ(15μmol/L)组、TGF-β1+CQ(30μmol/L)组和TGF-β1+CQ(60μmol/L)组。采用Western blot技术检测微管相关蛋白轻链3(LC3)比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬靶蛋白P62、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)和TIMP-2的表达情况;免疫细胞化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;RT-q PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2mRNA的表达变化。结果:CQ干预后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高且呈剂量依赖性;P62蛋白表达TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组(P0.01)。TGF-β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量较control组显著增加,TGF-β1+CQ组较TGF-β1组也有明显增加。α-SMA的表达在TGF-β1组和TGF-β1+CQ组均显著高于control组(P0.05),而TGF-β1组和TGF-β1+CQ各组之间无显著差异。MMP-13表达在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著下降(P0.05);TIMP-1和TIMP-2在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著升高(P0.05),且呈剂量依赖性。结论:自噬抑制剂CQ能显著增加HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达并呈剂量依赖性,这可能与其上调TIMP-1及TIMP-2的表达并抑制MMP-13表达有关。     

IL-22经Wnt/β-catenin通路抑制肝星状细胞致纤维化作用

目的:研究IL-22抑制HSC致肝纤维化的作用和机制,探索Wnt/β-catenin通路在肝星状细胞(HSC)激活过程中的作用。方法:采用TGF-β1激活HSC,荧光定量PCR和Western blot检测细胞激活过程中β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表达变化情况。应用不同浓度和不同时间的重组大鼠IL-22刺激大鼠HSC,CCK8法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率。采用TGF-β1预处理HSC,再用最适浓度IL-22干预,对比干预前后HSC增殖情况,并检测β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表达变化情况。结果:TGF-β1激活HSC后,β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P0.05)。IL-22以浓度依赖性和时间依赖性抑制HSC增殖(P0.05),并降低β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表达水平(P0.05),但对HSC凋亡率无显著影响(P0.05)。IL-22可以显著抑制TGF-β1诱导的HSC激活,并显著降低β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表达水平(P0.05)。结论:Wnt/β-catenin参与了HSC激活和分泌α-SMA过程,IL-22以浓度依赖性和时间依赖性抑制HSC活性,这种作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路实现的。     

基于siRNA技术的TRPC6基因沉默对血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞自噬和凋亡的影响

目的采用小分子干扰RNA(siRNA)干扰技术沉默足细胞相关分子瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的自噬和凋亡的影响。方法设计、构建siRNA,转染足细胞,使TRPC6基因沉默,采用流式细胞术、激光共聚焦、透射电镜及Western Blot技术检测不同浓度siRNA转染后TRPC6基因表达,优化获得TRPC6基因沉默最佳效果的条件。体外培养小鼠肾小球足细胞,设立对照组、AngⅡ组、空载体组、沉默TRPC6基因组和AngⅡ+沉默TRPC6基因组。对照组用含0.02%DMSO的RPMI 1640培养液培养;AngⅡ组加入AngⅡ(10~(-8)M)刺激足细胞;空载体组加入空载体至足细胞;沉默TRPC6基因组运用siRNA干扰技术沉默TRPC6基因;AngⅡ+沉默TRPC6基因组同时加入AngⅡ(10~(-8)M)及沉默TRPC6基因。处理12、24 h和48 h后分别收集细胞,采用流式细胞仪检测足细胞凋亡率,Western Blot检测TRPC6及自噬相关蛋白的表达,透射电镜及激光共聚焦电子显微镜观察自噬相关蛋白的分布。结果自噬在正常足细胞的表达量很微弱,AngⅡ组足细胞凋亡率明显升高,沉默TRPC6使足细胞凋亡率明显降低,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。透射电镜下AngⅡ组示足细胞超微结构发生改变,自噬表达增加,胞质中出现独立双层膜结构,胞质成分及溶酶体等细胞器形成双层及多层膜结构的自噬体。沉默TRPC6使自噬表达下降,与AngⅡ组比较差异有统计学意义(P0.05)。激光共聚焦检测AngⅡ组LC3-Ⅱ的表达增加,沉默TRPC6使LC3-Ⅱ表达趋于稳定,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论AngⅡ促进足细胞的凋亡,沉默TRPC6基因能有效保护AngⅡ诱导的肾小球足细胞损伤,发挥保护足细胞的作用。     

TRPC6在IL-1β诱导类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖中的作用

目的:应用RNA干扰技术研究瞬时受体电位通道6(TRPC6)对IL-1β诱导的类风湿关节炎(RA)成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)增殖的影响。方法:RT-qPCR法检测RA和骨关节炎(OA)患者滑膜组织中TRPC6 mRNA的表达水平。组织块联合酶消化法培养RA-FLS。流式细胞术鉴定RA-FLS。将不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16μg/L)的重组人IL-1β与RA-FLS共培养36 h,CCK-8法检测细胞活力的改变;16μg/L的IL-1β作用RA-FLS不同时间(12、24、36、48、60、72 h),CCK-8法检测细胞活力的改变。特异性TRPC6-siRNA转染RA-FLS后,采用RT-qPCR和Western blotting检测沉默效率。在IL-1β存在和不存在的条件下,CCK-8法、Ed U标记法和流式细胞术检测TRPC6干扰组与对照组的细胞活力、Ed U阳性细胞比率和(G_2/M+S)期比率的差异。结果:RA患者滑膜组织中TRPC6的mRNA表达水平相对于OA患者明显增加(P0.05)。TRPC6-siRNA能显著降低RA-FLS中TRPC6 mRNA和蛋白的表达(P0.05)。IL-1β能诱导RA-FLS增殖(P0.05)。沉默TRPC6后,在IL-1β的诱导环境下,特异性干扰组RA-FLS的活力、Ed U阳性细胞比率和(G_2/M+S)期比率与空白组和对照组相比均明显降低(P0.05),而在不含IL-1β的条件下,干扰组与空白组和对照组相比差异均无统计学显著性。结论:TRPC6参与IL-1β诱导的RA-FLS增殖过程,沉默TRPC6能降低IL-1β诱导的RA-FLS增殖水平。     

5-氟尿嘧啶抑制TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞间质化

目的探讨5-氟尿嘧啶对TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞间质化的抑制作用,并探讨其作用机制。方法原代培养人肝内胆管上皮细胞,角蛋白19荧光染色鉴定;细胞分为:对照(normal)组,TGF-β1(TGF-β1)组,5-氟尿嘧啶(TGF-β1+5-FU)组;免疫荧光染色观察CK-19、E-cadherin、vimentin和α-SMA标记蛋白;Western blot检测细胞标记蛋白及TGF-β1表达量;Real-time PCR检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA含量。结果原代培养的人肝内胆管上皮细胞呈多边形或者锥形,CK-19荧光染色为胞质着色;TGF-β1诱导72 h后,胆管上皮出现间质化表现,与正常组比较,vimentin、α-SMA和TGF-β1表达明显增强(P0.05),CK-19和E-cadherin表达显著减弱(P0.05),Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA含量显著升高(P0.05);5-FU抑制胆管上皮间质化,与TGF-β1组比较,CK-19和E-cadherin表达增强(P0.05),vimentin、α-SMA和TGF-β1表达明显减弱(P0.05),TGF-β1 mRNA和Ⅲ型胶原mRNA含量明显降低(P0.05)。结论 5-FU通过下调TGF-β1的表达抑制胆管上皮细胞间质化。     

福辛普利和缬沙坦抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞klotho基因表达下调

目的探讨福辛普利(Fos)和缬沙坦(Val)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)抑制NRK-52E细胞klotho基因表达的干预作用及klotho与转化生长因子-β1(TGF-β1)的关系。方法将大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为对照组、AngⅡ(10-7mol/L)组、AngⅡ分别再加Fos(10-5mol/L)组、Val(10-5mol/L)组和Fos+Val组,培养24 h后,用反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测klotho和TGF-β1mRNA表达;用免疫组织化学法和Western blot检测klotho和TGF-β1蛋白表达。对klotho和TGF-β1蛋白表达进行直线相关分析。结果 (1)AngⅡ诱导NRK-52E中TGF-β1mRNA表达上调,同时使klothomRNA表达下调,经Fos或Val或Fos+Val干预后,TGF-β1mRNA表达明显受抑制,而klothomRNA显著上调表达(P<0.05)。(2)Fos、Val和Fos+Val均明显上调AngⅡ诱导的klotho蛋白低表达(P<0.05),同时抑制TGF-β1蛋白高表达(P<0.05)。(3)klotho和TGF-β1蛋白表达呈...     

高迁移率族蛋白1 在钬激光致输尿管狭窄患者中的作用及甘草酸苷的 体外抑制研究

目的:探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)在钬激光致输尿管狭窄患者中的作用及甘草酸苷的体外抑制效应。方法:选取28例钬激光致输尿管狭窄患者作为研究对象,均行输尿管狭窄段切除术,荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测输尿管狭窄段组织中HMGB1、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA水平,Pearson法分析HMGB1与各因子的相关性。将人输尿管上皮SV-HUC-1细胞随机分为3组,即对照组、钬激光组、钬激光+甘草酸苷组。照射48 h后,Western blot检测HMGB1及下游TLR4/NFκB信号通路的表达;ELISA检测上清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白的含量;免疫荧光染色检测E-cadherin和Vimentin表达情况。结果:HMGB1 mRNA表达与IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA水平呈正相关(P0.05)。对照组、钬激光+甘草酸苷组细胞中HMGB1、TLR4、p-NFκB蛋白表达量均低于钬激光组(P0.05)。对照组、钬激光+甘草酸苷组细胞上清液中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白含量均低于钬激光组(P0.05)。与钬激光组相比较,对照组、钬激光+甘草酸苷组细胞E-cadherin荧光强度明显增强,Vimentin荧光强度明显减弱。结论:在钬激光致输尿管狭窄患者的输尿管组织中,HMGB1表达与促炎及促纤维化因子水平呈正相关。在钬激光照射输尿管上皮细胞的体外模型中,甘草酸苷可抑制HMGB1及其下游TLR4/NFκB信号通路的激活,下调炎症及纤维化因子的表达,抑制细胞发生上皮间质转化。     

ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨ERK通路是否参与TGF-β/Smad 通路诱导的血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组：(1)对照组;(2)TGF-β1组;(3)ERK阻断剂(PD98059)组;(4)TGF-β1+ ERK阻断剂(PD98059)组。MTT法测细胞的增殖活性,Western blotting法检测VSMCs中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及相关磷酸化蛋白含量,RT-PCR方法测VSMCs中Smad2、3、7mRNA的表达。结果: (1)各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均低于对照组 (P＜0.05),TGF-β1+ ERK阻断剂组与TGF-β1组相比无显著差异。（2）与对照组相比,TGF-β1组p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白含量和Smad7蛋白表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组则明显降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组降低 (P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无显著差异。(3)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组表达降低(P<0.05)。各组内VSMCs 的Smad2、Smad3 mRNA表达无显著差异。结论: (1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。     

激活法尼酯X受体上调核心蛋白聚糖表达对肾小管上皮细胞转分化的作用

目的研究激活法尼酯X受体(FXR)对核心蛋白聚糖(decorin)表达的变化及其对肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响。方法 (1)采用不同浓度的FXR特异性激动剂CDCA及拮抗剂Guggulsterones处理肾小管上皮细胞(HK-2),观察decorin的mRNA和蛋白表达的变化;(2)将HK-2细胞分为对照组,TGF-β1诱导组(20 ng/ml),TGF-β1诱导加CDCA组(100μmol/L)和TGF-β1诱导加CDCA、Guggulsterones共处理组,48 h后观察各组细胞的形态变化,检测各组decorin、E-cadherin和α-SMA的mRNA和蛋白表达的情况。结果 (1)CDCA激活HK-2细胞FXR,decorin的mRNA和蛋白表达升高,且呈剂量依赖。在100μmol/L CDCA和不同浓度Guggulsterones共处理HK-2细胞,随着Guggulsterones浓度升高,decorin的mRNA和蛋白表达逐渐减低;(2)RT-PCR和Western blot显示,decorin在对照组、TGF-β1组无表达,在TGF-β1+CDCA组明显上调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著下降;E-cadherin在对照组高表达,在TGF-β1组显著下调,在TGF-β1+CDCA组显著上调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著下降;α-SMA在对照组无表达,在TGF-β1组显著上调,在TGF-β1+CDCA组显著下调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著上调。结论 CDCA激活肾小管上皮细胞FXR能够通过上调decorin的表达,从而抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化。     

1,25（OH）2D3对甲状旁腺素诱导的肾小管上皮细胞转分化和TGF-β1的表达的影响

目的:探讨1,25(OH)2D3对甲状旁腺素(PTH)诱导的肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)培养在含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液中。对照组:加入等体积含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液;PTH刺激组:加入终浓度为10-10 mol/L PTH的含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液;PTH+1,25(OH)2D3干预组:加入10-10 mol/L PTH,同时加入不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L)的1,25(OH)2D3。刺激HK-2细胞48 h。半定量RT-PCR法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和TGF-β1的基因表达;Western blot法检测细胞中α-SMA和TGF-β1的蛋白表达;免疫细胞化学法检测细胞中α-SMA的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1的含量。结果:半定量RT-PCR结果显示,对照组HK-2细胞中几乎无α-SMA的mRNA表达,仅有少量的TGF-β1 mRNA表达;PTH刺激组α-SMA和TGF-β1mRNA表达量与对照组比较明显增加;PTH+1,25(OH)2D3干预组表达量比PTH刺激组显著降低,且随着1,25(OH)2D3浓度的升高呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。Western blot结果显示,对照组HK-2细胞中无α-SMA的蛋白表达,仅有少量的TGF-β1蛋白表达;10-10 mol/L的PTH能够明显诱导HK-2细胞中α-SMA的蛋白表达,增加TGF-β1的蛋白表达量;PTH+1,25(OH)2D3干预组,α-SMA和TGF-β1的蛋白表达量比PTH刺激组显著降低(P<0.05)。免疫细胞化学法结果显示,对照组几乎无α-SMA阳性表达的细胞,PTH刺激组可见大量细胞α-SMA表达阳性;PTH+1,25(OH)2D3干预组α-SMA表达阳性的细胞数明显低于PTH刺激组(P<0.05)。ELISA结果显示,对照组细胞上清液中可检测到少量的TGF-β1,PTH刺激组含量显著升高,PTH+1,25(OH)2D3干预组与PTH刺激组比较含量明显降低(P<0.05)。结论:1,25(OH)2D3能够部分拮抗PTH诱导的HK-2细胞转分化和TGF-β1的表达。     

HMGB1RNAi抑制TGF-β1诱导的A549细胞系EMT

目的探讨HMGB1在肺泡上皮细胞间质转分化中的作用。方法设计并合成针对HMGB1的小干扰RNA(siRNA),体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞系细胞-A549细胞,将细胞分为4组:1)对照组,2)TGF-β1刺激组,3)RNAi组(TGF-β1+HMGB1 siRNA),4)RNAi阴性对照组(TGF-β1+siRNA阴性对照);倒置相差显微镜观察细胞形态学;RT-PCR法检测HMGB1和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达;Western blot法检测α-SMA和HMGB1蛋白表达。结果 TGF-β1刺激组细胞HMGB1和α-SMA的mRNA和蛋白表达均较对照组显著增加(P0.01);RNAi组HMGB1、α-SMA mRNA和蛋白表达均较正常对照组显著下降(P0.01)。结论 HMGB1可能参与了TGFβ1诱导的肺泡上皮细胞转分化。     

TGF-β1诱导大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化及上皮间质转换

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)活化及上皮间质转换(EMT)中的作用。方法体外培养HSC-T6,用MTT法筛选TGF-β1对HSC-T6作用的最佳浓度;用10μg/L TGF-β1处理HSC-T6 24 h,相差倒置显微镜下观察细胞形态改变,免疫荧光染色法检测细胞骨架结构F-actin蛋白的表达,RT-q PCR法检测肌动蛋白α-SMA及代表上皮间质转换的神经黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和上皮黏附素(E-cadherin)基因表达;用不同浓度(0、5和10μg/L)的TGF-β1处理HSC-T6 24 h,Western blot检测α-SMA、N-cadherin、vimentin和E-cadherin蛋白表达。结果 10μg/L TGF-β1干预HSC-T6 24 h有最好的细胞存活率;TGF-β1刺激HSC-T6后,细胞拉伸,伪足增多呈星形,细胞间连接疏松,呈显著活化状态;F-actin聚集形成应力纤维丝,沿细胞长轴分布;实验组α-SMA mRNA及vimentin mRNA的表达量明显高于对照组(P0.05),而E-cadherin mRNA的表达量明显降低(P0.05);在不同浓度的TGF-β1呈剂量依赖性致α-SMA及N-cadherin和vimentin的蛋白表达量增多,而E-cadherin的蛋白表达量减少。结论 TGF-β1可诱导HSC-T6活化及上皮间质转换。     

TRIM31 过表达改善脂多糖诱导下神经细胞的炎症损伤

目的:探讨E3泛素连接酶31(TRIM31)对LPS诱导PC12细胞炎症性损伤的保护作用和机制。方法:用不同浓度LPS处理PC12细胞24 h,MTT法检测细胞增殖活性,Western blot检测LPS最佳浓度处理后PC12细胞TRIM蛋白表达水平。将TRIM31过表达质粒(pcDNA3.1-TRIM31)及其阴性对照质粒(pcDNA3.1-NC)转染至PC12细胞,qRT-PCR和Western blot检测细胞TRIM31 mRNA和蛋白表达水平。PC12细胞分为对照组(Control)、LPS组、LPS+NC组和LPS+TRIM31组,分组干预后,ELISA检测细胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光检测NLRP3蛋白表达,qRT-PCR检测NLRP3、caspase-1 mRNA表达,Western blot检测NLRP3、caspase-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果:LPS剂量增加,PC12细胞增殖活性逐渐降低(P0.05),LPS处理可降低PC12细胞TRIM31蛋白表达水平(P0.01),TRIM31过表达,PC12细胞TRIM31 mRNA和蛋白表达水平显著提高(P0.05)。与Control组相比,LPS组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量、细胞凋亡率及细胞Cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平显著提高(P0.05),Bcl-2和TRIM31蛋白水平显著降低(P0.05),NLRP3蛋白荧光强度及NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达水平显著提高(P0.05);与LPS组相比,LPS+TRIM31组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量、细胞凋亡率及细胞Cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平显著降低(P0.05),Bcl-2蛋白水平显著提高(P0.05),NLRP3荧光强度及NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05)。结论:过表达TRIM31能通过抑制NLRP3炎症小体活化,改善LPS诱导的PC12细胞炎症损伤。     

TRPC6介导的钙离子紊乱通过激活STAT3促进肾小管上皮细胞损伤后炎症反应及肾间质纤维化

目的:采用动物及细胞实验探讨肾小管上皮细胞(TECs)中瞬时受体电位阳离子通道C亚族成员6(TRPC6)介导的钙离子(Ca~(2+))紊乱对肾脏纤维化过程中炎症反应及细胞外基质合成的影响及机制。方法:(1)在体实验:建立小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型,分为假手术组及UUO模型组,分别向两组小鼠腹腔注射TRPC6抑制剂BTP2或溶媒,在手术后14 d取肾组织留检。通过激光共聚焦检测TECs内Ca~(2+)浓度;通过HE染色及Masson染色检测肾组织病理改变;Western blot法检测TRPC6、纤维化相关蛋白I型胶原(COL1)、信号转导及转录激活因子3(STAT3)及p-STAT3的表达水平;real-time PCR法检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。(2)体外实验:应用TGF-β刺激人肾脏近曲小管上皮细胞株HK-2,向HK-2细胞转染TRPC6质粒或TRPC6 siRNA,Western blot法检测TRPC6、COL1、STAT3及p-STAT3的表达水平;real-time PCR法检测炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA水平。结果:(1)UUO模型中,TECs内Ca~(2+)浓度较假手术组显著升高;腹腔注射BTP2可减轻肾小管损伤及肾脏炎症细胞浸润,显著降低肾组织炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA水平,降低肾组织COL1及p-STAT3蛋白水平(P0.05)。(2)体外实验中,TGF-β刺激下,HK-2细胞中炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA水平和COL1表达增多,高表达TRPC6进一步增加炎症因子及COL1的表达,沉默TRPC6则降低炎症因子及COL1的表达(P0.05)。结论:在UUO模型及体外培养的TECs实验中,TRPC6介导的Ca~(2+)紊乱通过促进STAT3磷酸化,加重肾脏炎症反应及肾间质纤维化水平。     

Notch1在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的表达和意义

目的:探讨Notch1蛋白及其mRNA在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化(KTECT)中的动态表达及意义.方法:以体外培养的人近端肾小管上皮细胞株( HK-2)为研究对象,实验分为空白对照组及TGF-β1( 10 ng/mL)诱导组.加入TGF-β1作用后分别于12 h、24h、48 h及72 h在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化;用细胞免疫组化染色法检测α-平滑肌肌动蛋白( α-SMA)、E-钙黏连素(E-cadherin)和Notch1蛋白表达的变化;用RT-PCR法检测α-SMA mRNA、Ecadherin mRNA和Notch1 mRNA表达的变化.结果:与空白对照组相比较,在加入TGF-β1作用后12 h、24h、48 h及72h,TGF-β1诱导组α-SMA蛋白及其mRNA表达明显增加(P＜0 05);Notch1蛋白及其mRNA在TGF-β1作用后的24h、48h、72 h表达逐渐增加(P＜0.05);E-cadherin蛋白及其mRNA表达在24h、48 h、72 h明显减少(P＜0.05);Notch1蛋白及其mRNA的表达与E-cadherin蛋白及其mRNA的表达呈负相关(r蛋白=-0.937;rmRNA=-0.921;假设检验结果(P＜0.05),与α-SMA蛋白及其mRNA的表达呈正相关(r蛋白=0.958;rmRNA=0.944;假设检验结果(P＜0.05).结论:Notch1极有可能参与了TGF-β1诱导的KTECT.     

Caveolin-1在TGF-β1诱导人支气管上皮细胞间质化中的作用

目的:探究小窝蛋白1(caveolin-1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人支气管上皮细胞(16HBE细胞)上皮-间充质转化(EMT)中的作用。方法:以16HBE细胞株为研究对象,免疫荧光、RT-q PCR和Western blot实验检测16HBE细胞EMT过程中caveolin-1的mRNA和蛋白表达;Western blot检测siRNA干扰caveolin-1对16HBE细胞EMT的影响。结果:Caveolin-1广泛存在于16HBE细胞膜上,TGF-β1刺激后,caveolin-1的mRNA和蛋白表达减少(P0.05)。与TGF-β1组比较,caveolin-1 siRNA和TGF-β1共同作用促进了细胞形态的转化,抑制了E-钙黏蛋白的蛋白表达而促进了α-SMA的蛋白表达(P0.05)。TGF-β1刺激16HBE细胞后,AKT和Smad3在30 min磷酸化水平最高,与0 min对照组比较显著增加(P0.05);用siRNA干扰caveolin-1基因后再用TGF-β1刺激16HBE细胞30 min,下游信号蛋白分子AKT和Smad3的磷酸化水平增高,与TGF-β1组比较显著增加(P0.05)。结论:TGF-β1能下调16HBE细胞的caveolin-1表达水平;caveolin-1可能参与了TGF-β1诱导的16HBE细胞EMT过程中TGF-β1/Smad通路和PI3K-AKT通路的活化。     

黄芪主要成分对TGF-β1 诱导大鼠睾丸Leydig细胞系合成雌二醇的影响

目的探讨黄芪主要成分对TGF-β1诱导下大鼠睾丸Leydig细胞及该细胞合成雌二醇(E_2)、P450芳香化酶(P450arom)的影响。方法将体外培养的Leydig细胞分为对照组、模型组(5 ng/mL TGF-β1造模)和中药干预3组,在造模后分别用终浓度为10和50 mg/L黄芪总黄酮、终浓度为10和50 mg/L黄芪总多糖、终浓度20和100 mg/L的黄芪总皂苷干预。48 h后进行细胞爬片,用ELISA检测细胞中E_2、P450arom蛋白含量;Imagej-win64软件计数细胞;用SPSS 20.0、GraphPad Prism 6.0对数据进行统计分析。结果模型组Leydig细胞和对照组相比,形态异常,数量减少(P0.01);明显抑制Leydig细胞合成E_2和P450arom(P0.05)。黄芪总黄酮、黄芪总皂苷和黄芪总多糖均能够改善TGF-β1诱导下Leydig细胞病变,细胞数量明显增多(P0.01),三者均能缓解TGF-β1抑制细胞合成E_2的作用,20 mg/L黄芪总皂苷的效果最显著。结论黄芪总皂苷是黄芪中减轻TGF-β1抑制睾丸Leydig细胞合成E_2作用效果最佳的成分。     

瞬时受体电位通道C亚族和炎症在高盐饮食致左心室纤维化中的作用

 目的：研究瞬时受体电位通道C亚族（TRPCs）和炎症在高盐饮食致左心室纤维化中的作用及替米沙坦的干预效应。方法：雄性 Wistar大鼠随机分为正常盐对照组(C组,n=13)、8%高盐组（HS组,n=24）和8%高盐+替米沙坦干预组(T组,n=12),每2周测量尾动脉压1次,喂养共24周。Masson染色和HE染色观察左心室纤维化及炎症反应。通过 real-time PCR或Western blotting法检测左心室TRPC1、TRPC3、TRPC6、钙调神经磷酸酶(CaN)、核因子κB p65（NF-κB p65）、转化生长因子 β1（TGF-β1）、白细胞介素 1β（IL-1β）、血管细胞黏附分子 1（VCAM-1）、细胞间黏附分子 1（ICAM-1）和单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1） mRNA或相关蛋白表达。结果：与C组相比,HS组大鼠左室重量指数和胶原容积分数显著增加(P<0.05),TRPC1、TRPC3、TRPC6、CaN和NF-κB p65 mRNA或蛋白表达上升(P<0.05),HS组左心室有炎症细胞浸润,并伴随促炎症细胞因子TGF-β1、IL-1β、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1 mRNA或蛋白表达的增高(P<0.05);经替米沙坦干预后,LVMI和CVF减小(P<0.05),TRPC1、TRPC3、TRPC6、NF-κB p65、TGF-β1、ICAM-1和MCP-1的mRNA或蛋白表达减少(P<0.05)。结论：局部组织炎症可能参与高盐诱导Wistar大鼠左心室纤维化的发生机制,炎症激活可能与TRPCs和NF-κB表达上调有关;替米沙坦可通过影响TRPCs和NF-κB表达,改善左心室的炎症及纤维化。